CN116079706A - 高通量单细胞dna测序的纳米机器人系统 - Google Patents

Abstract

用于对放置在载玻片上的DNA链进行单细胞DNA测序的纳米级机器人系统，该系统利用原子力显微镜(AFM)，其末端执行器为带尖端的悬臂形式。AFM使其悬臂尖端扫描DNA链的碱基对。尖端的一对间隔开的电极与DNA链的两端接触，DNA链碱基之间的电流由连接到电极的电流测量系统测量。基于人工智能的数据分析系统基于来自电流测量系统的电流确定DNA序列。通过比较压缩的期望强度局部扫描图像和压缩的实际强度局部扫描图像并利用该差值来控制尖端的位置，从而将AFM尖端引导到DNA链上。

Description

高通量单细胞DNA测序的纳米机器人系统

技术领域

本发明涉及DNA测序，特别是使用基于原子力显微镜(AFM)的纳米机器人系统和人工智能进行高通量单细胞DNA测序。

背景技术

DNA测序已经成为许多领域的关键技术，这些领域包括生物学、医学和人类学[JS2017]。特别地，单细胞DNA测序是新的诊断方法、个人医学和组织工程的基础。DNA测序技术的发展对剖析生物过程的基本机制起着至关重要的作用。伴随着确定在单细胞水平上控制细胞行为的分子机制的需要，高通量单细胞测序技术的发展的进展已显示出可以在短时间内获得数千个单细胞的基因组或转录组的核信息。这打开了单细胞识别、处理和联系的黑箱。例如，高通量单细胞测序应用于胚胎发育、干细胞生物学、癌症、疾病进展等。高通量单细胞测序作为对亚群和细胞状态变化的全面记录，可以深入了解分子机制和事件的顺序。高通量单细胞测序技术在干细胞生物学中的应用取得了巨大的进展，特别是在干细胞分化、细胞再生、重编程和胚胎发育方面。

DNA测序技术的发展经历了40多年的历史，包括电泳方法(第一代，例如Sanger测序方法)、大规模并行方法(第二代，例如Illumina的Hi-Seq基因组测序仪)，以及正在进行的实时、长可读性的方法(第三代，例如Oxford基于纳米孔的测序仪)。DNA测序技术的每一次突破都为新的诊断和治疗的发展带来了重大的技术飞跃，并产生了显著的社会和经济影响。

第一代和第二代DNA测序技术主要基于聚合酶链式反应(PCR)方法以通过化学方法产生大量目标DNA片段的复制从而实现碱基对的并行识别。碱基对检测精度达到99.9％以上。近年来，基于PCR的DNA测序方法的衍生物(例如双链测序协议)已发展为进一步提高测序精度。目前市场上的产品包括瓶颈测序系统(Bot SeqS)[ML2016]和纳米速率测序(NanoSeq)[FA2021]。

然而，基于PCR的DNA测序方法通常成本高、耗时长并且需要大量样本[SJ2020]。此外，他们只能对碱基对(几百个)的短读进行测序[PP2018、MT2019]，并依靠后期处理将短链序列拼接起来。此外，PCR测序难以进行单细胞测序，单细胞测序需要从死亡细胞中提取可用的单细胞，这可能导致一些罕见细胞亚群的关键信息的丢失[TL2016][SW2019][LC2020]。

为了克服这些问题，第三代DNA测序技术正在出现。其中，最普遍的代表技术是基于纳米孔的方法[PP2018、MT2019、RR2019]。他们利用天然或合成的纳米孔或间隙以让单个DNA链通过，同时记录孔或间隙内部分的电信号变化以用于DNA碱基解码。因此，例如直接来自细胞的链的长DNA链可以在没有PCR扩增的情况下进行测序。与第一代和第二代测序技术相比，样品制备相对简单并且测序成本较低。目前，市面上的Oxford Nanopore的基于纳米孔测序技术是基于生物纳米孔，其利用跨膜蛋白，该跨膜蛋白具有吸引通过其离子通道的小带电粒子的天然能力[JS2017,MT2019,CG2016]。生物纳米孔被插入浸泡在电解质溶液中的合成聚合物膜中。由于膜通常表现出相当高的电阻，只有当对膜应用合适的电势时，离子才通过纳米孔。当单个DNA链进入纳米孔时，它会在离子流中引起独特的破坏，被称为“电导的变化”。这种现象主要是由于腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)这四种碱基显示出不同的静电势[TO2006,LA2015,TO2012]。此外，一些研究人员还认为，不同碱基的电导与它们的几何性质有关，而与电子特性无关[XG2006]。

生物纳米孔通常具有自然和固定的几何尺寸和不稳定的形态。它们对环境敏感并且难以工程化/集成到设备中。多年来，基于固态纳米孔/纳米隙的技术[PP2018]也被考虑和尝试。它们具有高鲁棒性，对环境条件的低敏感性，以及较好的孔隙尺寸调节能力和阵列中集成能力[JL2001,FT2013]。然而，由于制造技术的限制，仍然难以制造出具有市场可接受成本和效益的固态纳米孔。

生物纳米孔测序技术通常面临几个导致测量误差的主要挑战:首先，DNA链通过纳米孔的速度相对较高(约0.5cm/s)[PP2018]并且无法控制。这经常导致丢失碱基和测量噪声。此外，当进行测量时DNA是在液体中。这使得电测量更困难。此外，DNA链只能通过纳米孔一次，测量不能重复。因此，不能采用基于统计和人工智能的方法来提高测量精度。

此外，基于扫描探针显微镜(SPM)的方法也被应用于DNA测序。但由于SPM运动控制精度的限制，难以将探针精确地定位在DNA碱基上。运动控制需要亚纳米级的精度，这在过去是不可能实现的。此外，可用的纳米制造技术的局限性使得无法在SPM探针上制造DNA测序所需的纳米结构。

目前的一位发明者和他的团队已经致力于开发和实现基于原子力显微镜(AFM)的纳米机器人超过20年[XN2011]。这包括例如在线可视化[XN2013]、提高纳米操作效率[LG2014,LG2015]、加快扫描速度[SB2014]以及提高任务空间中的AFM定位精度[XN2013]等基础技术的发展。此外，基于AFM的纳米机器人已成功应用于制造基于CNT的红外传感器[FC2009,CH2010]和生物医学研究[YR2015]。

然而，目前市场上可用的AFM运动控制依赖于位置传感器。由于系统漂移和探针变形，以这样系统无法直接测量亚纳米级的尖端位置。此外，获取位置所需的视觉跟踪方法在向量空间中会引起误差。因此，需要从图像中提取特征来确定和纠正误差。如果图像的特征不明确，这个过程是耗时的。

虽然提出了无特征方法，但仍然存在两个关键问题。首先，由于问题仍然是在向量空间中表述的，这些方法需要复杂的标定过程，当要求高精度时，例如纳米级的运动控制，该标定过程是极其难以进行的。其次，所有的无特征方法都需要整个图像成功的反馈控制，这对于传感器反馈较慢的系统是耗时的，例如AFM只能通过逐像素扫描获取图像。因此，挑战是开发新的基于AFM图像的运动控制方法以实现亚纳米运动精度。

发明内容

本发明的纳米机器人系统基于纳米机器人运动控制、纳米制造和基于人工智能的数据分析的最新突破，克服了第三代DNA测序技术的困难。因此，本发明的机器人系统能够在不需要液体环境、可控测量速度和多次测量的情况下实现亚纳米级的位置测量。因此，测量精度显著提高并且测序成本降低了多成。单细胞测序更快更方便。

本发明的系统包括基于原子力显微镜(AFM)的纳米机器人机械手、高精度隧道电流测量系统、纳米机器人末端执行器和基于人工智能(AI)的数据分析系统。机器人的运动由新的语义压缩反馈控制系统控制，该系统能够达到亚纳米级的运动跟踪精度。纳米机器人机械手装备有末端执行器，该末端执行器可以测量两个碱基之间的电流。将单链DNA分子固定在载玻片或基板(例如云母)上，纳米机器人将末端执行器沿DNA分子移动并且测量两个碱基接触点之间的电流。通过新的生成对抗三模型(Generative Adversarial Tri-model，GAT)机器学习方案对测量数据进行分析以获得DNA序列。测量可以重复多次直到获得充足的测量数据以达到所需的结果的置信度。

新开发的语义压缩运动控制通过消除特征提取、用于建立坐标变换的系统标定以及图像处理和模式识别的高计算需求克服了传统基于图像控制的主要问题。此外，该系统使用非向量空间控制方法。考虑局部扫描图像作为集合，在局部扫描图像集合的空间中表述运动控制问题，而不是传统的向量空间中。这样，就可以使用图像中所有的强度信息进行控制。因此，不需要进行特征提取。由于问题是在集合空间中表述的，因此不需要复杂的标定过程。其次，非向量空间控制也可以与压缩反馈(即例如压缩图像的压缩信息的反馈)一同使用。因此，采样时间和计算时间都可以显著缩短，而且系统的反馈速度更快，这对于高精度的运动控制是至关重要的。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩图。具有彩图的本专利或专利申请出版物的副本将在要求和支付必要的费用后由专利局提供。

当结合以下详细说明和附图考虑时，本发明的上述和其他目的和优点将变得更加明显，在下列详细说明和附图中，相似的附图标记表示不同视图中的相似元素，其中:

图1是根据本发明的基于原子力显微镜(AFM)的用于DNA测序的纳米机器人系统；

图2是根据本发明的基于非向量空间运动控制的局部扫描控制；

图3是基于压缩局部扫描图像的非向量空间运动控制；

图4是根据本发明的基于AFM的具有语义压缩反馈的纳米机器人系统的实施例；

图5说明了利用图4的实施例的纳米机器人末端执行器跟踪DNA链的实验结果，其中图5A显示了DNA链上的机器人末端执行器，图5B显示了DNA链跟踪误差；

图6A说明了AFM悬臂的结构，图6B说明了亚10纳米分离电极和AFM悬臂的目标参数；

图7是一系列图像，显示了制造亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂样机的步骤顺序。

图8显示了图7的制造的初步结果的图像，其中图8A显示了使用EBID在AFM悬臂尖端焊接碳纳米管，图8B显示了在聚苯乙烯二聚体上指状物的形成，图8C显示了4×4阵列中的大长宽比(>20)纳米线，图8D说明了用于在涂有金膜的Si+SiO₂基板上制造直径为100nm的基盘阵列的FIB、基盘阵列之间间距为500nm并具有宽为50nm的片上引线，图8E显示了：使用如图7所示的过程成功实现的平面AFM悬臂尖端，使用聚焦离子束化学气相沉积(FIBCVD)的步骤1-3和切割，图8F显示了在平面之间桥接的纳米管，并用TEM的电子束进行切割，图8G显示了已经实现7.6nm的初始间隙；

图9是亚10纳米间隙的双尖AFM悬臂设计示意图；

图10说明了亚10纳米间隙的双尖AFM悬臂的制造过程的步骤。

图11A是五聚体盘光学天线阵列的图像，图11B是图11A带有间隙尺寸的放大图，图11C是盘的进一步放大视图:图11D显示了具有亚10纳米间隙的特殊工艺的光学天线，图11E说明了其上具有光学天线的悬臂芯片，图11F显示了说明激光冲压的一系列图像；

图12是基于应变工程的亚10纳米间隙的双尖AFM悬臂设计的系列示意图；

图13显示了基于应变工程的亚10纳米间隙的双尖AFM悬臂的制造过程的系列步骤。

图14A至图14I显示了螺旋结构的卷曲设计，图14J至图14K显示了可以作为悬臂的双稳态卷曲爪；

图15是纳米机器人末端执行器制造；

图16是使用纳米机器人的实际测量场景；

图17是DNA链的等效电池链模型；

图18是电极和DNA链之间的点接触近似；

图19是DNA链的起始和末端的T核碱基的连接；

图20是基于测量值的关于DNA序列的理想方程；

图21是纳米机器人运动误差的示意图；

图22是具有β噪声的实际测量矩阵；

图23是基于噪声测量的关于DNA序列的实际方程；

图24是用于求解超定方程的神经网络结构；

图25是DNA迭代测序框架流程图；

图26是纯高斯接触噪声下的DNA测序精度图；

图27是来自纳米机器人运动的纯β运动误差下的DNA测序精度图；

图28是关节接触噪声和运动误差下的DNA测序精度图；

图29是生成对抗三模型(GAT)模型的示意图；

图30是GAT模型中使用的神经网络结构示意图(左)和再现任意函数的方法说明(右)；和

图31是用于噪声校准的GAT模型示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明的系统包括基于原子力显微镜(AFM)的纳米机器人扫描仪或机械手12、位于AFM平台上方并由其移动的纳米机器人末端执行器14、高精度隧道电流测量系统16和基于人工智能的数据分析系统18。AFM系统包括原子力显微镜，其提供各种类型满足科学家和工程师需要的表面测量。它是强大的，因为AFM可以用最少的样品制备生成具有埃(angstrom)级分辨率高度信息的原子分辨率图像。AFM使用具有非常锋利的尖端17的悬臂形式的末端执行器来扫描样品表面。当尖端接近表面时，表面和尖端之间的近距离引力导致悬臂向表面偏转。然而，当悬臂更接近表面时，使得尖端与它接触，越来越大的斥力起主要作用并导致悬臂远离表面偏转。

激光器13发出的激光束用于探测悬臂向表面或远离表面的偏转。通过反射离开悬臂平顶的入射束，任何的悬臂偏转都将引起反射束方向的轻微变化。位置敏感光电二极管(PSPD)15可以接收反射光束，其可以用来跟踪悬臂偏转(Z轴)的变化。因此，如果AFM尖端经过凸起的表面特征，产生的悬臂偏转(以及随后反射束方向的变化)可以被PSPD记录下来。

AFM通过扫描感兴趣区域(X轴和Y轴)上的悬臂来对样品表面的形貌进行成像。样品表面的升降特征影响悬臂的偏转，该偏转由PSPD监测。通过使用通过探测器电子器件11和控制器电子器件19的反馈循环，可以控制尖端在表面上的高度——从而保持恒定的激光位置——AFM可以生成精确的表面特征形貌图。

在本发明中，机器人运动控制是新型的语义压缩反馈控制系统。语义压缩是借以对信息(例如感知数据)的表示进行压缩/简化的过程，即基于语义内容(即信息的含义)减少表示信息的数据量。语义反馈控制是将语义压缩的感知数据代替原始的感知数据进行反馈。

本发明的语义压缩反馈控制不仅在垂直方向上具有亚纳米级的运动跟踪精度，而且能够扫描显微镜样品平台21上的DNA样品链20。末端执行器16可以测量DNA链碱基之间的电流。单链DNA分子20固定在样品平台的基板上，例如云母。纳米机器人或扫描仪12沿着DNA分子移动末端执行器，并测量DNA分子两侧两个接触点之间的电流。通过分析系统18的新的生成对抗三模型(GAT)机器学习方案对测量数据进行分析以获得DNA序列。

需要注意的是，测量无需在液体环境下进行，可以对纳米机器人机械手的运动速度进行优化和控制以实现可靠的电流测量。更重要地，测量可以重复多次直到获得充足的测量数据以使测量结果达到所需的置信度。

通过本发明新开发的语义压缩运动控制实现沿DNA链的末端执行器的定位。这个运动控制系统通过消除特征提取、用于建立坐标变换的系统标定以及图像处理和图案识别的高计算需求，已成功克服了传统基于图像控制的主要问题。

为了解决现有技术的缺点，本发明依赖于新开发的非向量空间控制方法，如图2所示。考虑局部扫描图像作为集合，可以在局部扫描图像集合的空间中表述运动控制问题而不是传统的向量空间中。这样，就可以使用图像中所有的强度信息进行控制。因此，不需要进行特征提取。由于问题是在集合空间中表述的，因此不需要复杂的标定过程。其次，非向量空间控制也可以与压缩反馈(即例如压缩图像的压缩信息的反馈)一起使用。因此，采样和计算时间都可以显著减少。因此，该系统具有较快的反馈速率，这对高精度的运动控制至关重要。

压缩反馈下的非向量空间控制的总体示意图如图3所示。与完整的局部扫描图像反馈不同的是，局部扫描图像的目标和反馈都是压缩的。压缩反馈中的传感是新的信号采集范式。它不是直接对信号进行采样，而是以压缩形式对信号进行采样。然后系统依靠高级优化算法或贪婪算法来恢复原始信号[XN2007]。在AFM扫描过程中，使用压缩扫描模式，而不是传统的锯齿扫描，以获得压缩的局部扫描图像，局部扫描图像与全扫描相比，数据少得多并且执行速度快得多[XN2013][SB2014]，[LG2014][LG2015]。此外，在局部扫描图像中，通常可以获得图像内容的先验知识，例如待测量的DNA链。已经开发语义压缩传感以利用内容的知识来改进采样[LC2017][LC2018]。

基于压缩反馈的非向量空间控制方法如图3所示。术语“非向量空间”是指控制不在传统的向量空间而是在集合空间中执行。赵等，“基于压缩反馈的无矢量空间控制”，美国控制会议(2012年6月)(Zhao et al.,“Compressive feedback based non-vector spacecontrol,”American Control Conference(June 2012).)考虑压缩的实际局部扫描图像30的初始集合和目标或期望集合32，设计稳定的非向量空间控制器34以使集合动态收敛于目标集合。实际压缩图像30与期望或目标图像32之间的差异在减法器或比较器33中确定。这个差异信号被应用到控制器34上，控制器反过来驱动基于AFM的机器人35，因此由于反馈循环，实际的局部图像与目标图像接近一致。由于压缩反馈，即使只有部分反馈集合的元素可用，控制器也能工作；也就是说，相同的控制器仍然可以利用压缩反馈稳定目标集合周围的集合动态。通过将图像视为集合，该控制器应用于视觉伺服(基于视觉的机器人控制)。这样就不需要用于特征提取的图像处理，而这是传统伺服方法中必不可少的过程。此外，压缩反馈可以减小反馈图像的尺寸。当采样过程耗时，例如使用原子力显微镜(AFM)成像时，这是重要的。控制器的视觉伺服表征进一步应用于纳米操作中的运动控制。仿真结果表明控制器具有良好的性能。提出的框架可以扩展到其中信号可以表示为集合的其他系统。

受神经科学最新进展的启发，在灵长类动物的大脑中，物体的识别在颞下皮层中表现出来并且对不同转换是不变的，该不同转换不影响物体的识别[BS2004]。最近，Chang等人[CL2017]提出了轴模型来研究灵长类动物如何编码和解码面部特性。他们发现，在灵长类动物的大脑中，人类的脸由非常简单的神经编码表示，这些编码与面部空间中沿特定轴上的面部内容相对应。面部图像可以通过大约200个细胞的响应线性恢复，不同的细胞携带互补的面部信息用于重建。

基于[CL2017]中的轴模型，在灵长类动物的大脑中，同类的物体具有相似甚至相同的特征，物体的图像通过许多与内容相关的轴线性表达。例如，不同人的脸具有共同的视觉结构，即眼睛、嘴和鼻子，它们的相对位置是相似的。因此，图像可以用一些共同的高级部分来合理地表示[MN2015]。这是语义压缩的基础。

对于AFM运动中的局部图像，存在特定的共同语义内容。这个事实导致了图像的低秩表示[LC2017]，因此，在压缩采样过程中提取并强调共同的语义内容。语义压缩扫描方法利用从一组DNA链图像学习到的传感矩阵。传感矩阵训练过程可以通过各种方法进行，例如流行的深度学习策略[LC2017]。为了实现DNA链的局部扫描AFM图像的高效低秩表示，使用非负矩阵因子分解(NMF)[LC2018]表示来学习DNA链的AFM图像的语义内容。

通过应用语义压缩反馈，实现了利用AFM局部扫描图像的高速反馈控制。它使纳米机器人末端执行器能够实现用于测量的DNA链的高精度跟踪。本发明人在基于AFM的纳米机器人系统中实现并实验测试了语义压缩反馈控制，如图4所示。如图5所示的实验结果表明，实现了对DNA链亚纳米级精度的跟踪。这为使用纳米机器人系统用于DNA测序奠定了基础。

图4A和图4B是与图3等效的硬件和框图/图像。如图3所示，在现有技术中，尖端沿DNA链的定位是在向量空间中完成的，即基于尖端在X,Y,Z坐标中的位置。然而本发明所需的距离对此而言太小以至于无效。相反，本发明采用了使用非向量空间的新技术。通过这种新的控制过程，只形成了靠近尖端的局部区域的图像。因此与利用整个图像的系统相比，数据量大幅减少。然后对该局部图像进行语义压缩以进一步减少数据量。从重复的先前扫描中还形成了该链局部部分的语义压缩所需图像。然后将实际的局部压缩图像与期望的或理想的局部压缩图像进行比较，该差异即为反馈给AFM的控制误差信号以控制尖端运动到压缩的理想局部图像所表示的期望位置。通过使用图像比较，不需要使用向量空间坐标。通过使用局部图像，大幅减少了数据量和处理它所需的时间。此外，通过对局部图像(包括实际局部图像和预期局部图像)使用语义压缩，可以进一步减少数据量。

在图4A的布置中，AFM包括探针43、显微镜平台44、其控制器49和处理器48。信号访问模块(SAM)46提供对AFM控制器49中的信号的访问，例如执行器上的电压、来自光探测器的激光偏转信号等，并且也允许命令发送到控制器49和显微镜平台44。设备45是具有数模转换器的I/O或接口板。尖端或探针运动控制系统包括控制系统40、触觉操纵杆41和存储在纳米机器人PC 42中的程序。系统40是系统的软件接口，其具有用于图像、系统信息和诊断问题能力的显示器。正如以太网线所示，这些处理器可以共享信息彼此并行工作。也有可能在PC48中运行PC42的功能，PC48是AFM供应商提供的处理器。

所需要的(目标)局部扫描图像是由在先前扫描中获得的DNA的AFM局部图像创建的。这些图像存储在纳米机器人PC42中。图像从I/O设备45通过纳米机器人PC42传到控制系统40。

当探针43在操纵杆41的控制下或通过自主扫描的方式在基板上的DNA链上移动时，AFM 44拍摄实际的局部图像。这些图像通过SAM46和D/A转换器45可被纳米机器人PC42访问。在该处理器中图像被语义压缩。纳米机器人PC42和AFM PC48将之前存储在该处理器42中的语义压缩期望图像与实际局部压缩图像进行比较。处理器42通过转换器45和SAM 46将差异信号发送回控制器49(其是非向量空间控制器34')以纠正运动误差。

控制系统40和/或操纵杆41构成图4B的运动规划器32'。理想图像31'在规划器32'中被压缩以形成压缩图像37'。它的局部部分38'传递给比较器33'。实际的局部压缩图像来自AFM35'，其压缩的局部部分39'也传递给比较器33'。比较(误差)36'的结果传达给非向量空间控制器34"。控制器34'的输出应用于AFM35'的运动控制以改变反馈循环中探针的位置，该反馈循环稳定其沿DNA链的位置。

为了进行本发明，需要在其锥体/锥体尖端上制造具有双圆柱形纳米电极的AFM悬臂，如图6所示。圆柱形金属尖端被指定为具有亚10纳米的间隔，50nm或更小的直径和45nm的高度。这些尖端是通过开发和优化以下三个技术实现的:(1)使用聚焦离子束化学气相沉积(FIB-CVD)的样机、电子束诱导沉积(EBID)和使用透射电子显微镜(TEM)的束流的电子束切割；(2)使用电子束光刻(EBL)、激光冲压和化学蚀刻批量制造；以及(3)面向批量制造的替代方法和批量制造的风险缓解计划，称为“预应力薄膜应变工程”。

基于金属层涂层、FIB化学气相沉积(FIB-CVD)、EBID和TEM内部电子束切割的亚10纳米间隙双尖端AFM悬臂的原位样机如图7示例性所示。流程如下:

步骤1首先在市面上的AFM悬臂的两侧(顶部和底部)预先涂覆金属(金)层，用FIB切割悬臂及其支撑基座以形成宽度分别约为2μm至5μm和20μm至50μm的微电极和引线。在AFM悬臂没有金属涂层的情况下，Au层溅射在两侧。

步骤2锥体或锥形尖端可以有或可以没有预涂金属层。对于前一种情况，将使用FIB将预涂层分离为两部分，反之，将使用FIBCVD在侧表面直写电极，其中线宽约为1μm并且厚度约为50至100nm。

步骤3使用FIB将锥体或锥形尖端磨掉以形成两个边长为1μm至3μm的小平面。如图7所示，优选空心锥体或锥形。这为电子的通过留下了空间，如步骤6所述。

步骤4FIBCVD或EBID应用于从之前步骤生成的平面形成纳米尖端。前体为FIBCVD的Pt或EBID的CpPt Me₃。两侧向内侧倾斜的形成方向为30°。圆柱形纳米尖端的直径在30至50nm之间并且长度在1至3μm之间。

步骤5使用与步骤4相同的方法，在圆柱形尖端的顶部形成横向桥。

步骤6然后使用聚焦的高能量(200keV至300keV)电子束在圆柱形纳米尖端之间生成亚10纳米的间隙，即通过将桥在中心切割成两部分。为了实现亚10纳米的高精度间隙，使用了共聚焦扫描透射电子显微镜(CsTEM)。在类似尺寸的纳米线上的尝试表明，成功的关键是内应力的控制，内应力可以是由步骤4和5的制造过程或步骤6的电极轰击造成的。

虽然其他涉及FIB和EBID的步骤都已被本发明者中的一位和他的团队如图8A至8C所示地[DL2002][DL2004][DL2007]常规使用了20年，以及被世界上其他研究实验室[MS2000][KR2004]常规使用了20年，但步骤6是创建这个结构的主要挑战。然而，使用如图7所示的用于前三步骤的FIBCVD和切割，以及如图8D所示的具有扁平尖端的预制AFM悬臂，步骤6已成功地实现。然后在平面之间架起碳纳米管并用TEM的电子束切割(图8F)。初始间隙达到了7.6nm，这是令人鼓舞的并显示了所提出的步骤6的可行性。然而间隙不能保持在10nm范围内，5min之后间隙增大(29.4nm)。这是由于装配过程和切割过程中电子束轰击引起的内应力造成的。为了避免这种情况，在步骤5和步骤6之间添加了退火过程。由于它是由电子束轰击引起的，膨胀背后的物理是复杂的。为了避免充电效应，在步骤6之前缩短电极或在步骤6之后切断电极而不是在步骤3中。无论如何，该方法的可行性和可扩展性都不比2015年已成功上市的基于纳米孔的方法[GS2010][HS2016][WA2018]差。

已注意到这个样机制造过程是一个耗时的过程，单个悬臂通常需要5-7小时。为了缩短时间，桥(步骤5)被制造得尽可能薄。对于概念的证明、新设计或新参数的论证，或小批量制造，这种方法是简单和灵活地形成悬臂的有效和高效的方式。此外，基于FIBCVD的电极直写也是基于EBL方法的不可替代的过程。

使用EBL图案形成和激光冲压间隙缩小可以实现中等批量制造亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂。如图9所示，亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的设计与常规的有两个方面的不同:两个直径约为50nm的导电纳米尖端，以及对间隔(亚10纳米)的要求非常具有挑战性。为了实现它，常规使用的常规AFM探针的制造工艺与两个特别设计的工艺相结合:(1)制造50纳米圆柱形尖端和(2)间隙的缩小。此外，基于FIBCVD的方法适用于纳米电极刻写。如图10所示，制备工艺如下:

步骤1绝缘层制备。等离子体增强化学气相沉积(PECVD)用于形成50nm厚的二氧化硅(SiO₂)薄膜。由于硅晶圆是掺杂半导体，直接在硅晶圆上制造电极和天线可能会导致设备短路，因此引入绝缘层将电极和导电尖端与Si基板隔离开。由于SiO2具有良好的耐腐蚀性，它也被用作湿法蚀刻的掩模材料。

步骤2-4尖端制造。通过使用EBL系统以在旋涂光刻胶上对尖端图案化，制备了几个50nm、最小间隙约为15nm的交叉圆柱形尖端。然后使用45nm厚的Au电子束蒸发将该图案显影。

步骤5使用激光冲压缩小尖端间隙。这是新设计的技术(如图11E和11F所示)，用于通过使用ns YAG激光从顶部压制制备好的金属盘来实现更小的圆柱形尖端之间的间隙。为实现这一点使用了三层材料，包括4μm厚的铝层作为压缩器，石墨层作为烧蚀涂层，CaF₂/ZeSe玻璃层用于透明约束。

步骤6-10支撑基座和悬臂的制造。预设计图案的光刻掩模与紫外线照射一起使用，用于支撑基座和悬臂的轮廓的顶部和底部侧面图案化，该图案化是使用光刻胶的旋涂，显影和使用电感耦合等离子体(ICP)的SiO₂层的干法蚀刻实现的。Si湿法蚀刻的结果窗口是通过使用KOH溶液实现的。在蚀刻之后形成锥形尖端，同时悬臂保持比最终尺寸更大的厚度。

步骤11-15在支撑基座上制造引出电极和在悬臂上制造微电极。在顶部表面使用PECVD形成50nm厚的SiO₂层作为绝缘层，以用于在支撑基座上制造引出电极和在悬臂上制造微电极。然后使用基于紫外线照射的ICP干法蚀刻并在旋涂光刻胶层上显影选择性地去除尖端顶部的SiO₂。然后，用电子束蒸发器沉积45nm厚的金膜作为电极。

步骤16使用FIBCVD将纳米尖端连接到悬臂上的微电极。FIBCVD用于直写将悬臂上的微电极和尖端连接的纳米电极。纳米电极遵循沿着锥体侧面和顶部表面的路径实现了三维电连接。

步骤17-18悬臂蚀刻的结束。为了完成探针的制造，使用缓冲氧化物蚀刻(BOE)将SiO₂蚀刻掉，然后使用KOH进行Si蚀刻。注意，前后两侧的牺牲层从顶侧和底侧都被蚀刻掉了，因此比只从底侧蚀刻的悬臂的区域更快。

通常情况下，375探针可以由单个4”的晶圆形成图案,其中单个3.4mmx1.6mm尺寸的探针用于支撑基座并且长度可达几百微米。然后，在将探针用于DNA测序之前测试其导电性/绝缘性。

本专利的发明人中的一位和他的团队已经致力于例如光天线的等离子体设备研究超过10年。这项工作展示了柱上球体[CX2010a]、匹配[CX2010b]和五聚体光学天线及其阵列[HC2018]。缩小纳米结构(例如图11A所示的盘)之间的间隔是提高这些设备性能的关键。在这项工作中，使用基于EBL的光刻技术实现了c.a.15nm的平均间隙(图11B)，这也是从市面上的设备获得的最佳解决方案。有时，通过倾斜样品平台或相互使用盘柱作为掩模来执行阴影光刻来实现亚10纳米的间隙(图11C)。然而，这种方法仍然缺乏完全的可控性。目前，GRF项目正在支持“用于生物医学微型机器人信号转导和能量收集的等离子体纳米传感器和天线”的研究(PI:LixinDong,Period:01Jan 21-31Dec 23)。该项目的目标之一是分子的等离子体探测器的设计、优化和制造。图11D显示了其上集成了光学天线的悬臂芯片。

名为“激光冲压/冲击”[GH2014][HY2016]的新开发工艺被用于尝试缩小纳米盘尖端之间的预制间隙。在该项目中，从EBL和电子束照射通常可获得具有15至20nm初始间隙的金属纳米盘，在此基础上使用激光冲压进一步将间隙缩小到亚10纳米的量级。先前报道的纳米盘已证明5纳米间隙的可行性(图11E和11F)。此外，激光冲压技术可以以批量制造的方式实现间隙缩小，这与其他批量制造AFM尖端的工艺非常兼容。

第二种方法(即基于EBL的图案形成、基于激光冲压的纳米间隙缩小和化学蚀刻)的可扩展性的关键瓶颈是该过程的单束性质，即电子束或聚焦离子束。尽管其余工艺与半导体行业现有技术中的主流技术相比具有可扩展性，但基于高能束的技术仍然面临着整个半导体行业共同面临的巨大挑战。虽然AFM悬臂制造的成本效益不高，但极紫外光刻(EUV)已经成为手机芯片制造的极好的替代品。随着2至7nm工艺的成熟，EUV工艺在制备具有亚10纳米间隙的AFM尖端的应用中非常有前途。

使用应变工程大规模批量制造亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂。图12显示了用于大批量制造的替代设计，其中三层金属-绝缘体-金属(MIM)夹层结构在基板平面上的预应力薄膜上形成图案，并在蚀刻后卷曲，在悬臂梁的末端形成垂直尖端。在这种设计中，绝缘体层的厚度决定了金属层的间隔，即尖端之间的间隙。

为了将纳米间隙电极结构与AFM探针相结合，设计方案依赖于基本的半导体制造工艺，该工艺利用标准的AFM探针制造工艺并将其与三维自卷曲制造工艺相结合。该设计使用自卷曲三维结构末端的横截面作为用于DNA测序的尖端。卷曲结构横截面上的纳米间隙主要依赖于原子层沉积(ALD)技术，该技术可以精确控制到亚纳米量级。此外，该设计方案充分考虑了与已建立的AFM探头制造工艺的兼容性，从而实现了可靠的批量生产。

该方法(图13)的制造过程如下:

步骤1绝缘层气相沉积使用PECVD在硅晶圆的两侧执行SiO₂气相沉积。

步骤2自卷曲台面的牺牲层的蒸发。使用20nm厚的铝膜层作为牺牲材料。铝层沉积然后在紫外线照射下形成图案。形成图案的薄膜用电子束蒸发然后再进行剥离工艺。

步骤3和4自卷曲台面层的蒸发和图案形成。自卷曲层是由PECVD获得的具有内在应力的Si_xN_y薄膜。厚度为30nm。然后使用紫外线光刻工艺设计照射掩模，使用ICP蚀刻技术实现台面制造。

步骤5底部电极制造。50nm厚的金底部电极经紫外线照射形成图案并且经电子束蒸发形成。

步骤6纳米间隙绝缘层的蒸发。使用ALD沉积技术获得了1nm的Al₂O₃膜。

步骤7纳米间隙绝缘层图案形成。使用光刻胶作为掩模，ICP蚀刻用于保留底部电极上方的Al₂O₃膜。

步骤8顶部电极制造。紫外线照射用于顶部电极图案形成，电子束气相沉积和剥离技术用于获得50nm的Au膜。

步骤9背面紫外线光刻技术

步骤9背面紫外线光刻技术。为了对背面Si进行预蚀刻，需要使用光刻胶以产生蚀刻窗口图案，因此使用背面夹套方法获得蚀刻窗口图案。

步骤10蚀刻窗口制造。SiO₂的ICP蚀刻用于使蚀刻材料Si暴露。

步骤11光刻胶的移除。使用丙酮去除蚀刻窗口光刻胶。

步骤12抗腐蚀保护层气相沉积。由于KOH溶液也可以作为自卷曲结构中牺牲层Al的蚀刻剂，因此有必要蒸发基板表面的抗蚀刻保护层。PECVD用于蒸发130nm的SiO₂保护层。

步骤13底部Si基板蚀刻。将基板置于室温下的KOH溶液中，以用于基板Si的蚀刻。由于需要保证微悬臂的厚度，因此需要严格控制KOH溶液蚀刻的时间以保证悬臂梁Si基板有足够的厚度。

步骤14-15紫外线照射和蚀刻顶部蚀刻窗口。为了将蚀刻窗口图案转移到基板顶部，使用紫外线光刻和ICP一起蚀刻130nm的SiO₂保护层。

步骤16光刻胶的移除

步骤16光刻胶的移除。使用丙酮去除蚀刻窗口光刻胶。

步骤17自卷曲释放窗口图案。紫外线照射用于获得自卷曲释放窗口图案。

步骤18自卷曲结构释放。NMD溶液用于蚀刻牺牲层Al以逐渐释放卷曲结构。

步骤19移除光刻胶。将具有自卷曲结构的样品置于丙酮溶液中以去除光刻胶。

步骤20Si蚀刻。KOH用于蚀刻硅基板。只有上下释放窗口相连点的Si才可以被蚀刻掉。

步骤21SiO₂保护层的移除。将样品置于BOE蚀刻溶液中以完全蚀刻暴露的SiO₂，然后将其置于水溶液中静止以获得具有自卷曲结构的AFM探针。

基于应变工程，基于一对形成三维结构[PV2000]的相反的力(F₁和F₂)，通过预应变的二维纳米厚异质外延双分子层由于卷曲(图14A)可以创建三维结构。本发明人已经成功地展示了各种具有纳米级特征的卷起的三维螺旋纳米结构的可控制造和表征，例如SiGe/Si管(图14B)，(直径在10nm至10μm之间)、Si/Cr环(图14C)[ZL2008](参见参考文献[SO2005]关于InGaAs/金属结构)、SiGe/Si线圈[ZL2005](图14D)、InGaAs/GaAs线圈[BD2006](图14E)、小螺距InGaAs/GaAs线圈(图14F)、Si/Cr爪(图14G)、Si/Cr螺旋[ZL2006a](图14H)，和小螺距SiGe/Si/Cr线圈[ZL2006b](图14I)。本发明者开发了特殊的工艺，例如卷曲/展开和缠绕/解缠绕用于操作各种卷起的三维螺旋纳米结构，例如SiGe/Si和InGaAs/GaAs管[BD2006]、线圈、环和螺旋，以及来自预应力双分子层的最小机器人游泳者(robotic swimmers)，例如用于在低雷诺数区域移动的SiGe/Si和InGaAs/GaAs，以及许多其他纳米系统[DL2006][DL2009]。

目前，GRF项目(11219419)正在支持“用于医疗微机器人制剂的记忆环境氧纳米传感器”(PI:Lixin Dong,Period:01Oct 19-30Sep 22)的研究，其目标之一是具有纳米电极对的微机器人制剂的应力工程。半卷曲结构具有包括如图14J和14K所示的水平和卷曲两种稳定状态，使得这种结构可以作为悬臂。这种方法可以省略基于FIB的电极写入。将悬臂尖端之间的间隙转化为绝缘体层厚度的想法具有显著的商业化价值。理论上，基于ALD或使用二维材料实现亚纳米的间隙是可能的。

迭代DNA测序的机器学习方法。当纳米机器人的末端执行器沿着DNA链移动时，测量电信号。由于四种DNA碱基的最高占有分子轨道(HOMO)能量如下:G(-5.7eV)>A(-5.9eV)>C(-6.1eV)>T(-6.6eV)[TO2012]，这些HOMO能量值之间的差异构成了利用纳米机器人DNA测序的基础。具体地，末端执行器上的两个电极可以测量碱基的HOMO能量。理论上，如果电极足够小并且电极之间的间隔等于碱基的大小，通过移动末端执行器，可以独立地测量每个碱基。然而，基于现有技术的制造技术，电极之间的最小距离将大于碱基。例如，如图15所示每个电极是50nm并且中间有5nm的空间。每个碱基的大小约为0.5nm，因此两个电极之间的间隔跨越大约10个碱基并且每个电极将覆盖约100个碱基。因此，实际的测量场景将如图16所示。

HOMO能量的本质是电势能，因此对于单个DNA链，可以看作是不同电压的电池链。这些被电极覆盖的电池可以视为短路，如图17所示。因此，两个电极之间的电势差将是两个电极之间的10个碱基的总和。基于这一认识，可以忽略电极的物理尺寸并将电极与DNA链之间的接触视为点接触，而不影响最终的测量结果，如图18所示。

因为一个测量值是10个碱基的总和，所以位于DNA链中间的那些碱基可以对10个测量值施加影响，而位于DNA链起始和末端的碱基测量的影响少得多。为了平衡这种不公平，九个已知的碱基连接到DNA链的起始和末端。由于T碱基的HOMO能量是最容易区分的，所以选择已知的碱基为T。这种串接操作如图19所示。

假设在DNA链的起始和末端串接T之后的碱基总数为n，那么在一个测量循环中需要进行n-9次测量。无噪声的测量应符合图20所示的方程，其中x表示每个碱基的HOMO能量值，b表示无噪声的测量值。前18个方程表明了有关连接的T碱基的已知真值。

在实际的测量情况下，噪声是不可避免的。对于DNA序列测量的情况，会有两种噪声。第一种噪声是电极与DNA链或串之间的接触噪声，其可以通过将高斯噪声添加到测量值中以近似。第二种噪声来自纳米机器人末端执行器运动误差，其采用β噪声建模，如图21所示。电极可能不精确地移动到两个相邻的碱基的连接处，而会有一些偏差δ。假设该偏差不超过一个碱基的长度。不同偏差值的概率分布近似于β分布

由于DNA链的弹性，两个电极的偏差可能不一样。两个独立的随机变量δ₁和δ₂分配到每个电极。这个偏差会直接影响测量矩阵。实际的测量矩阵将不再是图20中的一个，而是变为图22中的一个。然而β噪声值未知，因此在求解DNA序列时，使用的测量矩阵仍为图20中的一个。但是测量值受到高斯噪声和β噪声两者的影响，如图23所示。

图23中的方程是一个超静定方程，可以用神经网络求解。所使用的神经网络结构如图24所示。神经网络的输入是每个碱基的位置序列，例如1,2,3…，同时网络的输出是碱基在相应位置的HOMO能量值。如果方程简写为Ax＝d，训练神经网络的损失函数定义为

通过最小化损失值，可以求解出最佳DNA序列。

由于噪声的存在，一次测量循环不足以获得有说服力的DNA序列。多次测量是必要的。图23中的测量方程容易按比例放大。新的测量可以作为新的行直接添加到其末端。一旦新的测量循环完成，就可以计算出关于DNA序列的新结果。为了提高效率，使用上一次测量之后的训练结果作为下一次计算的初始值。这样，在每次新的测量循环之后，将生成新的DNA候选序列。随着测量次数的增加，生成的DNA序列之间的差异会越来越小，直到它不再改变。相邻两个结果的差值可以用来计算生成的DNA序列的置信区间。这种迭代的DNA测序框架如图25所示。

在高斯接触噪声和β运动误差下进行了仿真研究以测试DNA测序框架。绿色荧光蛋白DNA序列的前30个碱基被用作真值，它们是“TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTAT”。第一，只使用高斯接触噪声污染测量值，使用的高斯噪声服从N(0,0.04)分布。关于测量次数的平均DNA测序精度如图26所示。第二，只考虑纳米机器人末端执行器运动的β运动误差，β误差等于

关于测量次数的平均DNA测序精度如图27所示。最后，高斯接触噪声和β运动误差都被考虑，其与第一次和第二次仿真中使用的相同。仿真结果如图28所示。在所有情况下，精度随着测量次数的增加而增加，其证明了本发明的DNA测序框架的有效性。更重要的是，它展示了使用多次测量来提高测序精度的意义。

上述仿真结果是基于理想的接触噪声和运动误差模型。实际上，接触噪声可能不完全符合高斯分布，运动误差也可能不完全符合β分布。高斯模型和β模型只能用作为很好的参考。噪声的真实分布必须被校准。为此，本发明使用基于机器学习的校准方法如下:对几个已知的DNA序列进行测量以便分离噪声值。通过这种方法，可以获得一些关于噪声的数据，尽管非常有限。然后，基于新开发的生成对抗三模型(GAT模型)[SW2020]的新的校准框架可以用于校准噪声分布。GAT模型可以利用近似的定性模型促进机器学习从而减少训练数据的需求。

GAT模型的基本思想如图29所示。显然其中有两种模型，即机器学习模型和分析模型。具体的机器学习模型可以是任何种类的监督学习模型或非监督学习模型，而不仅局限于神经网络。这些机器学习模型可以独立训练直到有标签或无标签数据，甚至没有数据的情况下收敛。分析模型可以依靠关于机器学习输出的任何种类的知识，如物理知识或数学知识。因此，分析模型可以用来纠正机器学习模型的瑕疵输出。接下来，机器学习模型将基于纠正的输出重新初始化并再次训练，直到从这个新的初始化收敛。整个过程形成循环，并当机器学习输出与分析模型符合到可接受的程度时收敛。

机器学习模型通常用于表示一些复杂的函数关系，例如目前DNA测序问题中的噪声分布。预计将通过对数据的训练获得分布。但是训练数据可能难以获得，所以可能只有少量的数据，或者有偏差的数据。有很多原因导致机器学习结果不完美或不符合一些必要的约束。然而，如果已知一些关于所需函数的额外知识，这些知识可以用来调整时间机器学习输出。因此，基于调整的输出重新初始化机器学习模型，并再次进行进一步的训练。在本发明的GAT模型中，函数关系是由机器学习模型生成的，因此它作为生成器。机器学习模型和分析模型以对抗的方式依次优化这个函数。这两种模型是竞争的，因为分析模型希望函数更符合额外的知识，而机器学习模型希望函数在更小损失值的方面更符合损失函数。但是这种竞争是正和竞争，而不是像大多数生成对抗网络(GAN)[CA2018]那样的零和竞争，因为这种函数关系预计既符合损失函数也符合额外知识。

GAT模型中最至关重要的连接点是如何在调整输出的情况下重新初始化机器学习模型。对于图24所示的神经网络已开发了可行的方法。这种只有一个隐藏层的全连通网络能够重现任何函数，因此它可以用来生成所需的噪声分布。重现过程如图30所示。对于任意函数(用蓝色曲线表示)，可以从中抽样一系列点，(0,y₀)、(x₁,y₁)、(x₂,y₂)和(x₃,y₃)。原始函数可以用分段线性函数近似表示，该分段线性函数由连接每两个相邻点的线段组成。这些线段的延伸用l₁、l₂和l₃表示。对于图30右侧的具体情况，分段线性函数可以表示为l₁+ReLU(l₂-l₁)-ReLU(l₂-l₃)，该式自然符合神经网络所表示的函数关系。

在一般情况下，如果采样数据点为(x₀,y₀),(x₁,y₁),…,(x_n,y_n)，已开发了公式算法来初始化神经网络中的每个参数，使神经网络可以重现连接这些采样点的分段线性函数。这个算法用伪代码描述如下，其中sgn(·)为符号函数。

算法1：

算法1通过使用分析模型调整的输出重新初始化神经网络，以使网络可以通过进一步的训练改进调整的输出。随着机器学习模型和分析模型之间的交替，GAT模型输出也在演变。可以定义关于GAT模型输出的几个指数来表示不同阶段的输出性质。这些指数可以组合起来以形成不同的状态。然后可以从另一个状态转移的视角来看待GAT模型的运行，例如离散事件动态系统(DEDS)模型。因此，可以分析GAT模型的收敛性和稳定性。

GAT模型在噪声校准中的具体应用如图31所示。在GAT模型中，神经网络用作为生成器以生成噪声的概率分布。网络的输入是不同的噪声值，输出是其对应的概率密度值。该网络首先从随机初始化直到收敛训练实验噪声数据。然后使用生成的分布对高斯模型和β模型中的未知常数及其融合权重进行量化。然后使用量化的噪声模型用算法1重新初始化神经网络。然后用实验数据再次训练网络。当损失值小于阈值ε时，整个GAT模型收敛。这样可以校准真实测量噪声所符合的分布。基于噪声水平，可以估计出测序的某些置信度(例如99％)所需的测量次数。

总之，所提出的纳米机器人系统将能够在测序之前重复测量DNA链和校准系统。这些关键功能为应用所提出的基于GAT模型的机器学习方法分析测序数据和估计获得序列的置信度提供了基础。因此，它将显著提高测序结果的精度和可靠性。

本发明的纳米机器人系统的实验测试与验证分为两个阶段。第一阶段集中在评估系统的技术能力方面，例如测序的精度、测序速度和软件的鲁棒性。第二阶段集中于比较研究以将该系统与市场上可用的测序方法和系统(例如BotSeqS、NanoSeq和ION)的性能进行比较。

使用以下样品制备协议以建立用于测序的单个DNA链:

通过机械分离和/或酶解分离目标单细胞

提取基因组DNA

去除任何残留的RNA，如lncRNA和mi RNA，以及蛋白质，如组织蛋白生成直线单链DNA并且防止碱基对的重组

用已知的链将两端连接起来以便用可识别的条码标记它们

在平坦的基板上拉直和固定单链并且保持所有碱基在相同的方向。

在第一步中，使用已知的DNA序列来校准和验证系统。之后，将测序未知序列。同时，还将使用其他技术对其进行测序以验证结果。

此外，下列研究用于第二阶段研究:

人类EPSCs首先可以通过伽马射线或紫外线照射发生随机的基因组突变。或者，它们可以通过CRISPR-Cas9介导的敲除或敲入进行精确的基因组编辑。可以制备单细胞DNA库并且通过PCR、纳米孔和纳米机器人并行的方式以展示纳米机器人系统的效率和精度。

癌细胞和原发肿瘤可以在体外扩增并进行基于纳米机器人的基因组DNA测序以展示比其他测序方法更优越的效率和精度。DNA测序可以用来推断细胞谱系并追溯到癌症干细胞群。

目前第三代测序市场由英国Oxford Nanopore公司生产的ION主导。ION系统是基于生物纳米孔。当液体中的单链DNA通过纳米孔时，由于纳米孔的DNA堵塞，腔室内外之间的离子流发生变化。可以测量离子流并且提供DNA链序列的信息。

本发明与ION系统的主要技术区别是，本发明将待测的DNA链固定在基板上并移动测量电极而不是移动DNA链，使其通过带有电极的固定纳米孔。这种技术上的差异克服了ION系统面临的主要困难和缺点，例如无法控制DNA移动速度、在液体环境中测量，以及丢失碱基。显然，移动纳米机器人末端执行器比移动DNA链更容易控制得多。更重要地，DNA链在ION系统中只能通过纳米孔一次，测量不能重复。然而，本发明的纳米机器人末端执行器可以在固定的DNA链上来回重复移动。这允许应用高级数据分析，例如机器学习以显著提高测量精度。

此外，ION系统在测序具有相同碱基的DNA链时存在巨大的问题。因为纳米孔中的DNA阻塞是相同的，相同的碱基在通过纳米孔时不会引起任何离子流的变化。因此，短读测序精度较低，单核苷酸变异(SNV)不理想[NK2019][SA2020]。主要原因是ION只能使用离子流的变化来检测碱基，而不知道碱基的位置，也不知道碱基是否通过了纳米孔。相反，本发明的纳米机器人不仅可以重复测量，还可以在测量的同时登记碱基的位置。这个优点轻松解决了ION面临的问题。

此外，用于ION的微流体电池只能一次性使用。除了增加测序的成本，更重要的是它使得在使用设备之前不可能进行校准。这可能显著增加测序的误差。然而，本发明没有消耗品。纳米机器人末端执行器可以多次使用并且可以提前仔细校准。因此，测序成本大幅降低并且测序误差显著降低。

参考文献

本申请中引用的参考文献均以参考文献的形式全部收录于此，其内容如下:

三维InGaAs/GaAs纳米弹簧的制备与表征([BD2006]D.J.Bell,L.X.Dong,B.J.Nelson,M.Golling,L.Zhang,and D.Grutzmacher,"Fabrication andcharacterization of three-dimensional InGaAs/GaAs nanosprings,"Nano Letters,vol.6,no.4,pp.725-729,April 2006.)

原子力显微镜([BG1986]Binnig,G.,C.F.Quate,and C.Gerber,"Atomic forcemicroscope,"Physical Review Letters,Vol.56,p.930,(1986).)

生成对抗网络概述([CA2018]A.Creswell,T.White,V.Dumoulin,K.Arulkumaran,B.Sengupta,and A.A.Bharath,"Generative adversarial networks:An overview,"IEEESignal Processing Magazine,vol.35,no.1,pp.53-65,2018.)

纳米匹配类等离子体结构的光学性质([CD2010b]X.D.Cui,W.H.Zhang,D.Erni,and L.X.Dong,"Optical properties of a nanomatch-like plasmonic structure,"Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision,vol.27,no.8,pp.1783-1790,Aug 2010.)

牛津纳米孔的纳米孔研究([CG2016]C.G.Brown,and J.Clarke,“Nanoporedevelopment at Oxford nanopore,”Nature biotechnology,vol.34,no.8,pp.810-811,2016.)

使用基于单个碳纳米管场效应晶体管的红外探测器的研制([CH2010]Chen,H.,N.Xi,K.W.Lai,C.K.Fung,and R.Yang,"Development of infrared detectors usingsingle carbon-nanotube-based field-effect transistors,"IEEE transactions onnanotechnology,Vol.9,pp.582-589,(2010).)

基于多壁碳纳米管的多段光学天线的数值研究([CX2010a]X.Cui,L.X.Dong,W.Zhang,W.Wu,Y.Tang,and D.Erni,"Numerical investigations of a multi-walledcarbon nanotube-based multi-segmented optical antenna,"Applied Physics B-Lasers and Optics,vol.101,no.3,pp.601-609,Nov 2010.)

[DB2020]https://www.pharmiweb.com/press-release/2020-11-23/dna-sequencing-next-generation-sequencing-market-2020-forecast-with-top-companies-growth-factors.

碳纳米管发射器的电子束诱导沉积([DL2002]L.X.Dong,F.Arai,and T.Fukuda,"Electron-beam-induced deposition with carbon nanotube emitters,"AppliedPhysics Letters,vol.81,no.10,pp.1919-1921,Sept.2002.)

利用纳米机器人操作碳纳米管进行纳米结构的破坏性构建([DL2004]L.X.Dong,F.Arai,and T.Fukuda,"Destructive constructions of nanostructures with carbonnanotubes through nanorobotic manipulation,"IEEE/ASME Transactions onMechatronics,vol.9,no.2,pp.350-357,June 2004.)

纳米管直线伺服电机([DL2006]L.X.Dong,B.J.Nelson,T.Fukuda,and F.Arai,"Towards Nanotube Linear Servomotors,"IEEE Transactions on Automation Scienceand Engineering,vol.3,no.3,pp.228-235,July 2006.)

用于纳米机器人的碳纳米管([DL2007a]L.X.Dong,A.Subramanian,andB.J.Nelson,"Carbon nanotubes for nanorobotics,"Nano Today,vol.2,no.6,pp.12-21,Dec 2007.)

用于从三维螺旋纳米结构创建NEMS的纳米机器人([DL2007b]Dong,L.,L.Zhang,D.J.Bell,D.Grützmacher,and B.J.Nelson,"Nanorobotics for creating NEMS from 3Dhelical nanostructures,"in Journal of Physics:Conference Series,p.257,(2007).)

双手性螺旋纳米带:用于三维显微镜的直线-旋转运动转换器([DL2009]L.X.Dong,L.Zhang,B.E.Kratochvil,K.Y.Shou,and B.J.Nelson,"Dual-ChiralityHelical Nanobelts:Linear-to-Rotary Motion Converters for Three-DimensionalMicroscopy,"Journal of Microelectromechanical Systems,vol.18,no.5,pp.1047-1053,Oct.2009.)

单分子分辨率的体细胞突变场景([FA2021]F.Abascal,L.M.Harvey,E.Mitchell,A.R.Lawson,S.V.Lensing,P.Ellis,A.J.Russell,R.E.Alcantara,A.Baez-Ortega,andY.Wang,“Somatic mutation landscapes at single-molecule resolution,”Nature,pp.1-6,2021.)

用于基于碳纳米管的红外探测器的纳米共振信号增强器([FC2009]Fung,C.K.M.,N.Xi,B.Shanker,and K.W.C.Lai,"Nanoresonant signal boosters for carbonnanotube based infrared detectors,"Nanotechnology,Vol.20,p.185201,(2009).)

使用石墨烯纳米带检测DNA通过纳米孔的移位([FT2013]F.Traversi,C.Raillon,S.Benameur,K.Liu,S.Khlybov,M.Tosun,D.Krasnozhon,A.Kis,and A.Radenovic,“Detecting the translocation of DNA through a nanopore using graphenenanoribbons,”Nature nanotechnology,vol.8,no.12,pp.939-945,2013.)

单细胞基因组测序:科学的现状([GC2019]Gawad C.et.al Single-cell genomesequencing:current state of the science.Nat Rev Genet.2016Mar；17(3):175-88.)

超光滑三维晶体金属结构的大规模纳米整形([GH2014]H.Gao,Y.W.Hu,Y.Xuan,J.Li,Y.L.Yang,R.V.Martinez,C.Y.Li,J.Luo,M.H.Qi,and G.J.Cheng,"Large-scalenanoshaping of ultrasmooth 3D crystalline metallic structures,"Science,vol.346,no.6215,pp.1352-1356,Dec 2014.)

[GM2017]https://www.statista.com/statistics/940953/oxford-nanopore-sales-by-geographical-market-united-kingdom-uk/

石墨烯作为亚纳米跨电极膜([GS2010]S.Garaj,W.Hubbard,A.Reina,J.Kong,D.Branton,and J.A.Golovchenko,"Graphene as a subnanometre trans-electrodemembrane,"Nature,vol.467,no.7312,pp.190-193,Sep 2010.)

[GV2020]https://www.grandviewresearch.com/press-release/global-single-cell-genome-sequencing-market.

猪和人扩增潜能干细胞的建立([GX2019]Gao X.et.Al.Establishment ofporcine and human expanded potential stem cells.Nat Cell Biol.2019Jun；21(6):687-699.)

光电器件上光学纳米天线阵列的位置灵敏度([HC2018]C.Hou,Y.Wang,L.Yang,B.Li,Z.Cao,Q.Zhang,Y.Wang,Z.Yang,and L.Dong,"Position sensitivity of opticalnano-antenna arrays on optoelectronic devices,"Nano Energy,vol.53,pp.734-744,2018.)

糖苷水解酶家族61蛋白对木质纤维素生物质水解的刺激:一个神秘的大家族的结构和功能([HP2010]Harris,P.V.,D.Welner,K.McFarland,E.Re,J.-C.Navarro Poulsen,K.Brown,R.Salbo,H.Ding,E.Vlasenko,and S.Merino,"Stimulation oflignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family61:structure and function of a large,enigmatic family,"Biochemistry,Vol.49,pp.3305-3316,(2010).)

用于DNA测序的石墨烯纳米器件([HS2016]S.J.Heerema and C.Dekker,"Graphene nanodevices for DNA sequencing,"Nature Nanotechnology,vol.11,no.2,pp.127-136,Feb 2016.)

具有超细间隙的金属纳米结构阵列的超塑性形成([HY2016]Y.W.Hu,Y.Xuan,X.L.Wang,B.W.Deng,M.Saei,S.Y.Jin,J.Irudayaraj,and G.J.Cheng,"SuperplasticFormation of Metal Nanostructure Arrays with Ultrafine Gaps,"AdvancedMaterials,vol.28,no.41,pp.9152-9162,Nov 2016.)

超越螺旋间距:原生DNA在水溶液中的直接可视化([IS2013]Ido,S.,K.Kimura,N.Oyabu,K.Kobayashi,M.Tsukada,K.Matsushige,and H.Yamada,"Beyond the helixpitch:direct visualization of native DNA in aqueous solution,"ACS nano,Vol.7,pp.1817-1822,(2013).)

纳米长度尺度的离子束雕刻([JL2001]J.Li,D.Stein,C.McMullan,D.Branton,M.J.Aziz,and J.A.Golovchenko,“Ion-beam sculpting at nanometre length scales,”Nature,vol.412,no.6843,pp.166-169,2001.)

40岁的DNA测序:过去，现在和未来([JS2017]J.Shendure,S.Balasubramanian,G.M.Church,W.Gilbert,J.Rogers,J.A.Schloss,and R.H.Waterston,“DNA sequencingat 40:past,present and future,”Nature,vol.550,no.7676,pp.345-353,2017.)

聚焦离子束化学气相沉积法在玻璃毛细管上制备纳米机械手和执行器([KR2004]R.Kometani,T.Morita,K.Watanabe,T.Hoshino,K.Kondo,K.Kanda,Y.Haruyama,T.Kaito,J.I.Fujita,M.Ishida,Y.Ochiai,and S.Matsui,"Nanomanipulator and actuatorfabrication on glass capillary by focused-ion-beam-chemical vapordeposition,"Journal of Vacuum Science&Technology B,vol.22,no.1,pp.257-263,Jan-Feb 2004.)

金、银金属原子与DNA/RNA碱基之间的相互作用——基态性质的综合计算研究([LA2015]L.A.E.Leal,and O.Lopez-Acevedo,“On the interaction between gold andsilver metal atoms and DNA/RNA nucleobases–a comprehensive computationalstudy of ground state properties,”Nanotechnology Reviews,vol.4,no.2,pp.173-191,2015.)

基于压缩采样的目标识别学习([LC2017]C Li,Y Cheng,S Bi,Y Cai,N Xi,learning object recognition based on compressive sampling,2017IEEEInternational Conference on Robotics and Biomimetics(ROBIO),Macau,China,5-8Dec.2017.)

基于内容的压缩传感([LC2018]C Li,Y Cheng,Z Sun,P He,S Bi,N Xi,Content-Based Compressive Sensing,2018IEEE 8th Annual International Conference onCYBER Technology in Automation,Control,and Intelligent Systems(CYBER),Tianjin,China,19-23July 2018.)

基于液滴的单细胞检测中条码多线的推断和影响([LC2020]Lareau,C.A.,Ma,S.,Duarte,F.M.&Buenrostro,J.D.Inference and effects of barcode multiplets indroplet-based single-cell assays.Nat.Commun.11,866(2020).)

基于块压缩感知的扫描离子电导显微镜的高效成像和实时显示([LG2014]Gongxin Li,Peng Li,Yuechao Wang,Wenxue Wang,Ning Xi,Lianqing Liu,“EfficientImaging and Real-Time Display of Scanning Ion Conductance Microscopy Based onBlock Compressive Sensing”,International Journal of Optomechatronics 01/2014；8(3).)

基于实时压缩跟踪的纳米操作([LG2015]Gongxin Li；Wenxue Wang；YuechaoWang；Shuai Yuan；Wenguang Yang；Ning Xi；Lianqing Liu,"Nano-Manipulation Basedon Real-Time Compressive Tracking"IEEE Transactions on Nanotechnology,Volume:14,Issue:5,September 2015)

用于红外传感器的碳纳米管的带隙工程([LK2009a]Lai,K.W.C.,N.Xi,C.K.M.Fung,H.Chen,and T.-J.Tarn,"Engineering the band gap of carbon nanotubefor infrared sensors,"Applied Physics Letters,Vol.95,p.221107,(2009).)

自动化纳米制造系统以组装基于碳纳米管的设备([LK2009b]Lai,K.W.C.,N.Xi,C.K.M.Fung,J.Zhang,H.Chen,Y.Luo,and U.C.Wejinya,"Automated nanomanufacturingsystem to assemble carbon nanotube based devices,"The International Journalof Robotics Research,Vol.28,pp.523-536,(2009).)

微生物纤维素利用:基础和生物技术([LL2002]Lynd,L.R.,P.J.Weimer,W.H.VanZyl,and I.S.Pretorius,"Microbial cellulose utilization:fundamentals andbiotechnology,"Microbiol.Mol.Biol.Rev.,Vol.66,pp.506-577,(2002).)

纤维素生物水解酶水解疏水性表面的结晶纤维素([LY2011]Liu,Y.-S.,J.O.Baker,Y.Zeng,M.E.Himmel,T.Haas,and S.-Y.Ding,"Cellobiohydrolasehydrolyzes crystalline cellulose on hydrophobic faces,"Journal of BiologicalChemistry,Vol.286,pp.11195-11201,(2011).)

使用大规模并行测序量化正常人类组织中罕见体细胞突变的全基因组([ML2016]M.L.Hoang,I.Kinde,C.Tomasetti,K.W.McMahon,T.A.Rosenquist,A.P.Grollman,K.W.Kinzler,B.Vogelstein,and N.Papadopoulos,“Genome-wide quantification ofrare somatic mutations in normal human tissues using massively parallelsequencing,”Proceedings of the National Academy of Sciences,vol.113,no.35,pp.9846-9851,2016.)

聚焦离子束化学气相沉积制备三维纳米结构([MS2000]S.Matsui,T.Kaito,J.Fujita,M.Komuro,K.Kanda,and Y.Haruyama,"Three-dimensional nanostructurefabrication by focused-ion-beam chemical vapor deposition,"Journal of VacuumScience&Technology B,vol.18,no.6,pp.3181-3184,Nov-Dec 2000.)

利用时变跨膜电压提高纳米孔DNA测序的精度([MT2019]M.T.Noakes,H.Brinkerhoff,A.H.Laszlo,I.M.Derrington,K.W.Langford,J.W.Mount,J.L.Bowman,K.S.Baker,K.M.Doering,and B.I.Tickman,“Increasing the accuracy of nanoporeDNA sequencing using a time-varying cross membrane voltage,”Naturebiotechnology,vol.37,no.6,pp.651-656,2019.)

功能基因组的潜在应用综述([NK2019]Kono N,Arakawa K.Nanoporesequencing:Review of potential applications in functional genomics.Dev GrowthDiffer.2019Jun；61(5):316-326.)

摆线轨迹视频速率非光栅AFM成像([NN2018]Nikooienejad,N.,A.Alipour,M.Maroufi,and S.R.Moheimani,"Video-Rate Non-Raster AFM Imaging With CycloidTrajectory,"IEEE Transactions on Control Systems Technology,2018).)

[NT2015]https://www.nature.com/articles/nrg.2015.16.

用于DNA测序技术的纳米间隙传感器的设想:合成纳米孔综述([PP2018]P.Pungetmongkol,“Speculation of Nano-gap Sensor for DNA sequencingtechnology:A Review on Synthetic Nanopores,”Engineering Journal,vol.22,no.6,pp.229-250,2018.)

[PS2020]https://www.prnewswire.com/news-releases/next-generation-sequencing-data-analysis-market-size-worth-1-72-billion-by-2028-grand-view-research-inc-301229618.html

独立形成的InGaAs/GaAs纳米管，纳米螺旋及其阵列([PV2000]V.Y.Prinz,V.A.Seleznev,A.K.Gutakovsky,A.V.Chehovskiy,V.V.Preobrazhenskii,M.A.Putyato,and T.A.Gavrilova,"Free-standing and overgrown InGaAs/GaAs nanotubes,nanohelices and their arrays,"Physica E,vol.6,no.1-4,pp.828-831,Feb 2000.)

用于牛津纳米孔测序的神经网络基本调用工具性能([RR2019]R.R.Wick,L.M.Judd,and K.E.Holt,“Performance of neural network basecalling tools forOxford Nanopore sequencing,”Genome biology,vol.20,no.1,pp.1-10,2019.)

长读测序数据分析的机遇与挑战([SA2020]Amarasinghe SL,Su S,Dong X,Zappia L,Ritchie ME,Gouil Q.Opportunities and challenges in long-readsequencing data analysis.Genome Biol.2020Feb 7；21(1):30.)

基于压缩反馈的纳米操作运动控制理论与应用([SB2014]B.Song,J.Zhao,N.Xi,H.Chen,K.W.C.Lai,R.Yang,L.Chen,“Compressive Feedback-Based Motion Control forNanomanipulation—Theory and Applications”,IEEE Transactions on Robotics 01/2014；30(1):103-114.)

[SJ2020]https://satijalab.org/costpercell/.

光刻定义的金属-半导体混合纳米卷([SO2005]O.Schumacher,S.Mendach,H.Welsch,A.Schramm,C.Heyn,and W.Hansen,"Lithographically defined metal-semiconductor-hybrid nanoscrolls,"Applied Physics Letters,vol.86,no.14,Apr2005.)

单细胞转录组数据中细胞双体的计算识别([SW2019]Wolock,S.L.,Lopez,R.&Klein,A.M.Scrublet:computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data.Cell Syst.8,281–291(2019).)

使用迁移学习的触觉传感器校准([SW2020]S.Wang and N.Xi,"Calibration ofHaptic Sensors Using Transfer Learning,"IEEE Sensors Journal,vol.21,no.2,pp.2003-2012,2020.)

从单细胞RNA-seq数据中分类低质量细胞([TL2016]Ilicic,T.etal.Classification of low quality cells from single-cell RNA-seq data.GenomeBiol.17,29(2016).)

用于电定位互补碱基的互补碱基对促进电子隧穿([TO2006]T.Ohshiro,andY.Umezawa,“Complementary base-pair-facilitated electron tunneling forelectrically pinpointing complementary nucleobases,”Proceedings of theNational Academy of Sciences,vol.103,no.1,pp.10-14,2006.)

DNA和RNA的单分子电随机重测序([TO2012]T.Ohshiro,K.Matsubara,M.Tsutsui,M.Furuhashi,M.Taniguchi,and T.Kawai,"Single-molecule electrical randomresequencing of DNA and RNA,"Scientific reports,vol.2,no.1,pp.1-7,2012.)

基于石墨烯的纳米孔方法用于DNA测序：文献综述([WA2018]A.Wasfi,F.Awwad,and A.I.Ayesh,"Graphene-based nanopore approaches for DNA sequencing:Aliterature review,"Biosensors&Bioelectronics,vol.119,pp.191-203,Nov 2018.)

温度和湿度对柳枝稷和棉花制造的纤维素纳米晶体膜的纳米力学性能的影响([WQ2013]Wu,Q.,Y.Meng,K.Concha,S.Wang,Y.Li,L.Ma,and S.Fu,"Influence oftemperature and humidity on nano-mechanical properties of cellulosenanocrystal films made from switchgrass and cotton,"Industrial Crops andProducts,Vol.48,pp.28-35,(2013).)

用接触共振原子力显微镜研究纤维素纳米材料的力学性能([WR2016]Wagner,R.,R.J.Moon,and A.Raman,"Mechanical properties of cellulose nanomaterialsstudied by contact resonance atomic force microscopy,"Cellulose,Vol.23,pp.1031-1041,(2016).)

用于360°表征原子力显微镜的纳米机器人操作系统([WY2019]Wen,Y.,H.Lu,Y.Shen,and H.Xie,"Nanorobotic Manipulation System for 360° CharacterizationAtomic Force Microscopy,"IEEE Transactions on Industrial Electronics,2019).)

第一性原理横向DNA电导的解构([XG2006]X.-G.Zhang,P.S.

R.

J.C.Wells,and M.Fuentes-Cabrera,“First-principles transversal DNA conductancedeconstructed,”Biophysical journal,vol.91,no.1,pp.L04-L06,2006.)

用于中红外传感器的碳纳米管组装的纳米机器人([XN2007]Xi,N.,J.Zhang,H.Szu,and G.Li,"Nanorobot assembly of carbon nanotubes for mid-IR sensor,"inIndependent Component Analyses,Wavelets,Unsupervised Nano-Biomimetic Sensors,and Neural Networks V,p.65760K,(2007).)

基于碳纳米管的非低温冷却多光谱焦平面阵列([XN2010]Xi,N.,K.W.C.Lai,H.Chen,and C.K.M.Fung,"Carbon nanotube-based noncryogenic cooledmultispectrum focal plane array,"in Infrared Technology and ApplicationsXXXVI,p.766032,(2010).)

用于纳米操作的增强现实技术([XN2011]Xi,N.,B.Song,R.Yang,and K.Lai,"Augmented Reality for Nano Manipulation,"in Handbook of Augmented Reality,ed:Springer,2011,pp.435-447.)

视频速率原子力显微镜:用于纳米级视频成像的压缩扫描([XN2013]Xi,N；Song,B；Yang,R；Lai,K W C；Chen,H；Qu,C；Chen,L,“Video Rate Atomic Force Microscopy:Useof compressive scanning for nanoscale video imaging”,IEEE NanotechnologyMagazine,Vol.7,Issue 1,Page(s):4–8,March 2013.)

小鼠扩增潜力干细胞的建立([YJ2017]Yang J.et.al.Establishment of mouseexpanded potential stem cells.Nature.2017Oct 19；550(7676):393-397.)

细胞水平机器人手术:活角质细胞中的中间丝的纳米解剖([YR2015]Yang,R.,B.Song,Z.Sun,K.W.C.Lai,C.K.M.Fung,K.C.Patterson,K.Seiffert-Sinha,A.A.Sinha,and N.Xi,"Cellular level robotic surgery:Nanodissection of intermediatefilaments in live keratinocytes,"Nanomedicine:Nanotechnology,Biology andMedicine,Vol.11,pp.137-145,(2015).)

基于单碳纳米管的红外传感器的设计、制造和测试([ZJ2008]Zhang,J.,N.Xi,H.Chen,K.W.C.Lai,G.Li,and U.C.Wejinya,"Design,manufacturing,and testing ofsingle-carbon-nanotube-based infrared sensors,"IEEE transactions onnanotechnology,Vol.8,pp.245-251,(2008).)

SiGe/Si和SiGe/Si/Cr螺旋纳米带的可控制造([ZL2005]L.Zhang,E.Deckhardt,A.Weber,C.Schonenberger,and D.Grutzmacher,"Controllable fabrication of SiGe/Si and SiGe/Si/Cr helical nanobelts,"Nanotechnology,vol.16,no.6,pp.655-663,Jun 2005.)

独立Si/Cr微纳米螺旋的制备与表征([ZL2006a]L.Zhang,L.X.Dong,D.J.Bell,B.J.Nelson,C.

and D.Grützmacher,"Fabrication andCharacterization of Freestanding Si/Cr Micro-and Nanospirals,"MicroelectronicEngineering,vol.83,no.4-9,pp.1237-1240,April-Sept.2006.)

SiGe/Si和SiGe/Si/Cr螺旋纳米带的反常螺旋([ZL2006b]L.Zhang,E.Ruh,D.Grutzmacher,L.X.Dong,D.J.Bell,B.J.Nelson,and C.Schonenberger,"Anomalouscoiling of SiGe/Si and SiGe/Si/Cr helical nanobelts,"Nano Letters,vol.6,no.7,pp.1311-1317,July 2006.)

卷曲Si/Cr纳米带的环闭合([ZL2008]L.Zhang,L.X.Dong,and B.J.Nelson,"Ringclosure of rolled-up Si/Cr nanoribbons,"Applied Physics Letters,vol.92,no.14,Apr 2008.)

当本发明被解释为与某些实施例相关时，需要理解的是，其各种修改对于那些阅读说明书的本领域技术人员来说将变得显而易见。因此，应当理解的是，本发明公开旨在涵盖落入所附权利要求书保护范围内的修改。

Claims (27)

1.一种用于对定位在载玻片上的DNA链进行单细胞DNA测序的纳米级机器人系统，包括:

原子力显微镜(AFM)，具有呈带有尖端的悬臂形式的末端执行器，当所述载玻片定位在AFM的样品台时，所述AFM参与扫描过程，导致其悬臂尖端扫描DNA链的碱基对；

在尖端处的一对间隔开的电极，所述电极与DNA链的两相对端相接触；

与电极相连的电流测量系统，所述测量系统测量DNA链碱基之间的电流；以及

基于人工智能的数据分析系统，所述系统用于基于来自电流测量系统的电流确定DNA序列。

2.根据权利要求1所述的纳米级机器人系统，其中所述电流测量系统是高精度隧道电流测量系统。

3.根据权利要求1所述的纳米级机器人系统，其中所述基于人工智能的数据分析系统利用生成对抗三模型(GAT)机器学习方案。

4.根据权利要求1所述的纳米级机器人系统，其中所述AFM包括：

第一控制电路，使尖端在载玻片的XY平面上移动以便沿着DNA条带移动，

激光器，引导激光束以从悬臂的平顶反射，

光探测器，设置为在光束从悬臂顶部反射之后接收所述光束，并基于反射光的变化生成偏转信号，所述偏转信号与悬臂在Z方向上朝向或远离载玻片的偏转有关，以及

第二控制电路，基于偏转信号在Z方向上移动悬臂以创建反馈信号，所述反馈信号使悬臂保持在DNA链上方的一致位置。

5.根据权利要求4所述的纳米级机器人系统，其中所述光探测器是位置敏感的光电二极管(PSPD)。

6.根据权利要求1所述的纳米级机器人系统，其中所述AFM通过基于非向量空间控制方法的语义压缩运动控制使悬臂尖端扫描DNA链的碱基对，包括：

来自DNA实际强度局部扫描图像的语义压缩样本的AFM输出；

压缩期望强度局部扫描图像的源；

比较器，用于比较压缩的期望强度局部扫描图像与压缩的实际强度局部扫描图像，并产生差异信号；以及

非向量空间控制器，接收差异信号并通过减少差异信号使压缩的实际强度局部扫描图像在集合空间内收敛到压缩的期望强度局部扫描图像，其中控制器的输出使AFM改变压缩的实际强度局部扫描图像作为反馈循环的一部分。

7.根据权利要求6所述的纳米级机器人系统，其中所述AFM扫描过程使用压缩扫描模式。

8.根据权利要求6所述的纳米级机器人系统，其中在图像的局部扫描期间在语义压缩中使用图像内容的先验知识。

9.根据权利要求8所述的纳米级机器人系统，其中DNA链的形状的先验知识用于语义压缩。

10.根据权利要求6所述的纳米级机器人系统，其中所述语义压缩运动控制利用从一组DNA链图像中学习到的传感矩阵，其中通过普遍深度学习策略进行传感矩阵训练过程。

11.根据权利要求10所述的纳米级机器人系统，其中使用非负矩阵因子分解(NMF)表示来学习DNA链的AFM图像的语义内容。

12.一种形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，包括以下步骤:

使用FI B化学气相沉积从市售的悬臂切割悬臂及其支撑基座，该悬臂在两侧(顶部和底部)预先涂有金属层以在锥体或锥形尖端上形成引线和微电极；

如果锥形尖端具有预涂金属层，则使用FI B将预涂金属层分离为两部分；

如果锥形尖端没有预涂金属层，使用FIBCVD在侧面直写电极，其中线宽约1μm，厚度约50至100nm；

使用FIB将锥形尖端磨掉以形成两个边长为1μm至3μm的小平面；

应用FIBCVD或EBID从平面上形成纳米尖端，并在圆柱形尖端顶部形成横向桥；以及

使用聚焦的高能量电子束以在圆柱形纳米尖端之间通过将桥在中心切割成两部分而生成亚10纳米的间隙。

13.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中当市售的悬臂未预涂金属时，进一步包括在两侧溅射金属的步骤。

14.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述微电极和所述引线分别具有2μm至5μm和20μm至50μm的宽度。

15.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述金属涂层是金。

16.根据权利要求13所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述金属涂层是金。

17.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述电子束具有200keV至300keV的能量。

18.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述锥体或锥形尖端是空心的。

19.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述采用FI BCVD或EBID形成纳米尖端的步骤导致两侧向内侧倾斜的形成方向为30°，圆柱形纳米尖端的直径为30至50nm，长度为1至3μm。

20.根据权利要求12所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述使用聚焦的高能电子束的步骤使用CsTEM。

21.一种形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，包括以下步骤:

使用PECVD以形成50nm厚的二氧化硅(Si O₂)薄膜；

通过使用EBL系统以在旋涂光刻胶上对尖端图案化，形成多个50nm、最小间隙约为15nm的交叉圆柱形尖端；

使用电子束来蒸发约45nm厚的金来将图案显影；

使用ns YAG激光从顶部压制预制金属盘，为此使用了三层材料，包括4μm厚的铝层作为压缩器，石墨层作为烧蚀涂层，CaF₂/ZeSe玻璃层用于透明约束；

将具有预设计图案的光刻掩模与紫外线照射一起使用，用于支撑基座和悬臂轮廓的顶部和底部侧面的图案化，所述图案化通过使用光刻胶的旋涂、显影和使用I CP的Si O₂层的干法蚀刻实现；

通过使用KOH溶液创建Si湿法蚀刻的窗口；

在蚀刻之后形成锥体尖端，同时悬臂保持比最终尺寸更大的厚度；

在顶部表面上使用PECVD形成50nm厚的Si O₂层作为绝缘层，用于在支撑基座上制造引出电极和在悬臂上制造微电极；

使用基于紫外线照射的I CP干法蚀刻以及在旋涂光刻胶层上显影选择性地去除尖端顶部的Si O₂；

用电子束蒸发器沉积45nm厚的金膜作为电极；

使用FI BCVD直写纳米电极，所述纳米电极将悬臂和顶端的微电极连接，使纳米电极遵循沿锥体侧面和顶面的路径实现三维电连接；以及

使用BOE来蚀刻掉Si O₂然后使用KOH蚀刻Si。

22.根据权利要求21所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，还包括激光冲压的步骤以进一步将间隙缩小到亚10纳米级别。

23.一种形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，包括以下步骤:

使用PECVD在硅晶圆的两侧气相沉积Si O₂绝缘层；

沉积紫外线照射形成图案的牺牲层Al膜，用电子束蒸发所述膜，并使所述膜经历剥离工艺，以形成具有内应力的Si xNy膜的自卷曲台面；

使用紫外线光刻工艺设计照射掩模，使用I CP蚀刻技术实现台面制造；

用紫外线照射和电子束蒸发对Au底电极图案化；

通过使用ALD沉积技术以创建Al ₂O₃膜，从而获得纳米间隙绝缘层；

使用光刻胶作为掩模以及I CP蚀刻，以保留底部电极上方的Al ₂O₃膜的图案；

使用紫外线照射、电子束气相沉积和剥离技术以获得Au膜顶部电极图案；

使用通过光刻胶对Si O₂层的背面进行预蚀刻的背面夹套方法来创建蚀刻窗口图案；

使用Si O₂的I CP蚀刻来暴露硅蚀刻材料，使用丙酮去除蚀刻窗口光刻胶；

使用PECVD来蒸发基板表面的部分Si O₂抗蚀刻保护层；

将基板置于室温下的KOH溶液中以蚀刻掉基板Si；

将紫外线光刻与I CP一起使用来蚀刻Si O₂保护层，以将蚀刻窗口图案转移到基板顶部；

使用丙酮去除蚀刻窗口光刻胶；

使用紫外线照射以获得自卷曲释放窗口图案；

使用NMD溶液来蚀刻牺牲层Al以逐渐释放卷曲结构；

将具有自卷曲结构的样品置于丙酮溶液中以去除光刻胶；

在上下释放窗口连接点处使用KOH来蚀刻硅基板；以及

将样品置于BOE蚀刻溶液中以完全蚀刻暴露的Si O₂，然后将所述样品定位于水溶液中静止以获得具有自卷曲结构的AFM探针。

24.根据权利要求23所述的形成亚10纳米间隙的双尖端AFM悬臂的方法，其中所述牺牲层Al膜的厚度为20nm,所述图案化的Au底电极厚度为50nm，所述纳米间隙绝缘层Al ₂O₃膜的厚度为1nm，所述Au膜顶部电极图案的厚度为50nm,所述部分Si O₂抗蚀刻保护层的厚度为130nm。

25.一种纳米级机器人单细胞DNA测序方法，所述方法将DNA链定位在原子力显微镜载玻片上，沿着DNA链移动呈具有尖端的悬臂的形式的末端执行器，其中尖端电极之间的间距大于DNA链碱基之间的间距，因此电极之间的电势差是两个电极之间所有碱基占据的分子轨道(HOMO)能量的总和，包括以下步骤:

制备DNA链用于测序；

将9个T碱基的能量值添加到DNA链的起始和末端；

进行n-9次测量作为一个测量循环，其中n是DNA链起始和末端T碱基串接之后的碱基总数，

在测量值中加入高斯噪声以考虑电极与DNA之间的接触噪声；

在测量值中加入β噪声以考虑末端执行器运动中的误差；

用神经网络求解DNA序列，所述神经网络输入为每个碱基的位置序列，输出为碱基在相应位置的HOMO能量值，其中训练神经网络的损失函数定义为

通过最小化损失值可以确定最佳DNA序列；以及

重复测量循环，其中上一次测量之后的结果被用作下一次计算的初始值；以及

继续重复测量循环直到生成的DNA序列没有变化。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述高斯噪声和β噪声通过以下步骤校准：

测量几个已知的DNA序列以确定分离的噪声值；

基于生成对抗三模型(GAT模型)创建新的框架以校准噪声分布，其中，GAT模型包括机器学习模型和分析模型并利用近似的定性模型促进机器学习从而减少训练数据的需求；

独立训练机器学习模型直到收敛；

将分析模型基于关于机器学习输出的任何种类知识；以及

基于纠正的输出重新初始化机器学习模型初始化状态，并再次训练机器学习模型直到从重新初始化的值收敛，由此整个过程形成循环，并当机器学习输出与分析模型符合到可接受的程度时收敛。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述制备DNA链的步骤包括以下步骤：

通过机械分离和/或酶解分离目标单细胞；

提取基因组DNA；

去除任何残留的RNA，如l ncRNA和mi RNA，以及蛋白质，如组织蛋白；

生成线性单链DNA并且防止碱基对的重组；

用已知的链将所述链的两端连接起来以便用可识别的条码标记所述链；以及

在平坦的基板上拉直和固定单链并且保持所有碱基在相同的方向。

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