KR20160052557A

KR20160052557A - 양자 분자 염기서열결정 (qm-SEQ): DNA, RNA, 그리고 단일 뉴클레오티드 변형에 대한 독특한 나노전자 터널링 분광법 지문의 확인

Info

Publication number: KR20160052557A
Application number: KR1020167005881A
Authority: KR
Inventors: 프라상트 나그팔; 아누슈리 차터지; 조셉 카사마다 리보트
Original assignee: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코퍼레이트
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-05-12
Also published as: WO2015038972A1; CA2924021A1; US20160222445A1; EP3044330A1; CN105531379A; JP2016534742A

Abstract

자연과 합성, 그리고 변형되고 변형되지 않은 DNA, RNA, PNA, DNA/RNA 뉴클레오티드를 확인하고 염기서열결정하는데 유용한 기술, 방법, 장치, 그리고 조성물이 개시된다. 개시된 기술, 방법, 장치, 그리고 조성물은 QM-Seq으로서 지칭될 수 있는 나노전자 양자 터널링 분광법을 이용하여, 다양한 변형, DNA/RNA 손상, 그리고 뉴클레오티드 구조를 확인하는데 유용하다. 이들 방법과 조성물은 단일 가닥 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 거대분자의 침적을 위해 하전된, 부드러운 기질을 이용하고, 변형된 또는 변형되지 않은 DNA/RNA/PNA를 주사하고, 자연과 합성, 변형되고 변형되지 않은 핵염기, 그리고 동일한 또는 유사한 조건 하에, 예를 들면, 핵염기가 산성 환경에 있을 경우에 획득된 이차/삼차 구조를 비롯한 공지된 핵염기의 전자 지문의 데이터베이스에 대하여 미지의 핵염기의 전자 서명을 비교하는 것을 포함할 수 있다.

Description

양자 분자 염기서열결정 (qm-SEQ): DNA, RNA, 그리고 단일 뉴클레오티드 변형에 대한 독특한 나노전자 터널링 분광법 지문의 확인{QUANTUM MOLECULAR SEQUENCING (QM-SEQ): IDENTIFICATION OF UNIQUE NANOELECTRONIC TUNNELING SPECTROSCOPY FINGERPRINTS FOR DNA, RNA, AND SINGLE NUCLEOTIDE MODIFICATIONS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의하여, 2013년 9월 13일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/877,634에 우선권을 주장하고, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

분야

개시된 방법, 장치, 조성물, 그리고 시스템은 핵산의 확인과 염기서열결정에 관계한다.

배경

개인맞춤된 약제를 위한 새로운 진단적 도구 및 유전학의 급속히 발전하는 분야는 저렴한, 신속한, 신뢰할 만한, 효소-없는, 그리고 고처리량 염기서열결정 기술을 필요로 한다. 최근에 개발된 여러 DNA 염기서열결정 기술이 염기서열결정 비용과 시간을 감소시키려 시도하였지만, 보고된 핵산 서열은 통계학적으로 유의한 앙상블 평균이다. 이들 앙상블 평균이 뉴클레오티드 서열 및 생리학적 행태 사이에 일부 상관을 도출하는데 이용될 수 있긴 하지만, 유전자 변이 또는 돌연변이의 추적 수준이 생물학적 기능을 지배할 수 있다. 이것은 세균의 다제 내성 균주, 또는 슈퍼버그, 그리고 약물 치료 전에 미량으로 명목상으로 존재하는 빠른 돌연변이 병원체의 급속한 출현에 의해 예시된다. 약제 내성 인코딩 DNA 서열, 예를 들면, 페니실린-기초된 항생제에 대항하여 내성을 유발하는 β-락타마아제의 빠른 확인을 수반하는 최근 연구는 이들 기술이 적시적인, 표적화된 의학적 개입을 제공하는데 필수적이라는 것을 보여주었고, 따라서 신속한 고처리량 염기서열결정을 위한 신뢰할 만한 단일 분자 염기서열결정 도구에 대한 필요성을 강조한다. 현재 2세대 염기서열결정 기술은 심부와 초심부 (폴리뉴클레오티드당 약 100개 판독 (read)) 염기서열결정 방법, 그리고 단일 사본 PCR (중합효소 연쇄 반응) 증폭을 이용하여 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 검출할 수 있다. 하지만, 이들 방법은 값비싸고 기술적으로 복잡하기 때문에, 임상적 세팅에서 적용하기 어렵다. 최근 연구가 의학과 비침습성 임상적 적용을 위한 단일-세포 유전체학의 잠재적 이용을 개설하긴 했지만, 이들 연구는 단일 분자로부터 DNA의 효소적 증폭, 그리고 전통적인 염기서열결정 도구 (광학적 마커)를 이용한 DNA 염기서열결정을 수반한다. 따라서, DNA의 확인을 위한 현재의 기술은 서열 바이어스를 도입할 수 있고, 그리고 추적 또는 단일-세포 표본에 대한 DNA 서열 검출에서 오류를 잠재적으로 야기할 수 있는 효소 기초된 DNA 증폭에 의존한다. 다른 새로운 기술은 DNA 분자 단독의 염기서열결정을 허용하는 핵산 마커와 특정한 효소의 이용으로, 데노보 염기서열결정에서 염기서열결정 오류를 향상시키려 시도하였다.

DNA 서열의 전자 확인은 차세대 염기서열결정 기술에 대한 후보인데, 그 이유는 이것이 DNA 증폭 없이 효소-없는 기술을 제공할 수 있기 때문이다. 이러한 방법은 다른 기술과 연관된 처리 시간과 오류를 감소시키는 가능성을 제공할 수 있다. 여러 그룹이 나노구멍을 따라서 이온성 전류 변화, 또는 염기가 나노구멍을 횡단할 때 터널링 전류 감쇠에 근거하여 DNA 뉴클레오티드의 나노구멍 전도도를 이용하는 것을 탐구하고 있다. 이들 실험에서, DNA는 매우 작은 구멍을 통하여 이동하도록 만들어지는데, 여기서 이의 구조가 탐침된다. 하지만, 이러한 방법은 단일 분자 분해능 능력을 결여하고, 그리고 뉴클레오티드 변형으로 인해 전도도에서 불충분한 변화를 겪고, 따라서 진단학과 후생유전체학 확인을 위한 이의 잠재적 이용이 제한된다. 다른 연구는 단일 분자 검출과 확인을 위해 주사형 터널링 현미경검사를 탐구하였다. 비록 주사형 터널링 현미경검사를 이용한 단일 DNA 분자의 영상이 달성되긴 했지만, 어느 것도 개별 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기의 정확한, 재현가능한, 효율적인 확인과 식별을 위한 신뢰할 만한 방법 또는 장치, 또는 복수 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 핵염기 및 이들의 조합을 갖는 분자에서 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기를 염기서열결정하는 능력을 제공하지 못하였다.

RNA 염기서열결정은 독특한 과제를 부과한다. 최근에, 대량으로 평행 RNA 염기서열결정은 그 중에서도 특히, 작은 RNA 특성화, 전사 시작 부위 확인을 비롯하여, 유전자 발현의 고처리량 정량 및 희귀한 전사체의 확인을 허용하였다. 하지만, 대부분의 RNA 염기서열결정 방법은 cDNA 합성뿐만 아니라, 무작위 헥사머로 기폭, 결찰, 증폭과 염기서열결정을 비롯하여, 복수 수준에서 바이어스를 도입하는 다수의 조작에 의존한다. 게다가, 다수의 통상적인 자연적 변형 (5-메틸시토신, 슈도우리딘)과 화학적 변형 (N7-메틸구아닌)은 cDNA 합성 동안 역전사효소를 중단시키지 않고, 이런 이유로 고처리량 DNA 염기서열결정 방법을 이용하여 검출되지 않는다. 통상적으로 이용되는 역전사효소는 또한, cDNA 내로 인공물, 예를 들면, RNA 이차 구조의 영역에서 뉴클레오티드를 결실시키는 경향을 도입하는 것으로 알려져 있다. 이것은 결과의 cDNA에서 염기서열결정 패턴의 "흐려짐"을 야기한다. 게다가, 현재의 염기서열결정 기술에 의해 검출되지 않는 DNA 메틸화가 암 세포에 대한 지배적인 마커인 것으로 밝혀졌고, 그리고 암성 세포와 비암성 세포 사이에 발생하는 체성 변화를 식별하는데 이용될 수 있다.

요약

본원에서 개시된 기술, 방법, 장치, 그리고 조성물은 미지의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 핵염기의 정체를 결정하는데 이용될 수 있고, 여기서 상기 방법은 미지의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기를 양자 터널링에 의해 분석하고, 미지의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기에 대한 하나 또는 그 이상의 전자 파라미터를 결정하고, 이들 전자 파라미터를 이용하여 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기에 대한 서명을 결정하고, 미지의 염기의 전자 서명을 하나 또는 그 이상의 공지된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기에 대한 전자 지문에 비교하고, 미지의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기의 전자 서명을 공지된 염기 (가령, 변형되고 변형되지 않은 DNA 뉴클레오티드 아데닌, A, 티민, T, 구아닌, G, 시토신, C, RNA 뉴클레오티드 A, G, C, 우라실, U, 펩티드 핵산 (PNA) 및 기타 인공 핵산 거대분자, 메틸화, 5-카르복시, 5-포르밀, 5-히드록시메틸, 5-메틸 데옥시, 5-메틸, 5-히드록시메틸, N6-메틸-데옥시아데노신과 같은 뉴클레오티드 변형, 그리고 N-메틸 이사토산 무수물 (NMIA) 또는 디메틸 황산염 (DMS)과 같은 RNA 이차/삼차 구조를 결정하는데 이용된 다른 변형)의 전자 지문에 정합하고, 그리고 따라서, 미지의 핵염기, 핵염기 변형 또는 핵산 거대분자 이차/삼차 구조를 확인하는 것을 포함한다. 많은 구체예에서, 미지의 핵염기의 전자 서명은 핵염기가 특정한 생화학적 조건 또는 환경, 예를 들면, 산성, 중성, 또는 염기성 pH에서 선택되는 pH 환경에 있을 동안 결정될 수 있다. 많은 구체예에서, 핵염기의 전자 서명은 생화학적 조건, 예를 들면, pH 환경에 의해 변경된다. 일부 구체예에서, 미지의 핵염기의 정체는 산성 환경에서 결정되는데, 여기서 다양한 변형되고 변형되지 않은 핵염기가 구별될 수 있다. 많은 구체예에서, 미지의 핵염기를 확인하는 개시된 방법은 하나 또는 그 이상의 표준 전자 지문을 포함하고, 그리고 미지의 핵염기의 전자 서명을 하나 또는 그 이상의 표준 전자 지문에 정합하는 컴퓨팅 장치를 수반할 수 있다.

개시된 기술은 폴리뉴클레오티드의 5' 단부를 태깅함으로써, 폴리뉴클레오티드 (또는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 핵염기 또는 이들의 조합을 갖는 다른 거대분자)의 3'-> 5' 순서를 결정하는데 이용될 수 있다. 많은 경우에, 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 핵염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 거대분자를 지칭한다. 이것은 일부 구체예에서, 공지된 서열의 5'-와 3'-단부를 갖는 주형을 창출하기 위한 특정한 5' 또는 3' 단부 특정한 프라이머 태그의 결찰 (일부 경우에, T4 리가아제를 이용함으로써)에 의해 달성된다. 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물을 이용하여, 폴리뉴클레오티드 (또는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 핵염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 다른 중합성 분자)의 서열이 확인될 것이고, 이것은 미지의 DNA/RNA/PNA 표본의 지향성을 드러낼 것이다.

본원에서 설명된 미소유체 장치는 2가지 또는 그 이상의 상이한 환경 조건에서 핵염기의 전자 서명의 동시적 또는 거의 동시적 결정을 위해 pH를 변화시키는데 이용될 수 있다. 미소유체 통로를 이용하는 것은 도면 26에 나타나 있는 바와 같이, 단일 DNA 웰로부터 DNA (가령, 단일 가닥 DNA)를 공급할 수 있는데, 여기서 통로는 환경의 pH를 원하는 값으로 변경하고 유지하기 위해 상이한 고분자전해질 (다가음이온 및 다가양이온)로 코팅된다. 이후, 단일 금속 첨단부, 또는 복수의 첨단부 (가령, 평행 염기서열결정에 대해 아래에 설명된 바와 같이)가 상이한 pH 환경 및 다른 생화학적 조건에서 핵염기를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다.

또한, 본원에서 설명된 독특한 전자 지문을 이용하여 복수 미지의 뉴클레오티드/핵염기를 확인하는데 이용될 수 있는 방법이 개시되는데, 여기서 전자 지문은 하나 또는 그 이상의 생물물리학적 전자 파라미터, 예를 들면, HOMO 수준, LUMO 수준, 밴드갭, 전자와 구멍에 대한 파울러 노드하임 전이 전압, 터널링 곡선의 기울기, 전자와 구멍에 대한 터널링 장벽 높이, 전자와 구멍에 대한 장벽 높이에서 차이, 전자와 구멍의 유효 질량, 상이한 생화학적 조건에서 전자와 구멍의 유효 질량의 비율 등에 대한 값을 포함한다. 이들 생물물리학적 전자 파라미터는 미지의, 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드/핵염기를 확인하기 위해 다양한 조합에서 이용될 수 있다. 많은 경우에, 미지의 뉴클레오티드/핵염기의 정체는 고도의 신뢰도에서 결정될 수 있다. 이들 개시된 방법은 군집화 방법의 이용을 포함할 수 있는데, 여기서 다수의 공지된 핵염기/뉴클레오티드에 대한 하나 또는 그 이상의 생물물리학적 전자 파라미터가 전자 지문을 창출하는데 이용되고, 이들은 미지의 핵염기/뉴클레오티드에 대해 결정된 전자 서명과 비교될 수 있다. 많은 경우에, 전자 파라미터는 미지의 핵염기/뉴클레오티드에 대해 결정된 전자 파라미터를 선별하고, 그리고 공지된 뉴클레오티드/핵염기의 유사하게 설정된 지문 (전자 서명에 대해 선택되었던 동일한 파라미터에 대한 값을 포함하는)과 비교하는데 이용될 수 있는 컴퓨터 프로그램에서 전자 데이터로서 저장된다. 이들 개시된 방법은 견실한 염기서열결정 기술과 소프트웨어 분석을 위한 핵염기의 자동화된 염기서열결정과 호출에 이용될 수 있다.

미지의 핵염기의 정체를 결정하는데 유용한 조성물 역시 개시된다. 일부 구체예에서, 핵염기의 정체를 결정하기 위한 기질이 개시되고, 여기서 상기 기질은 부드러운 고도로 정연한 금 기질, 예를 들면, Au(111)일 수 있다. 일부 구체예에서, 기질은 하전되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 이온성 분자, 예를 들면, 폴리-L-리신을 포함하는 용액으로 처리되고, 여기서 이온성 분자는 음성으로 하전된 중합체, 예를 들면, 단일 가닥 DNA를 금 기질에 연결하는데 보조할 수 있다.

뉴클레오티드/핵염기의 화학적 변형 역시 이들 개시된 방법을 이용하여 결정된다. 일부 경우에, 화학적 변형은 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 핵염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 다른 중합성 분자의 이차/삼차 핵산 거대분자 구조를 결정하는데 유용할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 N-메틸 이사토산 무수물 (NMIA), 디메틸 황산염 (DMS), 기타 등등을 이용하여 변형될 수 있다. DNA/RNA/PNA의 화학적 변형은 또한, 후성적 마커 및 핵산 손상을 결정하는데 유용할 수 있다. 일부 경우에, 화학적 변형은 5-카르복시, 5-포르밀, 5- 히드록시메틸, 5-메틸 데옥시, 5-메틸, 5-히드록시메틸, N6-메틸-데옥시아데노신, 기타 등등일 수 있다. 화학적 변형은 개시된 전자 지문을 이용하여, 변형되지 않은 DNA/RNA/PNA 뉴클레오티드와 동시에 결정될 수 있다.

복수 구체예가 개시되긴 하지만, 본 발명의 또 다른 구체예는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 명백한 바와 같이, 본 발명은 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서, 다양한 설명된 양상의 변형을 통해 실시될 수 있다. 따라서, 상세한 설명은 성질에서 예시이고, 그리고 제한하지 않는 것으로 간주된다.

도면의 간단한 설명
도면 1a-g 양자 분자 염기서열결정 (QM-Seq)을 이용하여 DNA, RNA, PNA와 같은 핵산 거대분자의 염기서열결정. (a) 깨끗한 Au (111) 표면 상에 침적된 단일 가닥 (ss) DNA를 보여주는 QuanT -Seq의 예시. 3-단계 압출 침적 계획이 감소된 구성 엔트로피에서, 신장되고 선형화된 DNA와 RNA 분자를 재현적으로 획득하는데 이용된다. QM-Seq 전자 스펙트럼 (터널링 데이터)을 획득하는데 이용된 금속 첨단부는 "판독 헤드"로서 행동한다. (b) QM-Seq는 독특한 전자 지문을 제공하기 위해 뉴클레오티드를 통한 전자와 구멍의 나노전자 터널링을 활용한다. 프론티어 밴드 구조, HOMO와 LUMO 분자 궤도의 계통도가 산성 조건에서 퓨린과 피리미딘에 대해 도시되는데, 여기서 유의미한 차이가 양쪽 핵염기 사이에 관찰될 수 있다 (일정한 비율로 그려지지 않음). 상이한 정도의 접합 및 화학적으로 상이한 핵염기 (여기에서 아데닌과 티민)는 상이한 전자 상태와 에너지 갭을 야기한다. (c-g) 이의 상응하는 화학적 구조를 갖는 각 (데옥시) 리보뉴클레오티드에 대한 대표적인 QM-Seq 스펙트럼 (터널링 데이터). R-은 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA)와 리보뉴클레오티드 (RNA)에 대해 각각, H 또는 OH일 수 있다. 스펙트럼 데이터는 산성 조건에서 계측되었다. 여기에서 도시된 스펙트럼은 DNA 뉴클레오티드 (A,C,G,T) 및 RNA 뉴클레오티드 (U)에 상응한다. 도시된 구조는 (c) (데옥시) 아데노신 5'-일인산염, (d) (데옥시) 구아노신 5'-일인산염, (e) (데옥시) 시티딘 5'-일인산염, (f) 티미딘 5'-일인산염 및 (g) 우리딘 5'-일인산염이다. A, G, C, T/U 뉴클레오티드는 항상, 각각 녹색, 흑색, 청색과 적색으로 표시된다.
도면 2a-b 핵염기, 데옥시뉴클레오시드와 리보뉴클레오시드의 프론티어 분자 궤도: (a) 퓨린 실례로서 아데닌, 데옥시아데노신과 아데노신에 대한; 그리고 (b) 피리미딘 실례로서 시토신, 데옥시시티딘과 시티딘에 대한 B3LYP 기능 세트와 6-311G (2d,2p) 기본 세트로 밀도 기능 이론 (DFT) 계산을 이용한 HOMO, LUMO 분자 궤도 구조. 명암은 파동 함수의 상이한 시기를 지시한다.
도면 3a-f 주사형 터널링 현미경검사 - 주사형 터널링 분광법 (STM-STS)을 이용한 단일 DNA 분자의 염기서열결정. (a) DNA 처리 계획을 보여주는 예시. 변성된 단일 가닥 (ss) DNA는 염기서열결정을 위한 가늘고 긴 선형화된 DNA 주형을 재현적으로 획득하는 압출 침적 기술을 이용하여, 폴리-L-리신으로 변형된 깨끗한 Au (111) 표면 상에 침적된다. (b) 양성으로 하전된 Au (111) 표면 상에 침적된 ssDNA 뉴클레오티드의 지형적 이미지, I-V와 dI/dV 또는 상태 밀도 (DOS) 스펙트럼을 획득하기 위한 STM-STS의 계통도 예시. 전기 터널링 전류 데이터를 이용하여 터널링 확률을 제공하기 위한 단일 뉴클레오티드를 통한 전자 또는 구멍 터널. A, G, C, T 뉴클레오티드는 가능한 경우에, 상이한 명암에 의해 구별된다. (c-f) 중성 pH에서 DNA 뉴클레오티드 (일인산염), 아데노신 5'-일인산염 (c), 데옥시구아노신 5'-일인산염 (d), 데옥시시티딘 5'-일인산염 (e), 그리고 데옥시티미딘 5'- 일인산염 (f)의 화학적 구조.
도면 4a-f DNA 뉴클레오티드에 대해 STM-STS를 이용하여 획득된 전자 지문. (a) 산성 조건 (0.1 M HCl로 세척된 표면) 하에, A, G, C와 T에 대한 HOMO (음성)와 LUMO (양성) 수준의 분포. LUMO 수준의 명백한 분리 (양성 전압 피크)가 퓨린 (A, G)으로부터 피리미딘 (C, T)을 확인하는데 이용되었고, 그리고 HOMO 수준에서 차이가 피리미딘을 분리하는데 이용되었다 (T로부터 C). (b) 산성 조건 하에 LUMO와 HOMO 에너지 수준 사이에 에너지 갭. (c) 산성 (HCl), 중성 (H₂O)과 염기성 (NaOH) pH 조건에서 티민의 HOMO/LUMO 수준. 화살표는 산성, 중성과 염기성 pH 조건 사이에 LUMO 수준의 이동을 지시한다. (d) 산성 조건에서 케토-에놀 호변이성화를 비롯한, 상이한 pH 조건에서 티민의 생화학적 구조, 그리고 중성과 염기성 조건 사이에 산-염기 행태. (e) 전이 전압 (V_트랜스) 및 삼각형 터널링의 기울기 (터널링 에너지 장벽에 비례)에 의해 특징화되는, 산성 조건에서 티민의 전자 파울러 노드하임 플롯. 매우 작은 전압에서, 터널링은 사다리꼴/직사각형이 되고, 따라서 선형 기울기로부터 편차를 보여준다 (기울기는 대수가 된다). (f) 4가지 모든 뉴클레오티드에 대해 산성 조건에서 전자 (V_트랜스,e-)와 구멍 (V_트랜스,h+)에 대한 전이 전압의 확률 밀도 함수. 파울러 노드하임 터널링의 V_트랜스,e- / V_트랜스,h+ 및 기울기 (S)는 각각, HOMO/LUMO 수준 및 그들의 에너지 밴드갭 ("밴드 갭")과 동일한 행태를 보여준다.
도면 5a-f DNA 뉴클레오티드에 대한 전자 지문. (a) 산성 조건 하에 폴리-L-리신-변형된 표면 (0.1 M HCl로 세척된)에서 A, G, C와 T에 대한 계측된 HOMO (음성)와 LUMO (양성) 수준의 상자플롯. 상자플롯은 두 번째와 세 번째 사분위수 (25-75%)를 내포하고, 반면 위스커는 5-95%로부터 데이터를 보여준다. LUMO 수준의 명백한 분리 (양성 전압 피크)가 퓨린 (A, G)으로부터 피리미딘 (C, T)을 확인하는데 이용되었고, 그리고 HOMO 수준에서 차이가 양자화된 분자에서 피리미딘을 분리하는데 이용되었다 (T로부터 C). (b) 산성 조건 하에 LUMO와 HOMO 에너지 수준 사이에 에너지 갭. 이러한 에너지 갭은 중성 분자와 상이할 수 있다. (c) 산성 (HCl), 중성 (H₂O)과 염기성 (NaOH) pH 조건에서 티민의 HOMO/LUMO 수준. (d) 산성 조건에서 케토-에놀 호변이성화를 비롯한, 상이한 pH 조건에서 티민의 생화학적 구조, 그리고 중성과 염기성 조건 사이에 산-염기 행태. (e) 4가지 모든 뉴클레오티드에 대해 산성 조건에서 전자 (V_트랜스,e-)와 구멍 (V_트랜스,h+)에 대한 전이 전압의 분포. V_트랜스,e- - V_트랜스,h+는 각각, HOMO/LUMO 수준 및 그들의 에너지 밴드갭과 동일한 행태를 보여준다. (f) 전이 전압 (V_트랜스,e-) 및 삼각형 터널링의 기울기 (터널링 에너지 장벽에 비례)에 의해 특징화되는, 산성 조건에서 티민의 전자 파울러 노드하임 플롯. 상기 계통도는 낮은 전압에서 직접적인 터널링으로부터 높은 바이어스 전압에서 삼각형 터널링으로의 전이를 보여준다. 매우 낮은 전압 (제로-바이어스 한계)에서, 장벽은 직사각형이 되고, 그리고 터널링 전류는 적용된 바이어스 전압에서 대수 기울기를 보여준다.
도면 6a-d STM-STS를 이용하여 베타 락타마아제 유전자 ampR의 염기서열결정. (a) 산성 조건에서 폴리-L-리신 변형된 금에서 아데닌의 특성화. 녹색 실선은 dI/dV 또는 상태 밀도를 보여주고, 회색 파선은 I-V 데이터이고, 그리고 녹색 점선은 HOMO와 LUMO 에너지 수준의 분포를 보여준다. (b) 1091 nt ampR 유전자에서 단일 ssDNA 분자의 STM 이미지. 이미지는 DNA가 폴리-L-리신 변형된 금 기질의 위에 선형화되고, 쉬운 STS 확인을 허용한다는 것을 보여준다. (c) STM-STS를 이용하여 계측된, 산성 조건 하에 A, G, C와 T의 전자 지문을 이용하여 (b)에서 도시된 강조된 영역 내에서 DNA 뉴클레오티드의 확인. 확인된 뉴클레오티드는 칼라 코딩된다 (흑색: A 또는 G, 청색: C 및 적색: T). (d) (c)로부터 STS 데이터를 이용한 일차 (강조된)와 이차 확인에 근거하여 확인된 ampR 서열.
도면 7a-d RNA 뉴클레오티드에 대한 전자 지문 및 DNA에 비교: (a) 산성 조건에서 RNA 뉴클레오티드의 단일 분자 치수의 앙상블의 HOMO와 LUMO 에너지의 상자플롯, 상자는 25-75%를 포함하고, 반면 위스커는 이들 값의 5% 내지 95%를 보여준다. (b) 퓨린과 피리미딘에 대한 2가지 상이한 에너지 수준을 보여주는, 산성 조건에서 RNA 뉴클레오티드의 계측된 에너지 밴드 갭의 상자플롯. (c-d) DNA와 RNA 상에서 동일한 핵염기에 대한 HOMO/LUMO 에너지 수준의 분포의 비교, (c) 데옥시아데노신과 아데노신 비교, (d) 데옥시시티딘과 시티딘 비교.
도면 8a-e STM-STS를 이용하여 단일 뉴클레오티드 변형의 확인. (a) 산성 조건 하에 디메틸 황산염 (DMS)으로 처리되고 폴리-L-리신 코팅된 Au(111) 기질 상에 침적된 아데닌 소중합체의 STM 이미지. 인접하는 뉴클레오티드 상에서 메틸화된 아데닌과 비메틸화된 아데닌의 손쉬운 확인 (도시된 바와 같이)은 이러한 새로운 염기서열결정 기술을 이용하여 단일 뉴클레오티드 변형을 검출하기 위한 잠재력을 강조한다. (b) DMS로 아데닌 메틸화의 반응 산물, (c) 7-메틸 구아닌 및 개방된-고리를 갖는 이의 가수분해된 산물을 생산하기 위한 구아닌과 DMS의 반응 계획, (d) 비메틸화된 아데닌 (실선) 및 메틸화된 아데닌 (파선)에 대한 산성 조건 하에 HOMO/LUMO 수준의 분포, (e) 구아닌 (실선), 메틸화된 구아닌 (점선) 및 고리-개방된 메틸화된 구아닌 (파선)에 대한 산성 조건 하에 HOMO/LUMO 수준의 분포.
도면 9a-d QM-Seq를 이용하여 단일 뉴클레오티드 변형의 확인. (a) DMS로 시토신 메틸화의 반응 산물. (b) 비메틸화된 시토신 (청색) 및 메틸화된 시토신 (자주색)에 대한 산성 조건 하에 HOMO와 LUMO 위치의 상자플롯 (25-75% 사분위수). 위스커는 5%-95% 백분위수를 보여주고, 중심선은 중앙값이다. (c-d) 비메틸화된 시토신 (c) 및 메틸화된 시토신 (d)의 터널링 스펙트럼 (I-V, 점선 곡선)과 (dI/dV, 실선 곡선). 양쪽은 동일한 수직축 (전압)을 갖는다. 겹쳐진 청색과 자주색 라인은 각 분포에 대하여 피크 위치 상에서 차이를 보여주는 시각 보조이다.
도면 10a-b I-V와 전자 상태 밀도 (dI/dV) 스펙트럼의 계측. (a) 중성 pH에서 시토신에 대한 STS 전류 (I)-전압 (V) 곡선, (b) 피크 위치 (HOMO와 LUMO 에너지 수준) 및 이의 에너지 갭을 보여주는 이의 도함수. 다른 도면에서 도시된 터널링 서명은 개별 핵염기에 대해 계측된 최소한 20개 독립된 분광법 데이터의 앙상블을 나타내는 확률 밀도 함수이다. I-V 스펙트럼의 각 독립된 계측을 위해, 도함수 dI/dV가 HOMO와 LUMO 수준, 그리고 에너지 밴드 갭을 확인하는데 이용되었다. 이들은 이후, HOMO와 LUMO 수준 둘 모두의 에너지 위치, 그리고 에너지 밴드 갭으로부터 정규 분포를 나타내는 확률 밀도 함수를 산출하는데 이용되었다. 전자 서명의 다분산성은 아마도, 구성 엔트로피, 또는 실온에서 열에너지에 의해 보조된 상이한 분자 입체형태를 통한 전하 터널링에 의해 유발된다.
도면 11a-d 상이한 pH 조건 하에 개별 pKa에서 뉴클레오티드의 화학적 구조. 위쪽에서 아래쪽으로, (a) 아데닌 (A), (b) 구아닌 (G), (c) 시토신 (C), 그리고 (d) 티민 (T). 티민은 산성 조건 하에 9.9에서 단일 pKa를 갖고 엔올화와 양자화를 겪을 수 있다.
도면 12 구아닌 LUMO/HOMO 수준에 대한 pH의 효과. 산성 (0.1 M HCl로 세척된), 중성 (H₂O)과 염기성 (0.1 M NaOH) pH에서 Au (111) 표면 상에 침적된 구아닌에 대한 LUMO (양성 피크)와 HOMO (음성 피크) 수준의 분포. 화살표는 산성, 중성과 염기성 조건 사이에 LUMO와 HOMO 수준의 이동을 지시한다. 구아닌은 산성 (pH가 첫 번째 pKa~3.2-3.3 미만이다), 중성과 염기성 조건 (두 번째 pKa~9.2-9.6 초과)에서 3가지 생화학적 구조를 전시한다. 아마도, 이성질체에서 구멍 포획은 pH가 증가함에 따라서 (산성으로부터, 중성 내지 염기성 조건으로), HOMO 수준의 꾸준한 증가 (구멍을 터널링하기 더욱 어려운)를 유발한다. 하지만, 산성과 염기성 조건에서 복수 공명 구조 (도면 11)는 중성 조건과 비교하여, 더욱 쉬운 전자 터널링 (및 더욱 낮은 LUMO 수준)을 유발한다. 게다가, 염기성 조건에서 추가 정전기 척력 (pKa2로 인해)은 전자 터널링 확률을 향상시키고, 그리고 염기성 pH에 대한 LUMO 수준의 더욱 감소를 유발한다.
도면 13a-e 구아닌의 미가공 데이터와 통계: (a) 산성 조건에서 구아닌에 대한 미가공 전류-전압 (I-V) 곡선. (b) (a)의 미가공 스펙트럼 또는 dI/dV, 화살표는 확인된 HOMO/LUMO 수준을 각 스펙트럼에서 첫 번째 유의미한 음성/양성 피크로서 지시한다. (c-e). 데이터 세트에 적합된 정상적인 확률 밀도 함수 (또한, 도면 4a,b에서 도시된 곡선에 의해 지시된)에 의해 겹쳐진, 구아닌에 대한 HOMO (c), LUMO (d)와 에너지 갭 (e)의 위치의 히스토그램. 음영된 상자는 평균 ± 표준 편차를 포함하는 곡선의 구역을 지시한다.
도면 14 아데닌 LUMO/HOMO 수준에 대한 pH의 효과. 산성 (0.1 M HCl로 세척된), 중성 (H₂O)과 염기성 (0.1 M NaOH) pH에서 Au (111) 표면 상에 침적된 아데닌에 대한 LUMO (양성 피크)와 HOMO (음성 피크) 수준의 분포. 아데닌이 임의의 pH 조건에서 복수 공명 구조 (하전된 구조와 하전되지 않은 구조 둘 모두)를 갖긴 하지만, 이의 터널링 확률에 대한 pH의 유의미한 효과가 관찰되지 않는다 (공명 구조 사이에서 전하의 소멸로 인해). 증가하는 pH에서 HOMO 수준에서 경미한 증가는 산성 pH에서 더욱 쉬운 구멍 터널링 (양성 전하로 인해)에 기인할 수 있다.
도면 15a-e 아데닌의 미가공 데이터와 통계: (a) 산성 조건에서 아데닌에 대한 미가공 전류-전압 (I-V) 곡선. (b) (a)의 미가공 스펙트럼 또는 dI/dV, 화살표는 확인된 HOMO/LUMO 수준을 각 스펙트럼에서 첫 번째 유의미한 음성/양성 피크로서 지시한다. (c-e). 데이터 세트에 적합된 정상적인 확률 밀도 함수 (또한, 도면 4a,b에서 도시된 곡선에 의해 지시된)에 의해 겹쳐진, 아데닌에 대한 HOMO (c), LUMO (d)와 에너지 갭 (e)의 위치의 히스토그램. 음영된 상자는 평균 ± 표준 편차를 포함하는 곡선의 구역을 지시한다.
도면 16 시토신 LUMO/HOMO 수준에 대한 pH의 효과. 산성 (0.1 M HCl로 세척된), 중성 (H₂O)과 염기성 (0.1 M NaOH) pH에서 Au (111) 표면 상에 침적된 시토신에 대한 LUMO (양성 피크)와 HOMO (음성 피크) 수준의 분포. 시토신은 2가지 주요 구조에서 명백한 pH 효과를 갖는다: 이의 pKa~4.4 초과에서, 중성과 염기성 조건 사이에 차이 없음이 나타난다. 하지만, 산성 조건에서 이의 양자화된 형태는 아마도 전자 포획 효과를 보여주고, LUMO 에너지 수준을 증가시킨다.
도면 17a-e 시토신의 미가공 데이터와 통계: (a) 산성 조건에서 시토신에 대한 미가공 전류-전압 (I-V) 곡선. (b) (a)의 미가공 스펙트럼 또는 dI/dV, 화살표는 확인된 HOMO/LUMO 수준을 각 스펙트럼에서 첫 번째 유의미한 음성/양성 피크로서 지시한다. (c-e). 데이터 세트에 적합된 정상적인 확률 밀도 함수 (또한, 도면 4a,b에서 도시된 곡선에 의해 지시된)에 의해 겹쳐진, 시토신에 대한 HOMO (c), LUMO (d)와 에너지 갭 (e)의 위치의 히스토그램. 음영된 상자는 평균 ± 표준 편차를 포함하는 곡선의 구역을 지시한다.
도면 18a-d QuanT -Seq를 이용하여 단일 뉴클레오티드 변형의 확인. (a) DMS로 아데닌의 메틸화의 반응 산물. (b) DMS로 구아닌의 메틸화의 반응 산물. (c) 산성 조건 하에 폴리-리신 변형된 Au (111) 표면 상에 침적된 아데닌 및 메틸화된 아데닌에 대한 HOMO와 LUMO 에너지 수준 분포의 상자플롯. 메틸 기의 부가는 구멍 터널링 확률을 감소시킴으로써 HOMO 수준을 이동시킨다. (d) 산성 조건 하에 폴리-리신 변형된 Au (111) 표면 상에 침적된 구아닌 및 메틸화된 구아닌에 대한 HOMO와 LUMO 에너지 수준 분포의 상자플롯.
도면 19a-e 티민의 미가공 데이터와 통계: (a) 산성 조건에서 티민에 대한 미가공 전류-전압 (I-V) 곡선. (b) (a)의 미가공 스펙트럼 또는 dI/dV, 화살표는 확인된 HOMO/LUMO 수준을 각 스펙트럼에서 첫 번째 유의미한 음성/양성 피크로서 지시한다. (c-e). 데이터 세트에 적합된 정상적인 확률 밀도 함수 (또한, 도면 4a,b에서 도시된 곡선에 의해 지시된)에 의해 겹쳐진, 티민 (막대)에 대한 HOMO (c), LUMO (d)와 에너지 갭 (e)의 위치의 히스토그램. 음영된 상자는 평균 ± 표준 편차를 포함하는 곡선의 구역을 지시한다.
도면 20 그라핀 상에 흡착된 아데닌 (핵염기)에 대한 HOMO, LUMO와 에너지 갭 분산에 배치 에너지 기여 - 전도성 기질의 위에 배치된 상이한 형상에서 핵염기의 DFT 시뮬레이션을 설명하는 Ahmed 등으로부터 개작됨, 그리고 DFT 이론에 근거된 국소 상태 밀도에 이의 기여. 라인은 상이한 각도에서 그라핀 상에 흡착된 질소 원자의 국소 상태 밀도 (LDOS)이다 (중심에서 겹쳐진 입체형태). 황색-음영된 영역은 페르미 수준에 근접한 지배적인 피크에 상응한다. 회색-그림자 상자는 모든 가능한 입체형태 (0° 내지 90°)를 고려하여, 페르미 수준에 근접한 우세한 피크 (양성과 음성)의 분포를 나타낸다.
도면 21a-d 파울러 노드하임 플롯으로부터, 전자와 구멍 전이 전압에 대한 pH의 효과 (터널링 및 전계 방출 체제 사이에). 전자에 대한 V_트랜스 (V_트랜스,e-) 및 구멍에 대한 V_트랜스 (V_트랜스,h+)가 (a) 아데닌 (A), (b) 구아닌 (G), (c) 시토신 (C), 그리고 (d) 티민 (T)에 대해 도시된다. 화살표는 산성 (HCl), 중성 (H₂O)과 염기성 (NaOH) 조건 사이에 V_트랜스,e-와 V_트랜스,h+의 이동을 지시한다. 이들 모든 전이는 LUMO와 HOMO 수준에서 개별 변화를 모의하고, 따라서 한 가지 잠재적 생물물리학적 성능 지수로서 V_트랜스의 역할을 확증한다.
도면 22a-c DNA 뉴클레오티드 구아닌, 시토신과 티민의 터널링 성질. I-V (파선), dI/dV 또는 상태 밀도 (실선), 그리고 구아닌 (a), 시토신 (b)과 티민 (c)에 대한 LUMO와 HOMO 수준의 확률 분포 (점선). 점선은 LUMO와 HOMO 에너지 수준 둘 모두에 대해 적합된 정상적인 확률 분포 함수이다.
도면 23a-b 압출 침적 기술을 이용한 ssDNA의 선형화. 압출 없이 벌거벗은 금 (a) 상에, 그리고 압출된 폴리-L-리신 변형된 금 (b) 상에 침적된 ssDNA의 STM 이미지. 폴리-L-리신 코팅 및 우리의 압출 침적 계획의 역할은 이러한 STM 데이터에서 명확하게 가시적인데, 여기서 선형화된 DNA는 단일 뉴클레오티드의 명백한 STS 확인을 허용한다 (도면 25).
도면 24a-b STM-STS를 이용한 단일 뉴클레오티드 변형의 확인. (a) DMS로 시토신의 메틸화의 반응 산물. (b) 산성 조건 하에 폴리-리신 변형된 Au (111) 표면 상에 침적된 시토신 및 메틸화된 시토신에 대한 HOMO와 LUMO 에너지 수준 분포. 메틸 기의 부가는 구멍 터널링 확률을 감소시킴으로써 HOMO 수준을 이동시킨다.
도면 25 단일 분자 DNA 검출 능력. 생리학적 농도를 모의하기 위해 낮은 농도의 ssDNA (이중 증류수 또는 TE 완충액 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄-에틸렌디아민테트라아세트산 (또는 EDTA) 완충액에서 1-5 nM)를 이용하여, 개시된 기술에 의해, 여러 DNA 선형화된 가닥이 STM-STS 염기서열결정을 이용하여 검출될 수 있다. 여기에서 도시된 표본 주사에서, DNA 분자는 울트라스무드 Au(111) 기질 상에서 작은 주사 구역 (1μm x 1μm) 내에서 발견되었다. 이것은 매우 낮은 농도의 DNA 분자를 검출하고 염기서열결정하는 이러한 염기서열결정 기술의 능력을 증명한다.
도면 26 미소유체 장치에서 통로를 형성하는 기질을 묘사한다. 통로 치수 (너비)는 100 나노미터 (nm=10^-9 m) 내지 50 마이크로미터 μm 사이에서 변할 수 있다.
도면 27a-c (a)는 단순한 광학적 석판인쇄, 그 이후에 비등방성 KOH 에칭을 이용하여, 센티미터 규모 광학적으로 창출된 첨단부 패턴의 그림이다. (b) 금으로부터 만들어진 높은 충실성의 주기적으로 패턴화된 STM 첨단부를 보여주는 SEM 이미지. 큰 구역 (cmXcm) 규모를 이용하여, 울트라플랫/울트라스무드 기질, 2 μm x 2 μm 표면 상에 STM 칩이 주사될 수 있고, 그리고 본 도면에서 도시된 것들과 유사한 대량 평행 주사 및 칩으로부터 단순한 판독에 의해, cm 규모 이상에서 전체 서열을 창출한다. (c)는 1 메가픽셀 (또는 1 메가팁) 2cm X 2cm 칩이 도시된다. 전압이 복수의 첨단부에 동시에 적용될 수 있고, 전류가 수집되고 저장되고, 그리고 복수의 첨단부로부터 모든 전류 값이 동시에 판독될 수 있다 (CCD 카메라와 유사). 전류가 판독된 후에, 대형 2cm X 2cm 기질에 걸쳐 전체 전류 전압 곡선을 재현하기 위해 다른 바이어스 전압이 적용될 수 있고, 그리고 기타 등등일 수 있다. 수 천 개의 유전체가 미소유체 통로에서 배치되고, 선형화되고, 동시에 판독될 수 있다. 피에조는 다음 핵염기의 염기서열결정을 허용하기 위해, 표본을 몇 옹스트롬 이동시키는데 이용될 수 있고 - 그리고 이러한 과정은 추가 핵염기를 분석하기 위해 반복될 수 있다. 이런 이유로, 단일 2 마이크로미터 주사 움직임 (또는 피에조 주사)에서, 대량 평행 서열분석기는 단순한 미소유체 장치를 이용하여 패턴화된 상대적으로 큰 표본 바이오칩 상에서 모든 가능한 핵염기를 염기서열결정할 수 있다.
도면 28 자동 방법에 의한 염기 호출의 방법을 보여주는 계통도.
도면 29 반응성에 근거된 구조 결정. 이차/삼차 핵산 구조 (여기에서 RNA)는 RNA SHAPE 및/또는 DMS 분자로 화학적 변형의 전자 지문을 이용하여, 그리고 SHAPE 또는 DMS가 반응했던 구속된 단일 가닥 영역에서 RNA 구조 소프트웨어를 이용하여 획득되었다.
도면 30 RNA 구조 결정 동안 반응된 뉴클레오티드 대 반응하지 않은 뉴클레오티드의 배정.
도면 31 군집화 방법은 높은 신뢰도에서 RNA 뉴클레오티드를 배정한다. 대각선은 정확한 염기 호출을 지시한다. 대문자에서 문자는 변형되지 않은 RNA 뉴클레오티드이고, 소문자에서 문자는 변형된 RNA 뉴클레오티드이다.
도면 32 QM-Seq로 실험적으로 계측된 HIV-RNA분해효소의 RNA 구조 (위쪽 패널). 아래쪽 패널은 RNA 접힘 소프트웨어를 이용하여 예측된 인실리코 구속되지 않은 RNA 구조를 보여준다.
도면 33 (위쪽) 3가지 파라미터 전자 상태 (HOMO-LUMO-에너지 갭)를 이용하는 것, 그리고 (아래쪽) 다차원 생물물리학적 파라미터 (HOMO, LUMO, 에너지 갭, 전자와 구멍에 대한 터널링 장벽 높이, 터널링 장벽 높이에서 차이, 전자와 구멍에 대한 직접적인 터널링으로부터 파울러 노드하임 터널링으로의 터널링 장벽 프로필에서 변화에 상응하는 전압, 뉴클레오티드 터널링에서 전자와 구멍의 유효 질량, 효과적인 전자와 구멍 질량의 비율, 상응하는 파울러 노드하임 플롯의 기울기가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 >9 파라미터)를 이용하여 것 사이에 비교, 이들 모두 양자 터널링 분광법 주사로부터 계산되고, 그리고 HIV-1 RNA분해효소에서 QM-Seq에 의해 획득된 전자 지문으로서 이용됨. 이들 전자 상태는 RNA 퓨린과 피리미딘 사이에 확인에서 도움을 줄 수 있지만, 다변수 전자 지문은 본 도면 (아래쪽)에 나타나 있는 바와 같이, 높은 정밀도에서 4가지 모든 핵염기의 독특한 확인을 허용한다.
도면 34a-h 산성 조건에서 폴리-리신 코팅된 울트라플랫 Au(111) 기질 상에서 결정된 DNA 뉴클레오티드 (A,T,G,C) 확인을 위한 전자 지문으로서 이용된 상이한 생물물리학적 파라미터. a) LUMO-수준 b) HOMO-수준 c) 전자에 대한 장벽 높이 d) 구멍에 대한 장벽 높이 e) 분자에 대한 전체 터널링 장벽 높이 f) 개별 뉴클레오티드를 통한 전하 터널링에 대한 효과적인 전자와 구멍 질량의 비율. g) 전자와 h) 구멍에 대한 직접적인 터널링으로부터 파울러 노드하임 터널링으로의 전이 전압.
도면 35a-h 중성 조건에서 변형된 Au(111) 기질 상에서 RNA 뉴클레오티드 (A,U,G,C) 확인을 위한 전자 지문으로서 이용된 상이한 생물물리학적 파라미터. a) LUMO-수준 b) HOMO-수준 c) 전자에 대한 장벽 높이 d) 구멍에 대한 장벽 높이 e) 분자에 대한 전체 터널링 장벽 높이 f) 개별 뉴클레오티드를 통한 전하 터널링에 대한 효과적인 전자와 구멍 질량의 비율. g) 전자와 h) 구멍에 대한 직접적인 터널링으로부터 파울러 노드하임 터널링으로의 전이 전압.
도면 36 자동 방법에 의한 염기 호출의 방법을 보여주는 계통도.
도면 37 핵염기의 정체, 기질 상에서 이의 위치, 그리고 폴리뉴클레오티드에서 이의 서열을 결정하기 위한 방법의 구체예를 보여주는 흐름도.

상세한 설명

본 발명 이전에, 터널링 분광법을 이용하여 DNA 염기서열결정을 위한 과제는 각 뉴클레오티드에 대한 독특한 터널링 스펙트럼을 확인하는 것이었다. DNA 뉴클레오티드의 양자 터널링 분광법은 개별 핵염기, 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 전자 상태 밀도를 나타낸다. 미지의 뉴클레오티드의 확인을 보조하기 위해 정체가 알려져 있지 않은 뉴클레오티드 (미지의 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 핵염기)의 전자 서명과 비교하여 이용을 위한 변형되고 변형되지 않은 DNA와 RNA 핵염기, 뉴클레오시드와 뉴클레오티드에 대한 독특한 지문을 결정하는데 이용되는 방법, 장치, 그리고 조성물이 본원에서 개시된다. 단일 가닥 (ss) DNA와 이중 가닥 (ds) DNA 둘 모두로부터 뉴클레오티드를 확인하려는 이전 시도는 전반적으로, 4가지 DNA 핵염기, 뉴클레오시드와 뉴클레오티드에 대한 독특한 터널링 스펙트럼을 결정하는데 실패하였다.

개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 또한, RNA를 염기서열결정하는 기존 방법의 한계를 경감하는데 보조한다. 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 단일 분자 수준에서 비-증폭된 주형으로, RNA의 직접적인 염기서열결정에서 이용될 수 있다. 많은 경우에, 본 발명은 세포 또는 조직으로부터 획득된 RNA 분자의 정체와 존재비를 결정하는데 보조할 수 있다. 게다가, 본 발명에서 단일 분자의 뉴클레오티드 (DNA/RNA) 변형에 대한 독특한 전자 터널링 스펙트럼 (터널링 데이터)의 확인은 질환의 초기 검출을 위한 유용한 후생유전체학 기술을 제공할 수 있다. 후생유전체학 연구는 유전체의 역동 상태, 특히 질환 상태와 발달 생물학을 결정하는데 있어서 그들의 역할에 관한 통찰력을 제공할 수 있다.

개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 잡음이 거의 없이, 고도로 재현가능한 터널링 데이터 또는 I-V 데이터의 수집을 제공한다. 이전 방법은 재현성의 결여 및 낮은 신호 대 잡음 비율을 겪었다. 본원에서 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 증강된 데이터 수집을 다양한 방식으로 제공한다. 가령, 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 이온성 중합체로 코팅되는 울트라스무드 하전된 표면을 이용한다. 한 구체예에서, Au(111) 하전된 표면은 폴리-리신으로 코팅될 수 있다. 이온성 중합체의 이용은 핵산 중추를 정향시키는데 보조할 수 있는데, 이것은 터널링 데이터에 이전 방법보다 더욱 큰 재현성 및 더욱 높은 신호 대 잡음 비율을 제공할 수 있다. 이에 더하여, 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 지문 데이터를 수집하기 위해 규정된 환경을 이용할 수 있다. 가령, 개시된 방법, 장치, 그리고 조성물은 다양한 변형되고 변형되지 않은 핵염기, 뉴클레오티드와 뉴클레오시드를 구별하는데 보조하기 위해, 양자 터널링을 높은 또는 낮은 pH 환경에서 수행할 수 있다. 규정된 환경의 이용은 또한, 획득된 터널링 데이터를 증강하는데 보조할 수 있다.

나노전자 터널링은 나노규모에서 발생하는 양자-물리적 과정이다. 나노전자 터널링은 별개의 원자 또는 분자의 파동 함수가 중복되는 경향을 이용한다. 전압 바이어스, 또는 바이어스가 적용되면 (기질의 원자 근처에 이들 원자와 접촉하여 배치된 금속 첨단부의 전위를 증가시키거나 또는 줄임으로써), 첨단부 및 원자/분자 사이에 전자 또는 구멍 중에서 어느 한쪽의 터널링이 심지어 전위 장벽 위에서 일어날 수 있다. 고전적 전하 전도가 높은 전위의 영역으로부터 낮은 전위의 영역으로 명목상으로 발생하긴 하지만, 이들 두 영역이 하류 전위 바이어스 (높은 전위로부터 낮은 전위로의 전류 흐름)에 의해 분리된 상태에 있는 경우에, 양자 터널링이 전위 장벽 높이 위에서 물리적 접촉 없이 발생하고 (따라서, 분자 상태의 밀도가 계측에 의해 비섭동된다), 그리고 터널링 확률이 장벽 높이가 증가함에 따라서 감소된다. 전자는 파동 함수 중복으로 인해 이들 분자 중에서 하나로/하나로부터 주입 (전자 터널링)되거나 또는 추출 (구멍 터널링)될 수 있다.

뉴클레오티드의 터널링 전류 스펙트럼은 전자 상태 밀도를 나타낸다. 뉴클레오티드 확인에서 이용을 위한 독특한 지문을 창출하기 위한 터널링 전류 데이터의 용도가 본원에서 개시된다. 여러 시도가 모형화에 의해, 그리고 단일 가닥 (ss) DNA와 이중 가닥 (ds) DNA, RNA, PNA 둘 모두, 다른 핵산 거대분자, DNA/RNA/PNA 뉴클레오티드 변형, 핵산 구조로부터 상이한 뉴클레오티드를 확인하고 구별하는 실험에 의해 이루어졌다. 하지만, 본 발명 때까지, 단지 구아닌 (G) 염기만 ssDNA에서 터널링 현미경검사를 이용하여 부분적으로 성공적으로 확인되었다.

단일-분자 DNA/RNA/PNA 염기서열결정을 이용하여 수행된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기 A, G, T, C와 U의 독특한 전자 지문을 결정하는 첫 번째 입증이 본원에서 제공된다. 이에 더하여, 변형된 뉴클레오티드/핵염기의 독특한 지문 역시 개시된다. 핵염기는 시토신 ("C"로서 약칭됨), 구아닌 ("G"로서 약칭됨), 아데닌 ("A"로서 약칭됨), 티민 ("T"로서 약칭됨), 그리고 우라실 ("U"로서 약칭됨)을 지칭할 수 있다. C, G, A와 T는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 발견될 수 있고, 그리고 C, G, A와 U는 리보핵산 (RNA)에서 발견될 수 있다. 도면 1은 뉴클레오티드 A, G, C, T와 U에 대해 양자 터널링 분광법에 의해 결정된 전자 지문을 보여준다. 용어 뉴클레오시드, 뉴클레오티드와 핵염기는 교체가능하게 이용되고 자연과 합성, 그리고 변형되고 변형되지 않은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드와 핵염기를 지칭한다.

개시된 기술은 정체를 결정하는데 보조하는 미지의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기에 대한 전자 서명을 창출하기 위해 양자 터널링 데이터를 이용하고, 그리고 실온에서 (즉, 약 20-25℃), 또는 1K 및 300K 사이에 한랭발생 온도에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기의 전자 상태가 생물물리학적 조건, 또는 환경, 예를 들면, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 핵염기가 분석되는 pH에 따라 이동할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 핵염기의 상이한 상태가 산성 pH (즉, 약 7보다 적은 pH)에서 확인될 수 있다. 많은 구체예에서, 전자 파라미터를 결정하는데 이용된 환경의 pH는 약 3보다 적다.

변형되고 변형되지 않은 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기의 지문은 다양한 생물물리학적 조건 또는 환경에서 결정될 수 있는데, 이들은 그들의 전자 상태를 이동시킬 수 있다. 이것은 일부 생물물리학적 조건 하에 유사한 또는 중복 파라미터 값을 가질 수 있는 핵염기를 구별하는데 보조할 수 있다. 이것은 핵염기를 동일한 환경에서 결정된 공지된 핵염기의 서명에 비교함으로써, 핵염기를 확인하는데 보조할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 핵염기의 지문은 소정의 pH에서 결정되고, 그리고 동일한 pH에서 획득된 공지된 핵염기의 지문과 비교될 수 있다. 다른 환경에서, 지문은 pH 이외에 특수한 특징, 예를 들면, 몰농도, 극성, 소수성 등을 갖는 환경에서 결정될 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵염기는 소정의 양의 알코올, 염, 또는 비극성 용매 또는 용질을 포함하는 환경에서 결정될 수 있다.

본원에서 개시된 바와 같이, "터널링 전류 데이터" 또는 "전류 데이터" 또는 "I-V 데이터"는 다양한 바이어스 전압에서 양자 터널링에서 계측된 전류와 전압 (바이어스 전압) 데이터를 지칭한다. 터널링 전류 데이터는 터널링 전류 계측으로부터 획득된 I-V, dI/dV 및/또는 I/V² 데이터를 지칭할 수 있다. 많은 경우에, 다양한 파라미터 또는 값이 터널링 전류 데이터로부터 도출된다. 파라미터는 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV) (아래에 설명됨)에 대한 값을 포함할 수 있다.

본원에서 개시된 바와 같이, "서명" 또는 "전자 서명"은 미지의 정체의 뉴클레오티드에 대해 수집된 I-V 데이터로부터 도출된 파라미터에 대한 3가지 또는 그 이상의 값을 지칭한다. 서명을 창출하는데 이용을 위한 파라미터는 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)를 포함하고, 이들 중에서 임의의 3가지 또는 그 이상이 서명을 창출하는데 이용될 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 미지의 뉴클레오티드의 전자 서명은 LUMO, HOMO와 밴드갭에 대한 값을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 전자 서명은 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)에 대한 값을 포함할 수 있다.

본원에서 개시된 바와 같이, "지문" 또는 "전자 지문"은 공지된 정체의 뉴클레오티드에 대해 수집된 I-V 데이터로부터 도출된 파라미터에 대한 3가지 또는 그 이상의 값을 지칭한다. 공지된 뉴클레오티드에 대한 지문을 창출하기 위해 선별된 파라미터는 미지의 뉴클레오티드에 대한 서명을 창출하기 위해 선별된 것들과 동일한데, 공지된 뉴클레오티드가 이들과 비교된다. 전자 서명을 창출하는데 이용된 소정의 파라미터에 대한 값은 값 +/- 표준 편차로서, 또는 다양한 값으로서 표현될 수 있다. 지문을 창출하는데 이용을 위한 파라미터는 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)를 포함한다. 일부 구체예에서, 미지의 핵염기에 대한 전자 서명은 LUMO, HOMO와 밴드갭에 대한 값을 포함할 수 있고, 그리고 이러한 서명은 공지된 핵염기의 전자 지문과 비교될 수 있는데, 여기서 이들 지문은 동일한 파라미터 - LUMO, HOMO와 밴드갭에 대한 값을 포함한다. 다른 구체예에서, 서명은 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)에 대한 값을 포함할 수 있고, 그리고 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φe- (eV), Φh+ (eV), me-/mh+ 및 △Φ (eV)에 대한 값을 포함하는 지문과 비교될 수 있다.

개시된 기술은 다중핵산, 폴리뉴클레오티드, 그리고 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 핵염기를 포함하는 기타 중합성 분자를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다.

많은 경우에, 불꽃-어닐링된 편평한, 주형-스트립드 울트라스무드 금 (111) 결정면 기질이 이용될 수 있다. 여기서 지정 (111)은 금 원자의 노출된 위쪽 표면의 결정 구조를 지시한다. 다른 정향 역시 이런 목적으로 이용될 수 있다 (가령, 100). 울트라스무드 기질은 매우 낮은 표면 거칠기, 예를 들면, 평면 표면으로부터 약 1.0 nm보다 적은 변이를 갖는다. 아래에 설명된 바와 같이 불꽃 어닐링 및 주형 스트리핑 과정을 이용하여 울트라스무드 기질을 획득하기 위한 방법이 본원에서 설명된다. 일부 구체예에서, 다른 기질이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 다른 전도성 기질, 예를 들면, 그라핀, 고도로 정연한 열분해 흑연 (HOPG), 금 (또는 다른 금속) 코팅을 갖는 원자적으로-편평한 새로 쪼개진 운모, 구리와 같은 다른 울트라스무드 금속 (111), 은 등이 이용될 수 있다. 많은 경우에, 기질은 주사와 양자 터널링 분광법의 목적으로 전도성이어야 하고, 그리고 단일 분자의 쉬운 확인을 위해 부드러워야 한다.

일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 선형화된 DNA일 수 있고, 그리고 폴리뉴클레오티드는 개시된 울트라스무드 기질 상에서 끄집어내질 수 있다. 이것은 개별 뉴클레오티드를 분리하고 주사를 위한 그들의 구성 엔트로피를 감소시키는데 보조할 수 있다. 이것은 당 중추 대신에, 핵염기를 통한 전하 터널링의 연구를 보조할 수 있다. 일부 경우에, 기질은 하전된 기질일 수 있다. 가령, 기질이 금인 경우에, 양성으로 하전된 금 (111) 표면이 제조될 수 있다.

일부 구체예에서, 양성으로 하전된 금 기질은 압출 침적 기술에서 이용을 위해 생산된다. 먼저, 새로 제조된 울트라스무드 금 (111) 표면이 균일하게 음성으로 하전된 표면을 준비하기 위해, 플라즈마 클리너 (가령, 오존 플라즈마 클리너)에서 처리된다. 많은 구체예에서, 금은 이후, 균일하게 코팅된 양성으로 하전된 금 표면을 산출하기 위해, 이온성 용액, 예를 들면, 양성으로 하전된 분자, 예를 들면, 폴리-L-리신으로 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 압출-침적 기술은 가늘고 긴 선형 ssDNA를 금 기질 상에 분산시키기 위해 3 단계 과정을 수반한다. 첫 번째 단계에서, 금 (111) 표면이 이를 화학 용액으로 처리함으로써 하전될 수 있다. 일부 경우에, 금 표면은 이를 폴리-L-리신, 예를 들면, 10ppm 폴리-L-리신 용액으로 코팅함으로써 양성으로 하전될 수 있다. 울트라스무드 표면을 코팅하는데 이용하기 위한 다른 분자는 임의의 다가양이온성 중합체, 예를 들면, 폴리알릴아민 염산염, 카테콜라민 중합체, 아미노프로필에톡시실란과 같은 아미노 실란, 또는 3' 글리시독시 프로필트리메톡시실란과 같은 에폭시드 변형된 실란을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 당-중추의 음성 전하의 정전 고정은 전압을 적용하여 이러한 중추를 기질에 전기적으로 결합함으로써 수행될 수 있다. 일부 경우에, 화학 용액은 음성으로 하전된 인산염 중추를 정전 상호작용을 통해, 양성으로 하전되는 기질에 연결하는데 보조할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 염기서열결정하는데 이용된 구체예에서, 산성 조건은 뉴클레오티드, 예를 들면, 피리미딘 C 또는 T, 그리고 퓨린 - G 또는 A를 디콘볼루션하는데 보조할 수 있다.

압출-침적 기술에서 두 번째 단계는 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 융해시키는 것을 수반할 수 있다. 가령, ssDNA는 ssDNA를 예로서, 95℃에서 5 분 동안 가열함으로써 융해될 수 있다. 대부분의 구체예에서, 융해된 ssDNA는 급속히 냉각되는데, 이것은 ssDNA에서 이차 및/또는 삼차 구조의 형성 또는 재형성을 예방하는데 보조할 수 있다. 일부 구체예에서, 급속한 냉각은 얼음 위에서 5 분 동안 플래시 냉각을 수반할 수 있다. 많은 구체예에서, dsDNA 및 짧은 모노뉴클레오티드 ssDNA는 삼차 구조를 내포할 수 없다; 약 1 kb보다 긴 ssDNA는 이차 구조를 형성할 수 있다. 많은 경우에, 양성으로 하전된 표면은 이차 구조의 형성을 교란하거나 또는 예방하는데 도움을 줄 수 있다.

압출-침적 과정에서 세 번째 단계는 ssDNA를 금 기질 상에 압출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 병진 운동이 선형화된 DNA 사슬을 하전된 기질 상에 침적시키고, 그리고 이를 DNA 분여 장치, 예를 들면, 피펫으로부터 끄집어내는데 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 화학적으로-에칭된 첨단부가 나노전자 터널링에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 백금-이리듐 첨단부 (80:20 Pt-Ir)가 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 다른 적합한 STM 첨단부 역시 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 일부 다른 통상적으로 이용되는 첨단부는 텅스텐, 금, 탄소와 백금 금속이다. 통상적으로 이용되는 다른 첨단부는 Pt, I, W, Au, Ag, Cu, 탄소 나노튜브 및 이들의 조합이다.

공지된 뉴클레오티드 및 미지의 뉴클레오티드는 이들 뉴클레오티드를 통한 전자와 구멍을 터널링함으로써 연구된다. 일부 경우에, 연구된 뉴클레오티드는 도면 1a,b에서 묘사된 바와 같이, 선형화된, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다.

터널링 전류 분광법 (전류 (I)-전압 (V))은 분자의 국소 전자 상태 밀도 (dI/dV 스펙트럼, 도면 10 및 아래에 더욱 상세하게 설명됨)의 직접적인 척도일 수 있고, 그리고 뉴클레오티드의 생화학적 구조에 근거하여 독특한 전자 지문을 제공하는데 조력할 수 있다 (도면 1).

전자 서명은 분자 분해능에서, 양자 터널링을 이용하여 뉴클레오티드에 대해 획득된다 (도면 10a). 일부 경우에, 전자 상태 밀도 (DOS)는 전류 전압 (I-V) 스펙트럼의 일차 도함수, 그리고 각각, 최저준위 비점유 분자 궤도 (LUMO) 에너지 수준 및 최고준위 점유 분자 궤도 (HOMO) 에너지 수준으로서 배정된 첫 번째 유의미한 양성 피크와 첫 번째 유의미한 음성 피크로부터 획득될 수 있다. 많은 경우에, 첫 번째 유의미한 피크는 최고 dI/dV, 또는 전류 전압 스펙트럼의 일차 도함수 (여기서 일차 도함수는 전자와 구멍 터널링에 대한 생체분자의 상태 밀도를 나타낸다)의 최소한 약 30%이고 약 ±1.0 V보다 큰 피크이다. 일부 경우에, 약 ±1.0 V (0과 +1.0 V 또는 0과 -1.0 V 사이에)보다 적게 발생하는 피크는 전도성 기질 또는 주변 환경으로부터 경미한 오염을 지시할 수 있다. 이들 첫 번째 피크 사이에 차이는 LUMO/HOMO 에너지 갭 또는 "밴드 갭"으로서 배정 (지정)될 수 있다 (도면 10b). 전자 터널링 피크 (여기에서 양성 바이어스 전압의 적용 시에)는 LUMO 수준에 상응하고, 그리고 구멍 터널링 피크 (여기에서 음성 바이어스 전압의 적용 시에)는 분자의 HOMO 수준에 상응한다. LUMO와 HOMO 수준 사이에 차이는 분자의 에너지 밴드갭이다.

각 핵염기에 내재성인 추가 생물물리학적 파라미터 또한, 변곡점에서 전이 전압 (V_트랜스)에 의해 분리된 2가지 상이한 터널링 체제 (직접적인 터널링 및 파울러 노드하임 터널링)를 이용하여 계산될 수 있다. 양자 터널링에 대한 2가지 주요 모형이 슈뢰딩거 방정식에 적용된 WKB 근사에 근거하여 개발되었다. 인슐레이터에 의해 분리된 전극 사이에 터널링에 대한 시몬스 모형 (방정식 1)은 양쪽 체제에서 터널링 전류, 적용된 바이어스 전압에서 이의 의존 및 본래 터널링 장벽의 효과를 설명한다.

(방정식 1)

여기서

는 직사각형으로부터 사다리꼴과 삼각형으로의 터널링 장벽 변화의 모양으로서 적용된 전압에 비례하는 평균 장벽 높이이고, m^*은 효과적인 전자 질량이고,

는 감소된 플랑크 상수이고,

는 평균 터널링 거리이고, A는 효과적인 터널링 면적이고, q는 기본 전하이고, 그리고 V는 적용된 바이어스 전압이다. 상기 모형은 터널링 장벽의 임의의 모양에 대해 일반적인데, 그 이유는 단지 평균 장벽 높이만 필요하기 때문이다 (

).

양자 터널링에 이용된 다른 분석적 접근법은 스트래튼 모형 (방정식 2)에 근거되는데, 이것 또한 WKB 근사로부터 도출된다. 시몬스와 스트래튼 모형 둘 모두 동일한 전류 밀도 설명으로부터 시작되긴 하지만, 이들은 상이한 방정식 세트를 산출하는 터널링 확률 적분을 해결하기 위해 상이한 근사를 취하였다. 양자 터널링을 설명하기 위한 스트래튼 방정식은 아래와 같다:

(방정식 2)

여기서 m은 전자 질량이고, k는 볼츠만 상수이고, T는 온도이고, 그리고 b(V)와 c(V)는 터널링 확률의 Taylor 확대로부터 결과의 2가지 파라미터이고 아래와 같이 규정된다:

및

여기서

및 x₁과 x₂는 터널링 갭의 각 면에 대해

인 위치이고,

는 전극의 페르미 에너지이고, 그리고

는 에너지 장벽 (x와 V 의존성)이다.

이들 파라미터가 터널링 전류의 온도 의존과 실험적으로 적합될 수 있긴 하지만, 상기 모형은

의 형태로 단순화되었는데, 그 이유는 이것이 여기에서 이용된 염기서열결정 조건을 설명하기 때문이다. 이러한 관계를 이용하여, 우리는 ln(I/V²)에서 최소 (V_트랜스) 대 V^-1 플롯을 소수의 퍼센트 오차 내에서 아래의 방정식으로서 도출하였다:

(방정식 3)

시몬스 모형을 이용하여, 단순화된 파울러 노드하임 방정식이 높은 바이어스 전압 (qV > Φ₀)에 대해 도출된다. 이것은 아래의 형태를 취한다:

(방정식 4)

양쪽 모형을 합동하면, FN 플롯으로부터 직접적으로 도출된 실험 데이터를 이용하여 본래 장벽 높이 (Φ₀) 및 "효과적인" 터널링 거리 (

)의 직접적인 계산을 위한 표현을 도출할 수 있다:

여기서 S는 높은 바이어스 전압 (qV > Φ₀)에서 상응하는 ln(I/V²) 대 V^-1의 기울기이다. 주목할 점은 스트래튼와 시몬스 둘 모두 슈뢰딩거의 동일한 근사 (WKB)를 이용하고, 그리고 단지 차이가 터널링 확률 적분의 처리에만 있다는 것이다. 하르트만은 WKB 근사의 정확한 해법에 대하여 양쪽 모형을 비교하였고, 그리고 스트래튼과 시몬스 모형 둘 모두 정확한 해법으로부터 오차의 소수 백분율 범위 안에 있다. 이러한 근사로, 양쪽 모형을 이용하여, 실험적 분광 데이터가 어느 한쪽 모형에서 적합될 수 있는데, 이것은 만약 그렇지 않으면, 양쪽 모형의 비선형성의 처치 곤란으로 인해 불가능할 것이다.

이러한 방법은 최대 9가지 파라미터 (HOMO 전압, LUMO 전압, 에너지 밴드갭 V_{트랜스, e-}, V_{트랜스, h+}, Φ_0,e-, Φ_0,h+, △Φ 및 m_{eff e-}/m_{eff h+})를 조사함으로써 뉴클레오티드의 정량적 비교를 허용한다. 많은 구체예에서, 서명은 최소한 3가지 파라미터에 대한 값을 분석함으로써 결정될 수 있다. 대부분의 구체예에서, 3가지 보다 많은 파라미터가 서명을 결정하는데 이용된다. 가령, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9가지 파라미터 값이 동일한 파라미터 값을 포함하는 지문과의 비교를 위한 서명을 결정하는데 이용될 수 있다.

뉴클레오티드 지문과 서명은 뉴클레오티드를 양자 터널링에 제출하고, 그리고 이후, 터널링 전류 데이터를 수집하고 분석함으로써 결정된다. 많은 경우에, 양자 터널링 뉴클레오티드 지문을 창출하기 위해, 터널링 전류 데이터가 개별 뉴클레오티드 분자 (가령, 아데닌의 단일 분자) 상에서 약 15 내지 약 50개 포인트로부터 수집된다. 이에 더하여, 양자 터널링 데이터는 약 20개의 상이한 개별 분자에 대해 수집되는데, 이것은 뉴클레오티드의 통계학적으로 정확한 지문을 창출하는데 보조할 수 있다.

DNA 여러 공지된 뉴클레오티드의 확률 밀도 곡선 (확률 밀도 함수 (dI/dV)와 대비하여 전압, V, 또는 에너지, eV)이 결정되었다. 여러 확률 밀도 곡선은 도면 4a, 4b, 4c, 4f, 8d, 8e, 12, 14, 16, 21, 22, 그리고 24b에서 도시된다. 이들 곡선은 독립된 계측의 통계학적 분포인데, 이들은 가우스 곡선의 정규화된 합계에 적합되었다 (방정식 S1, 아래. Ni: 정규화 상수, V: 적용된 바이어스 전압, μi: 평균, σi: 표준 편차).

방정식 S1

이들 파라미터는 HOMO 수준, LUMO 수준, 그리고 에너지 갭 (밴드 갭)으로 구성되는, 소정의 뉴클레오티드에 대한 전자 지문을 창출하는데 이용될 수 있다. 많은 구체예에서, 공지된 핵염기의 핵염기 지문은 뉴클레오티드의 정체 및 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해, 미지의 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 DNA 분자로부터 수집된 양자 터널링 서명을 분석하는데 이용될 수 있다.

핵산 생화학은 핵산이 발견되는 환경에 의해 규정될 수 있다. 일부 경우에, 주변 pH가 핵산, 예를 들면, 핵염기/뉴클레오티드의 구조에 영향을 줄 수 있다. 일부 구체예에서, pH를 변경하는 것은 상이한 구조를 갖는 핵염기를 유발할 수 있다. 이러한 효과는 도면 11에 나타나 있는 바와 같이, 핵염기의 pKa 초과 및/또는 미만에서 일어날 수 있다. 부가적으로, 산-염기 행태 이외에, 다른 생화학적 변화가 극단적 pH (산성 또는 염기성)에서 일어날 수 있다. 가령, 티민은 산성 pH에서 호변체를 형성할 수 있는데, 여기서 엔올화된-T가 케토 형태보다 우세하다.

DNA 뉴클레오티드의 상대적 전하는 시스템 pH에 따라 전자 또는 구멍 터널링을 조장할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서 양성으로 하전된 DNA 뉴클레오티드 종류는 구멍 터널링을 조장하고 전자 터널링 (LUMO)에 대한 에너지 수준을 증가시킬 수 있고, 그리고 음성으로 하전된 종류는 반대의 행태를 전시할 수 있다 (도면 12,14). 이러한 효과는 2가지 pKa (도면 12)를 따라서 구아닌 뉴클레오티드에 대한 스펙트럼 이동에서 관찰될 수 있는데, 여기서 뉴클레오티드는 산성 pH 하에 양성으로 하전된 구조로부터 염기성 pH에서 음성으로 하전된 구조로 전이한다. 일부 구체예에서, 정전 상호작용은 이런 이유로, 전하 터널링의 확률 (전하 반발에서 증가)을 변화시키고, 상이한 (더욱 낮은) 개별 LUMO와 HOMO 수준을 유발할 수 있다.

개별 뉴클레오티드에 대한 터널링 서명 (또는 지문)은 상이한 환경 조건 하에, 예를 들면, 상이한 pH 조건 하에 상이할 수 있다. 많은 경우에, 뉴클레오티드를 통한 전자/구멍 터널링 전류가 상이한 환경 조건 하에 수집된다. 상이한 환경 조건 하에 양자 터널링 서명에서 차이는 일부 경우에, 핵염기의 케토-에놀 호변체의 존재에 기인할 수 있는데, 이들은 상이한 pH 조건 하에 상이할 수 있다 (도면 11 및 아래에 논의된 바와 같이). 특정한 케토-에놀 호변체의 존재 또는 부재는 상이한 핵염기 사이에, 예를 들면, 퓨린 (A,G) 및 피리미딘 (C,T) 사이에 전자/구멍 터널링 확률의 분리를 야기할 수 있다.

뉴클레오티드의 전하 밀도는 이들 효과에 대한 에너지 증가/감소를 결정하는데 보조할 수 있다. 일부 경우에, 여러 접합된 구조를 가질 수 있는 퓨린은 단일 원자 상에서 국부화된 전하를 가질 수 있는 피리미딘과 비교하여 유의미하게 감소되는, 임의의 원자 상에서 국부 전하를 가질 수 있다 (도면 11). 일부 구체예에서, 접합 효과는 터널링 에너지 이동에 대한 유의미한 충격을 가질 수 있고 산성 조건에서 쉽게 관찰될 수 있는데 (도면 4c, 12, 14, 16), 예로서 여기서 퓨린은 피리미딘보다 훨씬 작은 효과를 전시할 수 있다 (가령, 도면 14에서 아데닌 데이터).

많은 경우에, HOMO-LUMO와 에너지 갭 파라미터의 이용은 에너지 갭 (퓨린 A, 2.73 eV와 G 2.58 eV 및 피리미딘 C, 4.43 eV와 T, 4.82 eV 사이에 약 1.7-2 eV 차이가 있다), 그리고 LUMO 수준 (퓨린 A, 1.61 V와 G 1.49 V 및 피리미딘 C, 3.13 V와 T, 3.08 V 사이에 약 1.5 eV 차이)에 근거하여 산성 조건 하에 퓨린 (A,G)을 피리미딘 (C,T)으로부터 식별하는데 보조할 수 있다. 일부 구체예에서, C와 T는 그들의 HOMO 에너지 수준 차이 (C, -1.30 V와 T, -1.74 V 사이에 약 0.45 eV 차이)에 근거하여 식별되거나 또는 디콘볼루션될 수 있다. 추가 구체예에서, A와 G는 염기성 pH에서 그들의 LUMO 수준 (A, 1.72 V와 T, 1.33 V 사이에 약 0.40 eV 차이)을 이용하여 식별되고/분화되고/디콘볼루션될 수 있다. 핵염기 A, T, G와 C에 대한 특징적인 LUMO, HOMO와 밴드 갭 값은 표 I에서 제공된다. 표 I은 중성, 산성과 염기성 pH 환경에서 결정된 이들 값을 보여준다. 따라서, 일부 구체예에서, 미지의 뉴클레오티드의 정체가 하나 또는 그 이상의 pH 값 (산, 염기성, 그리고 중성)에서 뉴클레오티드에서 양자 터널링 데이터를 수집하고, 상기 뉴클레오티드에 대한 LUMO, HOMO와 밴드 갭 값을 결정하고, 그리고 이들 값을 공지된 정체의 뉴클레오티드에 대해 이전에 결정된 값과 비교함으로써 결정될 수 있다.

표 I: 상이한 pH 조건 하에 벌거벗은 Au(111) 표면 상에서 A, C, G와 T에 대한 LUMO , HOMO와 밴드 갭 에너지 수준의 요약. 값은 평균 ± 표준 편차에 상응한다.

표 II: 상이한 pH 조건 하에 변형된 Au(111) 표면 상에서 A, C, G와 U에 대한 LUMO, HOMO와 밴드 갭 에너지 수준의 요약. 값은 평균 ± 표준 편차에 상응한다.

구아닌: 많은 경우에, 구아닌은 산성 조건 (산성 pH는 첫 번째 pKa~3.2-3.3 미만이다), 중성 조건 및 염기성 조건 (두 번째 pKa~9.2-9.6 초과)에서 3가지 상이한 생화학적 구조를 전시할 수 있다. 일부 경우에, 이성질체에서 구멍 포획은 pH가 증가함에 따라서 (산성으로부터, 중성 내지 염기성 조건으로), HOMO 수준의 꾸준한 증가 (즉, 구멍을 터널링하기 더욱 어려운)를 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 산성과 염기성 조건에서 복수 공명 구조 (도면 11)는 중성 조건과 비교하여, 더욱 쉬운 전자 터널링 (및 더욱 낮은 LUMO 수준)을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 염기성 조건에서 추가 정전기 척력 (pKa2로 인해)은 전자 터널링 확률을 향상시킬 수 있고, 그리고 염기성 pH에 대한 LUMO 수준의 더욱 감소를 유발할 수 있다.

아데닌: 많은 경우에, 아데닌은 임의의 pH 조건 (하전된 조건 및 하전되지 않은 조건 둘 모두)에서 복수 공명 구조를 전시할 수 있다. 많은 경우에, pH 변화는 아데닌의 터널링 확률에 유의미하게 영향을 주지 않는다. 일부 경우에, pH 효과의 이러한 결여는 공명 구조 사이에서 전하의 소멸에 기인할 수 있다. 일부 경우에, 아데닌은 증가하는 pH에서 HOMO 수준의 증가를 전시할 수 있는데, 이것은 일부 경우에, 산성 pH에서 더욱 쉬운 구멍 터널링 (양성 전하로 인해)에 기인할 수 있다.

시토신: 많은 구체예에서, 시토신은 2가지 주요 구조에서 상이한 pH 효과를 전시할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, pKa ~4.4 초과에서 시토신은 중성과 염기성 조건 사이에 차이 없음을 전시할 수 있다. 다른 경우에, 시토신이 산성 조건에서 양자화된 형태에 있는 경우에, 이것은 전자 포획 효과를 전시할 수 있고, 이것은 증가된 LUMO 에너지 수준을 유발할 수 있다.

터널링 전류 데이터는 다양한 핵염기를 구별하고/식별하기 위해 다른 방식으로 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 터널링 전류는 파울러 노드하임 (F-N) 플롯을 이용하여 분석될 수 있다. 이들 플롯은 단일 뉴클레오티드를 통한 또는 폴리뉴클레오티드의 개별 뉴클레오티드를 통한 전하 터널링을 지배하는 근원적인 생물물리학적 파라미터를 확인하는데 보조할 수 있다. 터널링 전류 (I)-전압 (V) 데이터는 ln(I/V²) 대 (1/V)로서 플롯팅될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 플롯은 전이 전압 (V_트랜스) 및 터널링 체제 (삼각형 장벽에 대한)의 기울기를 도출하는데 보조할 수 있다. V_트랜스는 F-N 플롯 상에서 최소 (상이한 체제 사이에 전이 포인트에 동등한)로서 결정된다. S는 높은 바이어스 (1/V의 작은 값)에서 F-N 플롯의 기울기이다. 이러한 값은 전자 터널링에 대해 음성 기울기 및 구멍 터널링에 대해 양성 기울기를 취한다. 도면 4e는 뉴클레오티드 T에 대한 F-N 플롯의 실례이다. 일부 경우에, 전이 전압, V_트랜스,e-는 터널링으로부터 전계 방출 체제로의 전이를 나타낼 수 있고, 그리고 기울기, S는 터널링 장벽 (여기에서 전자에 대한)의 척도일 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 서열을 통한 전자 (V_트랜스,e-)와 구멍 (V_트랜스,h+) 터널링에 대한 이들 생물물리학적 파라미터는 전자 서명의 확인 성분을 나타내고, 그리고 미지의 뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 서열을 특징짓고 확인하기 위해 HOMO-LUMO와 밴드 갭 값과 유사하게 이용될 수 있다.

일부 경우에, V_트랜스,e-와 V_트랜스,h+ 값은 상이한 환경 조건, 예를 들면, pH 하에 상이한 핵염기를 식별하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 산성, 중성과 염기성 조건 하에 결정된 V_트랜스,e-와 V_트랜스,h+ 값은 2개 또는 그 이상의 핵염기 사이를 구별하는데 이용될 수 있다. 많은 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 파라미터가 2개 또는 그 이상의 핵염기의 구별을 보조하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 파라미터는 V_트랜스,e-, V_트랜스,h+, S, HOMO, LUMO, 또는 밴드 에너지 (밴드 갭) 값에서 선택될 수 있다. 많은 구체예에서, 파라미터는 하나 또는 그 이상의 상이한 조건, 예를 들면, 산성, 중성, 또는 염기성 조건 하에 결정될 수 있다.

많은 경우에, 추가 파라미터가 터널링 데이터, 예를 들면, 터널링으로부터 전계 방출로의 전이 전압, 그리고 전하 터널링에 대한 장벽을 지시하는 기울기의 분석으로부터 도출될 수 있다. 이들 터널링 상수, V_트랜스,h+, V_트랜스,e-, S=S_e+S_h (여기서 S_e = S 전자 터널링이고 S_h = 구멍 터널링)는 전하가 터널링되는 분자의 특징일 수 있다. 일부 경우에, 이들 파라미터는 개별 뉴클레오티드의 구별을 보조하기 위해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 파라미터는 핵염기 정체를 결정하고 뉴클레오티드 지문을 창출하는데 보조하기 위해 HOMO-LUMO와 밴드 갭 값과 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, V_트랜스,h+를 이용한 구멍 터널링 확률에서 변화의 결정이 상이한 pH 조건 하에 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위해 HOMO 수준과 유사하게 이용될 수 있다.

부가적으로, 파울러 노드하임 플롯이 전자와 구멍 둘 모두에 대한 터널링 전이 전압 (V_{트랜스, e-}와V_{트랜스, h+}) 및 에너지 장벽 (S)을 확인하는데 이용될 수 있다 (도면 4e 및 표 III). 종합하면, 최대 6가지 파라미터 (V_HOMO, V_LUMO, 에너지 갭, S, V_{트랜스, e-},V_{트랜스, h+})가 단일 뉴클레오티드의 정체를 확인하고 검증하는데 이용될 수 있다.

표 III: 벌거벗은 Au(111) 표면 상에서 상이한 pH 조건에서 전자 (V _트랜스,e- )와 구멍 (V _트랜스,h+ ) 둘 모두에 대한 FN 플롯으로부터 V _트랜스 의 값의 요약. 값은 평균 ± 표준 편차에 상응한다.

많은 구체예에서, 산성 환경은 식별가능한 뉴클레오티드 이성질체의 형성을 보조할 수 있다. A, G, T와 C에 대한 pKa는 각각, 약 4.1, 3.3, 9.9, 그리고 4.4이다. 많은 경우에, 산성 환경은 밴드 갭, HOMO, LUMO, V_트랜스와 S 값을 이용하여 단일 뉴클레오티드를 재현적으로 염기서열결정하는데 이용될 수 있다 (도면 4a,b,e,f). 일부 구체예에서, 산성 pH 하에 수행된 단일 STM-STS 계측이 단일 가닥 DNA (STM을 이용하여) 및 단일 뉴클레오티드 (도면 5a에서 A 및 도면 22에서 T, G, C에 대해 도시된 STS 데이터를 이용하여)를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 복수 pH 환경 하에 수행된 복수 STM-STS 계측이 단일 가닥 DNA 및 단일 뉴클레오티드를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 개시된 방법으로 DNA 및/또는 뉴클레오티드 정체를 결정하기 위한 시간 척도는 대략 수 초 또는 수 분일 수 있다.

많은 구체예에서, 개시된 기술은 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 또는 99% 이상의 정확도에서 폴리뉴클레오티드를 염기서열결정할 수도 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 청구된 기술은 약 30 nt, 40 nt, 50 nt, 60 nt, 70 nt, 80 nt, 90 nt, 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt, 1k nt, 2k nt, 3k nt, 4k nt, 5k nt, 또는 10k nt보다 큰 폴리뉴클레오티드를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다. 많은 경우에, 개시된 기술은 폴리뉴클레오티드의 3'->5' 순서를 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 3'->5' 지향성은 단일 가닥 DNA의 단부를 태깅함으로써 결정될 수 있고, 일부 구체예에서 3' 또는 5' 단부가 태깅된다. 가령, 태깅하는 것은 특정한 5' 또는 3' 단부 특이적 프라이머 태그를 갖는 리가아제, 예를 들면, T4 리가아제를 이용함으로써 달성될 수 있다. 결찰 단계는 마킹된 5'- 또는 3'-단부를 갖는 주형을 창출할 수 있다. 일부 경우에, 태깅된 단부에 근접한 서열은 공지될 수 있다. 개시된 염기서열결정 방법을 이용하여, 공지된 서열은 태그에 의해 확인될 것이고, 이것은 미지의 DNA 표본의 지향성을 드러낼 것이다.

개시된 방법은 변형된 핵염기를 구별하고 확인하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 기술은 자연발생, 합성, 및/또는 변형된 뉴클레오티드와 핵염기를 비롯한 뉴클레오티드와 핵염기를 구별하고 확인하는데 이용될 수 있다. 자연발생 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 그리고 이노신을 비롯한 변형되고 변형되지 않은 핵염기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 개시된 방법은 2'OH 기를 갖는 리보오스 당을 내포하는 다른 A,U,G,C RNA 염기의 정체를 결정하는데 이용될 수 있다. 핵염기는 일부 경우에, 예로서 메틸화에 의해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA, DNA, 및/또는 당 중추에서 이용된 다양한 추가 화학적 변형이 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 개시된 방법은 1-메틸-7-니트로이사토산 무수물, 또는 벤조일 시안화물, 또는 다른 친전자체), 디히드록시-3-에톡시-2-부타논 (케톡살), CMCT (1-시클로헥실-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 메토-p-톨루엔 술폰산염), 또는 탈아미노화된 염기, 예를 들면, 중아황산염으로 탈아미노화를 검출하는데 이용될 수 있다. 메틸화된 핵염기는 메틸시토신, 메틸아데닌, 메틸구아닌, 메틸우리딘, 메틸이노신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 7-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 그리고 O6-메틸구아닌을 포함할 수 있다.

개시된 조성물, 방법, 그리고 기술은 다양한 분자에 대한 전자 서명을 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 분자는 뉴클레오티드 또는 핵염기일 수 있다. 많은 구체예에서, 개시된 기술과 조성물은 전자 상태 밀도에 근거하여 분자를 확인하고 구별할 수 있다. 일부 구체예에서, 전자 상태 밀도는 터널링 분광법 (상관된 STM-STS)을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 전자 서명은 인지가능하고, 그리고 pH 환경에 따라 각 분자에 대해 상이할 수 있다. 많은 경우에, 뉴클레오티드는 산성, 염기성, 및/또는 중성 조건에서 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 및 이들의 상응하는 호변체 구조의 산-염기 행태는 미지의 뉴클레오티드의 확인을 보조할 수 있다.

본원에서 개시된 기술은 중합체 사슬, 특히 폴리뉴클레오티드의 검출과 염기서열결정을 보조하기 위해 자동화될 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 사슬은 단일 뉴클레오티드 분해능으로 빠른 단일-분자 염기서열결정을 제공하기 위해, 고해상 STS를 이용하여 염기서열결정될 수 있다. 개시된 기술은 단일 뉴클레오티드와 변형의 빠른, 저렴한, 정확한, 효소-없는, 그리고 고처리량 확인을 위해 개발될 수 있고, 그리고 생물의학 적용에서 차세대 염기서열결정 기술에 대한 대안을 제공할 수 있다.

본원에서 청구된 기술, 방법, 장치, 그리고 조성물은 기질 상에서 폴리뉴클레오티드를 염기서열결정하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 기질은 금 (111)이다. 일부 구체예에서, 기질은 미소유체 통로 또는 웰을 형성한다. 일부 구체예에서, 미소유체 통로 또는 웰은 울트라스무드 기질, 예를 들면, 금 (Au (111)으로 코팅된다. 많은 구체예에서, 복수의 폴리뉴클레오티드는 개시된 기술을 이용하여, 별개의 통로 또는 웰에서 동시에 염기서열결정될 수 있다. 많은 경우에, 미소유체 웰은 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 미소유체 통로로 공급할 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 개시된 기술을 이용하여 염기서열결정된다.

단일 STM 첨단부 및 단일 Au(111) 기질이 낮은 농도의 DNA 또는 RNA를 염기서열결정하는데 이용될 수 있기 때문에, 복수 미소유체 통로와 웰 및 복수 STM 첨단부가 복수 폴리뉴클레오티드 (RNA 또는 DNA 분자)를 개시된 기질 상에서 동시에 압출하고 염기서열결정하는데 이용될 수 있다. 이러한 빠른, 고처리량, 효소-없는, 단일 분자 DNA 염기서열결정 기술에 대한 운용 비용은 매우 적을 수 있다. 단순한 금 기질의 경우에, 전체 유전체 서열이 단일 기질 상에서 만들어지고, 전체 서열에 대한 운용 비용 (수십 달러까지)과 시간 (몇 시간 또는 몇 분)을 유의미하게 감소시킬 수 있다. 많은 개별 단일 폴리뉴클레오티드가 동시에 염기서열결정되는 일부 구체예에서, 시간이 몇 시간 이내까지 감소될 수 있다.

본 발명은 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 확인하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드에 대한 터널링 전류 데이터를 획득하고; 터널링 전류 데이터로부터 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지 전자 서명을 도출하고, 여기서 전자 서명은 HOMO(eV) 값, LUMO(eV) 값, 밴드갭(eV) 값, V트랜스₊(V) 값, V트랜스_-(V) 값, Φ_e-(eV) 값, Φ_h+(eV) 값, m_e-/m_h+ 값 및 △Φ(eV) 값으로 구성된 군에서 선택되고; 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지 전자 서명을 한 세트의 상응하는 전자 지문 참조값에 정합하고, 따라서 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 확인하고; 여기서, 데옥시아데노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.39 + 0.3이고; LUMO(eV) 값은 1.42 + 0.24이고; 밴드갭(eV) 값은 2.81 + 0.41이고; V트랜스₊(V) 값은 1.14 + 0.2이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.51 + 0.32이고; Φ_e-(eV) 값은 1.45 + 0.57이고; Φ_h+(eV) 값은 1.03 + 0.61이고; m_e-/m_h+ 값은 0.29 + 0.23이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 2.48 + 0.98이고; 아데노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고; HOMO(eV) 값은 -1.44 + 0.2이고; LUMO(eV) 값은 1.47 + 0.21이고; 밴드갭(eV) 값은 2.9 + 0.27이고; V트랜스₊(V) 값은 1.26 + 0.26이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.63 + 0.23이고; Φ_e-(eV) 값은 2.06 + 0.72이고; Φ_h+(eV) 값은 1.25 + 0.59이고; m_e-/m_h+ 값은 0.43 + 0.17이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 3.3 + 0.93이고; 메틸화된 데옥시아데노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -2.04 + 0.28이고; LUMO(eV) 값은 2.06 + 0.37이고; 밴드갭(eV) 값은 4.1 + 0.25이고; V트랜스₊(V) 값은 1.47 + 0.37이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.91 + 0.27이고; Φ_e-(eV) 값은 1.6 + 0.36이고; Φ_h+(eV) 값은 1.28 + 0.41이고; m_e-/m_h+ 값은 1.21 + 0.98이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 2.87 + 0.74이고; 데옥시구아노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.36 + 0.19이고; LUMO(eV) 값은 1.48 + 0.24이고; 밴드갭(eV) 값은 2.84 + 0.27이고; V트랜스₊(V) 값은 1.13 + 0.13이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.48 + 0.29이고; Φ_e-(eV) 값은 1.33 + 0.3이고; Φ_h+(eV) 값은 0.79 + 0.5이고; m_e-/m_h+ 값은 0.32 + 0.25이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 2.12 + 0.65이고; 구아노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.4 + 0.31이고; LUMO(eV) 값은 1.47 + 0.19이고; 밴드갭(eV) 값은 2.86 + 0.31이고; V트랜스₊(V) 값은 1.13 + 0.17이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.59 + 0.15이고; Φ_e-(eV) 값은 1.97 + 0.44이고; Φ_h+(eV) 값은 1.07 + 0.44이고; m_e-/m_h+ 값은 0.54 + 0.19이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 3.04 + 0.72이고; 메틸화된 데옥시구아노신은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -2.24 + 0.42이고; LUMO(eV) 값은 2.3 + 0.64이고; 밴드갭(eV) 값은 4.53 + 0.85이고; V트랜스₊(V) 값은 1.5 + 0.46이고; V트랜스_-(V) 값은 -1.33 + 0.55이고; Φ_e-(eV) 값은 3.29 + 1.36이고; Φ_h+(eV) 값은 3.25 + 1.69이고; m_e-/m_h+ 값은 1.13 + 0.72이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 6.54 + 2.98이고; 데옥시시티딘은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.81 + 0.34이고; LUMO(eV) 값은 2.39 + 0.4이고; 밴드갭(eV) 값은 4.2 + 0.49이고; V트랜스₊(V) 값은 1.34 + 0.31이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.8 + 0.26이고; Φ_e-(eV) 값은 2.62 + 0.89이고; Φ_h+(eV) 값은 1.57 + 0.63이고; m_e-/m_h+ 값은 0.64 + 0.31이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 4.19 + 1.17이고; 시티딘은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.4 + 0.24이고; LUMO(eV) 값은 2.2 + 0.22이고; 밴드갭(eV) 값은 3.6 + 0.25이고; V트랜스₊(V) 값은 1.59 + 0.28이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.59 + 0.33이고; Φ_e-(eV) 값은 3.17 + 0.63이고; Φ_h+(eV) 값은 1.23 + 0.68이고; m_e-/m_h+ 값은 0.39 + 0.25이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 4.4 + 1이고; 메틸화된 데옥시시티딘은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -2.78 + 0.39이고; LUMO(eV) 값은 2.62 + 0.59이고; 밴드갭(eV) 값은 5.4 + 0.36이고; V트랜스₊(V) 값은 1.62 + 0.37이고; V트랜스_-(V) 값은 -1.89 + 0.29이고; Φ_e-(eV) 값은 3.07 + 0.8이고; Φ_h+(eV) 값은 3.4 + 1.13이고; m_e-/m_h+ 값은 1.18 + 1.46이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 6.46 + 1.89이고; 티미딘은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.38 + 0.19이고; LUMO(eV) 값은 2.68 + 0.3이고; 밴드갭(eV) 값은 4.06 + 0.32이고; V트랜스₊(V) 값은 1.43 + 0.37이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.44 + 0.19이고; Φ_e-(eV) 값은 2.75 + 0.69이고; Φ_h+(eV) 값은 0.85 + 0.4이고; m_e-/m_h+ 값은 0.33 + 0.17이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 3.61 + 0.73이고; 그리고 우라실은 상응하는 전자 지문 참조값의 세트를 포함하고: HOMO(eV) 값은 -1.51 + 0.25이고; LUMO(eV) 값은 2.04 + 0.25이고; 밴드갭(eV) 값은 3.54 + 0.31이고; V트랜스₊(V) 값은 1.53 + 0.34이고; V트랜스_-(V) 값은 -0.9 + 0.36이고; Φ_e-(eV) 값은 3.71 + 1.36이고; Φ_h+(eV) 값은 1.98 + 1.09이고; m_e-/m_h+ 값은 0.68 + 0.29이고, 그리고 △Φ(eV) 값은 5.68 + 1.61이다.

본 발명은 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드에 대한 한 세트의 전자 지문 참조값을 개발하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: 뉴클레오시드에 대한 터널링 전류 데이터를 획득하고, 여기서 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드의 정체는 알려져 있고; 터널링 전류 데이터로부터 최소한 1가지, 최소한 2가지, 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지 전자 서명을 도출하고; 전자 서명으로부터 전자 지문 참조값의 세트를 개발하고, 여기서 전자 지문 참조값의 상기 세트는 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 확인할 수 있음.

다른 양상에서, 전자 지문 참조값의 세트는 첫 번째 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 두 번째 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드로부터 식별할 수 있고, 여기서 첫 번째 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 및 두 번째 핵염기, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드는 상이한 뉴클레오시드이다.

다른 양상에서, 전자 서명은 HOMO(eV) 값, LUMO(eV) 값, 밴드갭(eV) 값, V트랜스₊(V) 값, V트랜스_-(V) 값, Φ_e-(eV) 값, Φ_h+(eV) 값, m_e-/m_h+ 값 및 △Φ(eV) 값으로 구성된 군에서 선택된다.

다른 양상에서, 전자 지문 참조값의 세트는 HOMO(eV) 값, LUMO(eV) 값, 밴드갭(eV) 값, V트랜스₊(V) 값, V트랜스_-(V) 값, Φ_e-(eV) 값, Φ_h+(eV) 값, m_e-/m_h+ 값 및 △Φ(eV) 값으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명은 핵산 서열을 결정하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 여기서 핵산 서열은 DNA, 변형된 DNA, RNA, 변형된 RNA, PNA, 변형된 PNA 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 여기서 핵산 서열은 핵염기 및 하전된 중추를 포함한다.

개시된 기술은 스트립드 금 기질을 이용하여 대량 평행 염기서열결정을 제공하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 주형 스트리핑이 기질을 제조하는데 이용될 수 있고, 그리고 대량 평행 STM 영상이 주형 스트립드 금 기질을 이용하여 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 첨단부가 광학적 석판인쇄, 그 이후에 비등방성 에칭, 예를 들면, KOH 에칭을 이용하여 광학적으로 창출될 수 있다.

실시예

실시예 1- LUMO, HOMO와 밴드 갭 값

불꽃 어닐링된 편평한, 주형-스트립드 울트라스무드 금 (111) 기질 (하기를 참조한다). 기질로부터 끄집어내진 뉴클레오티드를 갖는 선형화된 DNA (당 중추 대신에 핵염기를 통한 전하 터널링을 연구하기 위해)를 제조하기 위해, 양성으로 하전된 금 (111) 표면이 제조되고 아래에 상술된 새로운 압출 침적 기술에서 이용을 위해 개발되었다 (도면 1a).

STM 기질 제조

불꽃-어닐링된 Au(111) 표면은 주형 스트리핑에 의해 획득되었다. 전형적인 주형 스트리핑 과정에서, 열에 의해 증발된 금 (Au) 필름이 실리콘 (100), 또는 다른 지수 정합된 기질 (Au(111)이 Si(100)에 45˚ 방향에서 형성된다) 상에 불꽃 어닐링되어, Au(111) 정향을 산출한다. 금 코팅이 청소된 실리콘 기질에 부착하지 않기 때문에, 이들은 에폭시, 전착된 금속, 또는 금에 부착될 수 있는 다른 중합체 필름을 이용함으로써 벗겨질 수 있다. 벗겨진 필름은 원자적으로 편평한 (편평한 실리콘 웨이퍼의 평활도를 모방하는) Au(111) 기질을 드러낸다 (Nagpal et al., Science. 325, 594, 2009에서 설명된). 박피술 직후에, 표면은 표면을 균일하게 음성으로 하전하기 위해 O₃ 플라즈마로 2 분 동안 처리되었다 (Jelight Company INC UVO 클리너 모형 번호 42) (양성으로 하전된 고분자전해질의 흡착의 경우에). 벌거벗은 금 표본의 경우에, 첫 500 μL의 0.1M HCl, 0.1M Na₂SO₄ 또는 0.1M NaOH가 표면 상에 첨가되고 압축된 공기에서 건조되었다. 이후, 1 μL의 DNA 용액 (소중합체 또는 ampR)이 표면 상에서 병진 운동으로 연장되었고 건조되었다. 폴리-l- 리신 표본의 경우에, 25 μL의 10 ppm 용액 (Sigma, USA로부터 구입된 MW 70,000-150,00 g/mol)이 깨끗한 금 기질 상에 첨가되고, 그 이후에 실온에서 5 분 배양이 이어지고, 이후 이것은 500 μL의 이중 증류된 H₂O로 세척되고 압축된 공기에서 건조되었다. DNA 표본은 앞서 설명된 바와 같이, STM-STS에 대해 제조되었다. 부가적으로, 이들 표본은 동일한 농도에서 500 μL의 물, 산 또는 염기로 세척되고 압축된 공기 하에 건조되었다.

STM을 위한 ssDNA 소중합체와 ssDNA ampR DNA

단일 가닥 소중합체, (폴리(dA)₁₅, 폴리(dC)₁₅, 폴리(dG)₁₅, 폴리(dT)₁₅)는 Invitrogen, USA로부터 구입되었다. 이들 DNA 소중합체는 20 μM의 농도에서 0.1M Na₂SO₄ 용액에서 용해되고, 그리고 이용 때까지 -20℃에서 저장된다. DNA 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계 (Thermo scientific, USA)를 이용하여 계측되었다.

염기서열결정을 위한 DNA 가닥을 선형화하기 위한 압출 침적 기술

가늘고 긴 선형 ssDNA를 금 기질 상에 분산시키기 위해, 3-단계 절차가 추종되었다. 첫 번째, 금 (111) 표면이 이를 앞서 설명된 바와 같이, 10ppm 폴리-L-리신 용액으로 코팅함으로써 양성으로 하전되었다. 두 번째, ssDNA가 95℃에서 5 분 동안 융해되고, 그 이후에 얼음 위에서 5 분 동안 플래시 냉각이 이어졌다. 일부 경우에, dsDNA 및 짧은 모노뉴클레오티드 ssDNA 가닥은 삼차 구조를 내포하지 않지만, 1 kb 길이 ssDNA는 이차 구조를 형성할 수 있다. 일반적으로, 융해는 DNA 상에서 이차 구조를 제거하는데 도움을 줄 수 있고, 그리고 양성으로 하전된 표면의 이용은 이차 구조를 교란하는데 도움을 줄 수 있다. 표면 상에서 양성 전하는 정전 상호작용을 통해 인산염 중추와 연결되는 폴리-L-리신 펩티드에 의해 제공되었다. 많은 경우에, 예로서 염기서열결정 목적을 위해, 산성 조건이 4가지 뉴클레오티드, C, T 및 퓨린- G 또는 A를 디콘볼루션하고/식별하고/구별하는데 이용되었다. 세 번째, ssDNA 분산액 (1-5nM)이 변형된 Au(111) 표면 상에 병진 운동으로 압출되어, 선형화된 DNA 사슬을 형성하였다 (도면 23, 아래에 설명된). 폴리뉴클레오티드의 압출은 상이한 셋업으로 행위되었다. 특정한 실례로서, 우리는 2가지 구체예를 설명한다: 피펫 첨단부 (0.1-1μL)를 이용 및 침적하면서 병진 운동을 천천히 적용; 그리고 미소유체를 이용, 여기서 폴리뉴클레오티드가 한 면에 부가되고, 그리고 모세관 힘이 나노/마이크로-통로를 통해 상기 폴리뉴클레오티드를 압출한다.

압출 운동 이후에, DNA를 양성으로 하전된 금 표면 상에 침적하는 것은 DNA가 음성으로 하전된 인산염 중추 및 양성으로 하전된 표면의 상호작용으로 인해, 금 표면 위에 고정되도록 허용하였다. 이러한 상호작용은 뉴클레오티드를 원자적으로 편평한 금 위에 노출시키고, 그리고 이들 뉴클레오티드가 그들의 STS 스펙트럼의 계측을 이용하여 염기서열결정되도록 허용하였다. 이러한 방법은 또한, ssDNA를 선형화함으로써 이차 구조를 감소시켰을 뿐만 아니라, 리보오스 당 및 인산염 중추로부터 잡음과 배경 신호를 감소시킨다.

폴리-L-리신으로 표면 변형은 LUMO 수준의 에너지를 낮추고 HOMO 수준의 에너지를 증가시키면서 둘 사이에 유사한 에너지 갭을 유지하는 방향으로 일반화된 효과를 가졌다. 이러한 효과는 표면 상대적 pH를 증가시키는 리신 잔기의 약간 염기성 성분에 기인할 수 있다.

화학적으로-에칭된 백금-이리듐 첨단부 (80:20 Pt-Ir)가 이용되었고, 그리고 상관된 STM과 STS 연구는 선형화된 DNA 뉴클레오티드를 통해 전자와 구멍을 터널링함으로써 수행되었다 (도면 1a와 3a,b). 터널링 전류 분광법 데이터 (전류 (I)-전압 (V))는 분자의 국소 전자 상태 밀도 (dI/dV 스펙트럼, 도면 10 및 상기 논의)의 직접적인 척도이고, 그리고 뉴클레오티드 생화학적 구조에 근거하여 독특한 전자 지문을 창출하는데 도움을 주는데 조력한다 (도면 1과 3a,b). 다양한 DNA 뉴클레오티드에 대한 상이한 터널링 서명을 확인하기 위해, 이들 뉴클레오티드를 통한 전자/구멍 터널링이 상이한 pH 조건 하에 조사되었다. 상이한 pH 조건 하에 핵염기의 케토-에놀 호변체의 존재 (도면 11 및 아래에 설명된)는 퓨린 (A,G) 및 피리미딘 (C,T) 사이에 전자/구멍 터널링 확률을 분리하는데 보조하여, 이들 두 군을 구별하는데 보조할 수 있다.

영상 및 분광법

주사형 터널링 현미경 이미지는 Agilent Technologies, USA로부터 구입된 화학적으로 에칭된 Pt-Ir 첨단부 (80:20)를 이용한 변형된 분자 영상 PicoSPM II로 획득되었다. 상기 기기는 실온에서 및 대기압 하에 작동되었다. 터널링 접합부 파라미터는 100 pA의 터널링 전류 및 0.1V의 표본 바이어스 전압에서 세팅되었다. 분광법 계측은 높은 전류/전압으로 인한 DNA 표본의 분해를 방지하기 위해, 이전 접합부 파라미터로 90V/s의 주사 속도에서 획득되었다. 전류 전압 (I-V) 스펙트럼에 관한 정보를 내포하는 주사형 터널링 분광법 데이터는 Matlab를 이용하여 이의 도함수 dI/dV를 획득하는데 이용되었다. dI/dV는 아래에 논의된 바와 같이 전자 국소 상태 밀도에 비례한다. LUMO와 HOMO 수준의 에너지 밴드 배정은 첫 번째 유의미한 양성과 음성 피크를 스펙트럼 상에 각각 배정함으로써 행위되었다 (도면 10). LUMO와 HOMO 값 사이에 에너지 차이는 전자 LUMO-HOMO 에너지 밴드 갭을 규정한다. 각 뉴클레오티드는 퓨린과 피리미딘 사이에 일차 확인을 위해, 이의 HOMO/LUMO와 에너지 갭에 근거하여 배정되었다. C와 T의 확인은 그들의 LUMO와 HOMO 수준 차이에 근거되었다.

각 픽셀에 상응하는 X-Y 위치는 데이터 포인트 사이에 거리를 계산하는데 이용되었다. 이러한 정보는 또한, 서열을 배정하는데 이용되었는데, 그 이유는 각 뉴클레오티드가 약 0.65 nm의 크기를 갖기 때문이다. 뉴클레오티드 서열의 공간적 치수에 근거하여, 2개의 인접한 치수 사이에 거리는 nm에서 전산되고 0.65에 의해 나눗셈되었다. 이런 이유로, 각 치수는 인접한 뉴클레오티드에 상응하고, 그리고 위치는 이의 순서를 전산하는 것에만 이용된다. 이들 서열은 이런 이유로, 양자 분자 염기서열결정 주사를 이용하여 확인되었다. 먼저, 각 뉴클레오티드에 대해 생물물리학적 파라미터, 예를 들면, HOMO, LUMO, 밴드 갭, 전이 전압 (양성과 음성), 전자/구멍 유효 질량의 비율, 전자와 구멍에 대한 Φ₀ 및 △Φ₀가 확인되었다. 참조 라이브러리로부터 확인된 파라미터 (충분히 특징화된, 공지된 서열, 예를 들면, 변형을 결여하는 호모폴리뉴클레오티드로부터 훈련 세트에서 결정된 바와 같은)는 기계 학습 모형을 참조로서 구축하는데 이용되었다. 이후, 미지의 스펙트럼은 파라미터를 도출하기 위해 처리되었고, 그리고 이들은 훈련 세트로부터 각 개별 군의 확률을 확인하기 위해 훈련 세트에 대하여 비교되었다. 가장 높은 확률을 갖는 군은 본래 스펙트럼에 배정되고 서열 정렬에 이용된다. 이러한 방법은 서열의 확인을 허용한다. 주해된 서열 (가령, 여기에서 ampR)에 대항하여 확인된 염기서열결정의 정확도를 점검하기 위해, 확인된 서열은 기본 국부 정렬 검색 도구 (BLAST)를 이용하여, National Center for Biotechnology information에서 가용한 ampR 서열 (수탁 번호 EF680734.1, www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF680734.1에서 가용)에 대하여 비교되었다. BLAST는 이러한 경우에, 계측된 서열을 참조에 대해 정렬하는데 이용된다. 서열 정렬에 더하여, 획득된 데이터는 또한, 새로운 서열 주해로의 데노보 어셈블리에 이용될 수 있다.

밀도 기능 이론 시뮬레이션 : 전자 구조 계산은 한정된 Hartree-Fock 방법을 이용하고, 도면 2에서 묘사되고, 그리고 Phys. Rev. 140, A1133, C.C.J.Roothaan Rev.Mod.Phys. 23, 69-89 및 J.Comput.Chem. 14, 1347-1363 (1993)에서 설명된 GAMESS 소프트웨어 패키지에서 B3LYP 기능 세트 및 6-311G(2d,2p) 기본 세트에서 밀도 기능 이론을 이용하여 수행되었다. 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드와의 중성 핵염기 비교를 위해, J. Chem. Phys. 77, 3654 (1982) 및 J. Chem. Phys. 80, 3265 (1984)에서 설명된 바와 같이, 정확한 결과를 제공하는 6-311G(2d,2p) 기본 세트가 이용되었는데, 그 이유는 이것이 가우스 궤도의 분열 원자가 삼중 제타 설명이기 때문이다. 단리된 핵염기 상에서 pH로 상이한 호변체의 연구 사례는 J. Chem. Phys. 77, 3654 (1982) 및 J. Chem. Phys. 80, 3265 (1984)에서 설명된 바와 같이, 6-31++G(2d,2p) 기본 세트를 이용하였다. 수소와 중원자 둘 모두에 확산된 기능의 부가는 하전된 분자에 대한 더욱 나은 설명을 제공한다. 각 핵염기, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드의 구조는 Jmol 소프트웨어 통합된 특질을 이용하여 초기에 최적화되었다. 추가 기하학 최적화가 GAMESS에서 전자 계산 동안 계산되었다. 분자 궤도는 MacMolPlt를 이용하여 도안되었다.

표 IV: 6-31++G(2d,2p) 기본 세트 및 B3LYP 기능 세트를 이용한 밀도 함수 이론 DFT 계산으로부터 모의된 단리된 핵염기 에너지 밴드 갭의 요약.

표 V: 중성 조건에서 6-311G( 2d,2p ) 기본 세트 및 B3LYP 기능 세트를 이용한 DFT로 계산된 핵염기 , 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드로부터 에너지 밴드 갭의 비교. eV에서 에너지 밴드 갭.

산성 pH에서 수행된 STS 계측은 케토/에놀 이성질체의 형성을 조장할 수 있다. 산성 pH 환경은 강산, 예를 들면, HCl의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 많은 구체예에서, pH 환경은 임의의 산, 염기, 또는 pH 완충액의 첨가에 의해 달성될 수 있고, 예로서 산은 황산, 구연산, 질산, 젖산, 탄산, 인산, 붕산, 옥살산, 그리고 아세트산을 포함할 수 있다. 대부분의 구체예에서, 산이 pH 환경을 변화시키는데 이용된다. 많은 구체예에서, 산은 3 미만의 pKa를 가질 것인데, 이것은 원하는 뉴클레오티드 화학적 변형이 달성될 수 있도록 담보하는 것을 보조할 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드의 경우에, 이것은 도면 11에서 목격될 수 있다. 많은 경우에, 산성 pH에서 수행된 STS는 터널링 전자와 구멍의 확률을 각각 지시할 수 있는 최저준위 비점유 분자 궤도 (LUMO)와 최고준위 점유 분자 궤도 (HOMO) 수준의 분리를 허용할 수 있다. 이러한 분리는 도면 4a의 V 또는 eV 대 확률 플롯에서 목격될 수 있다. 이러한 분리는 또한, 에너지 "밴드 갭", 또는 도면 4b에서 묘사된 HOMO-LUMO 수준 사이에 차이에서 목격될 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 C (-1.30±0.17eV)와 T (-1.74±0.29eV)의 HOMO 수준 (또는 구멍 터널링 확률)은 또한, 도면 4a에서 목격되는 바와 같은 분리를 전시할 수 있다. C와 T HOMO 수준 사이에 분리는 그들의 케토와 엔올화된 구조에 기인할 수 있다 (도면 11).

염기성 조건 역시 핵염기를 식별하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 염기성 pH는 아데닌과 구아닌 뉴클레오티드 (A와 G)를 구분하는데 보조할 수 있다. 이들 사례에서, LUMO 수준은 A의 경우에 약 1.72±0.19 eV 및 G의 경우에 1.33±0.17 eV일 수 있다. 일부 구체예에서, 염기성 pH는 강염기, 예를 들면, NaOH의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 원하는 pH 환경은 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 알루미늄, 제이철, 그리고 아연 리튬 수산화물)을 비롯한 다양한 산, 염기 또는 완충액의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 염기성 pH를 달성하는데 이용된 염기는 9 초과의 pKa를 가질 것이고, 이것은 원하는 뉴클레오티드 화학적 변형이 달성될 수 있도록 담보하는 것을 보조할 수 있다. 일부 경우에, A와 G에 대한 HOMO 수준은 또한, 염기성 조건 하에 다를 수 있다. 3가지 상이한 환경에서 4가지 뉴클레오티드, A, T, G와 C에 대한 값이 표 I에서 보고된다.

일부 경우에, 생화학에서 차이가 다른 이성질체에서 목격되고, 그리고 상이한 pH 조건 하에 단일 뉴클레오티드의 STS를 이용하여 검출될 수 있다 (도면 4c,12,14,16). 가령, 티민 핵염기 (T)는 아데닌, 구아닌, 그리고 시토신과 달리, 에놀 이성질체 (산성 조건 하에 형성된)를 통해 전하를 터널링할 수 있다 (전자와 구멍 둘 모두) (도면 4c,d,11, 표 I). 이러한 효과는 접합에 기인할 수 있다. 산성, 중성과 염기성 pH 하에 단일 T 뉴클레오티드를 통한 STS 분광법은 이들 생화학적 변화를 증명하는데, 이들은 단일 분자를 통한 터널링 전하의 용이함에 기인할 수 있다 (도면 4c,d). 단일 T 뉴클레오티드에서 LUMO 수준은 더욱 쉬운 전자 터널링 (아마도, 정전기 척력의 효과, 도면 4d,11, 상기 논의됨)으로 인해, 증가하는 pH에서 줄어든다. LUMO와 HOMO 수준에 대한 pH의 유사한 효과가 다른 뉴클레오티드에 대해서도 관찰된다 (도면 12,14,16). 가령, 구아닌에 대한 2가지 pKa 값 및 결과의 이성질체가 STS 데이터를 이용하여 목격될 수 있다 (도면 12, 표 I). 이런 이유로, 상이한 pH 조건 하에 형성된 생화학적 구조, 핵염기 호변체 및 기타 이성질체 (그들의 pKa 값에 의해 결정된)는 LUMO와 HOMO 값 각각을 이용하여 모니터링될 때 전자와 구멍 터널링의 확률을 이용하여 추적되었다 (밴드 갭과 함께, 도면 4a,b,c,12,14,16, 표 I).

DFT 연구를 이용하여, 상이한 pH 조건 하에 핵염기의 뉴클레오티드와 케토-에놀 호변체에 대한 양자화되고 탈양자화된 산/염기의 존재 (가령, 도면 11 및 앞서 설명된 바와 같이)는 상이한 pH 조건 하에 퓨린 (A,G)과 피리미딘 (C,T) 사이에 전자/구멍 터널링 확률의 분리를 야기할 수 있는 것으로 가정되었다. 결과의 양자 분자 염기서열결정 (QM-Seq) 전자 서명은 상이하고, 견실한 생화학적 뉴클레오티드 확인 방법의 개발을 야기할 것이다.

실시예 2- 새로운 QM-Seq 서명으로서 생물물리학적 파라미터.

염기서열결정 적용의 방향으로 핵염기의 손쉬운 확인을 위한 추가 생물물리학적 성능 지수 또는 파라미터를 개발하기 위해, 터널링 전류의 상술된 분석이 단일 분자 (여기에서 데옥시뉴클레오티드)로부터 분석되었다. 터널링 전류는 단일 뉴클레오티드를 통한 전하 터널링을 지배하는 근원적인 생물물리학적 파라미터를 확인하기 위해, 파울러 노드하임 (F-N) 플롯을 이용하여 분석되었다. 터널링 전류 (I)-전압 (V) 데이터는 도면 4e에서 T에 대한 F-N 플롯에 대해 보여지는 바와 같이, 터널링 체제 (삼각형 장벽에 대한)의 전이 전압 (V_트랜스)을 도출하기 위해, ln(I/V²) 대 (1/V)로서 플롯팅되었다. 전이 전압, V_트랜스,e-는 터널링으로부터 전계 방출 체제로의 전이를 나타내고, 그리고 이것은 터널링 장벽 (여기에서 전자에 대한)의 척도이다. 뉴클레오티드 서열을 통한 전자 (V_트랜스,e-)와 구멍 (V_트랜스,h+) 터널링에 대한 이들 파라미터는 전자 서명의 확인 성분을 나타내고, 그리고 서열을 특징짓고 확인하기 위해 HOMO-LUMO와 밴드갭 값과 유사하게 이용될 수 있다 (하기에 논의). 개별 뉴클레오티드에 대한 이들 파라미터를 도출 시에, 도면 4f에 나타나 있는 바와 같이, 산성 조건 하에 V_트랜스,e-와 V_트랜스,h+ 값의 상이한 분리가 관찰된다 (표 III, 위와 아래에서 논의). 유사한 이동이 또한, 도면 21 및 표 III)에 나타나 있는 바와 같이, 상이한 pH 조건 하에 전자와 구멍 전이 전압에서 관찰되었다. 이런 이유로, HOMO-LUMO 수준, 에너지 밴드갭, V_트랜스,h+, 그리고 V_트랜스,e-를 생물물리학적 파라미터로서 이용하여, 전하 (전자와 구멍) 터널링 데이터를 이용하여 뉴클레오티드를 확인할 수 있다.

리보뉴클레오티드 확인을 위한 QM-Seq 서명: 실험적 생물물리학적 연구와 생화학적 연구와 함께, DFT 조사를 이용하여, 산성 pH가 빠르고 정확한 전자 확인을 위해 단일 뉴클레오티드를 재현적으로 확인하는데 이용될 수 있는 (에너지 밴드갭, HOMO-LUMO, V_트랜스,h+, 그리고 V_트랜스,e-를 이용하여, 도면 4 a,b,e,f, 표 I과 III에서 DNA에 대한 QM-Seq 데이터, 표 II에서 RNA에 대한 QM-Seq 데이터) 식별가능한 서명 (A, G, T와 C에 대한 pK_a는 각각, 4.1, 3.3, 9.9와 4.4이다)의 형성을 담보한다는 것을 확인하였다. 게다가, DFT 연구는 RNA 피리미딘 핵염기에 대한 양자 서명 또는 전자 지문이 DNA와 상이할 수 있다는 것을 제안하였다. 직접적인 RNA 염기서열결정에 대한 QM-Seq의 잠재력 및 양자 서명의 독특성을 평가하기 위해, 우리는 산성 조건 하에 RNA 호모 올리고뉴클레오티드에 대한 QM-Seq 생물물리학적 파라미터를 계측하였다 (도면 7a,b, 표 II). QM-Seq 서명의 명백한 분리는 RNA 퓨린 (A/G)과 피리미딘 (C/U)의 빠른 확인을 허용한다. 하지만, 분자 엔트로피로 인한 서명의 분산 및 2' 히드록실화된 당 중추 위에서 전하 구름의 비편재화는 뉴클레오티드 사이에 추가 차이를 예방한다. RNA와 DNA 사이에 퓨린 (도면 7c)과 피리미딘 (도면 7d) QM-Seq 서명을 비교하는 것은 DFT 시뮬레이션에 의해 제안된 바와 같이, 피리미딘 핵염기에 대한 지문 사이에 분명한 차이를 보여준다. 2' 히드록실화된 당 중추가 RNA와 DNA 뉴클레오티드를 식별하기 때문에, 핵염기에 전하의 강한 국부화는 퓨린 뉴클레오티드에 대한 서명에서 차이를 예방한다 (도면 7c, 표 II). 이들 결과는 뉴클레오티드의 생화학적 구조 및 이들의 QM-Seq 서명 사이에 관계를 개설하고, 그리고 독특한 QM-Seq 전자 지문을 이용한 빠른 단일-분자 염기서열결정에 대한 능력을 증명한다.

시험관내 전사를 이용한 RNA 생산: RNA 표본은 MAXIscript 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여, 추출된 DNA 유전자로부터 시험관내 전사를 이용하여 제조되었다. 500-1000 ng의 DNA 주형, 1 μL의 ATP 10 mM, 1 μL의 CTP 10 mM, 1 μL의 GTP 10 mM, 1 μL의 UTP 10 mM, 1 μL의 뉴클레아제-없는 물을 PCR 튜브에서 혼합하였다. 이후, 2 μL의 10X 전사 완충액이 첨가되고 철저하게 혼합되었다. 최종적으로, 2 μL의 SP6 중합효소 효소가 반응물에 첨가되고, 그 이후에 와동과 스핀이 이어졌다. 모든 시약은 중합효소를 제외하고, 어셈블리를 위해 실온에서 유지되었다 (주목할 점은 얼음에서 반응물을 조립하는 것이 주형 DNA를 침전시킬 수 있다는 것이다). 용액은 이후, 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 배양 이후에, 1 μL의 TURBO DNA분해효소가 주형 DNA를 분해하기 위해 첨가되었고, 그리고 이것은 37 ℃에서 30 분 동안 배양되었다. 이후, 용액은 1.5 mL 원심분리기 튜브로 이전되고 에탄올 침전에 선행하였다. 25 μL의 뉴클레아제 없는 물, pH=5.5에서 5 μL의 아세트산나트륨 3M 및 3 용적의 냉각된 무수 에탄올을 첨가하였다. 용액은 -20 ℃에서 최소한 30 분 동안 배양되었다. 이후, 산물은 최고 속도에서 15 분 동안 원심분리되고, 그 이후에 에탄올 (70%)로 2회 세척이 이어졌다. 최종적으로, RNA 펠렛은 15 μL의 0.5x TE 완충액에서 재현탁되었다.

N-메틸 이사토산 무수물로 RNA 변형: 10 μL의 접힘된 RNA에 10 μL의 N-메틸 이사토산 무수물 (NMIA) 용액 (DMSO에서 130 mM의 NMIA)을 첨가한다. 37 ℃에서 2.5 시간 동안 배양한다. 앞서 설명된 바와 같이 에탄올 침전으로 반응을 추적한다. RNA 펠렛을 10 μL의 0.5x TE 완충액에서 재현탁한다.

디-메틸 황산염으로 RNA 변형: 10 μL의 접힘된 RNA에 10 μL의 DMS 용액 (메탄올에서 0.8 mM의 DMS (디메틸 황산염, SPEX CertiPrep, USA))을 첨가한다. 양쪽 튜브를 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다. 앞서 설명된 바와 같이 에탄올 침전으로 반응을 추적한다. RNA 펠렛을 10 μL의 0.5x TE 완충액에서 재현탁한다.

데이터 분석: 여러 파라미터가 각 핵염기로부터 각 터널링 전류 데이터로부터 도출되었다 (HOMO, LUMO, 밴드 갭, 전이 전압 (양성과 음성), 전자/구멍 유효 질량의 비율, 전자와 구멍에 대한 Φ₀ 및 △Φ₀). 우리는 서열과 구조 둘 모두를 동시에 확인하는데 이용될 수 있는 분류 알고리즘을 개발하였다 (도면 1).

먼저, 변형되지 않은 호모 소중합체 또는 변형된 (NMIA 또는 DMS로) 소중합체에서 파라미터, 예를 들면, HOMO, LUMO, 밴드 갭, 전이 전압 (양성과 음성), 전자/구멍 유효 질량의 비율, 전자와 구멍에 대한 Φ₀ 및 △Φ₀가 확인되었다. 개별 변형된/변형되지 않은 올리고로부터 확인된 파라미터 (충분히 특징화된, 공지된 서열, 예를 들면, 변형을 내포하는 또는 결여하는 호모폴리뉴클레오티드로부터 훈련 세트에서 결정된 바와 같은)는 기계 학습 모형 (가령, 나이브 베이스 모형을 구축하는데 이용되었는데, 이것은 새로운 데이터 포인트가 특정한 군에 속하는 베이지안 확률에 근거하여, 이전에 규정된 군을 분류한다. 이러한 모형에서, 파라미터는 이들이 서로로부터 독립된 것으로 가정되고 (순진하게), 그리고 참조와 비교된다. 이후, 각 군에서 관련되는 전반적인 점수 또는 확률이 전산되고 출력으로서 제공된다. 일정한 군으로부터 가장 높은 점수/확률은 참조로서 호출된 군으로서 규정된다. 이후, 미지의 스펙트럼은 파라미터를 도출하기 위해 처리되었고, 그리고 이들은 훈련 세트로부터 각 개별 군의 확률을 확인하기 위해 훈련 세트에 대하여 비교되었다. 가장 높은 확률을 갖는 군은 본래 스펙트럼에 배정되고 서열 정렬에 이용된다. 이러한 방법은 서열과 구조 둘 모두의 동시 확인을 허용한다. 이용될 수 있는 데이터 분류를 위한 다른 기계 학습 과정 또는 알고리즘 (감독된 기계 학습)은 다음을 포함한다: 분석적 학습, 인공 신경망, 역전파, 부스팅 (메타 알고리즘), 베이지안 통계, 사례-기초된 추론, 의사결정 나무 학습, 귀납 논리학 프로그래밍, 가우스 과정 회귀, 데이터 취급의 군 방법, 커널 추정량, 학습 오토마타, 최소 메시지 길이 (의사결정 나무, 결정 그래프 등), 다중선형 부공간 학습, 나이브 베이스 분류기, 최근접 이웃 알고리즘, 아마도 대략 정확한 학습 (PAC) 학습, 리플 다운 규칙, 지식 획득 방법, 상징 기계 학습 알고리즘, 상징이하 기계 학습 알고리즘, 서포트 벡터 기계, 랜덤 포레스트, 식별자의 앙상블, 순차적인 분류, 데이터 전처리, 불균형된 데이터세트 취급, 통계학적 관계 학습, Proaftn, 그리고 다규준 분류 알고리즘.

다른 구체예에서, 터널링 전류 데이터로부터 도출된 파라미터, 예를 들면, HOMO, LUMO, 밴드 갭, 전이 전압 (양성과 음성), 전자/구멍 유효 질량의 비율, 전자와 구멍에 대한 Φ₀ 및 △Φ₀에 대한 값이 확인되었다. 이들 값은 다양한 환경에서 변형되지 않은 호모 소중합체 또는 변형된 (NMIA 또는 DMS로) 호모 소중합체 둘 모두에 대해 확인되었다. "훈련 세트"로서 지칭된 이들 확인된 파라미터는 충분히 특징화된, 공지된 서열, 예를 들면, 변형을 내포하는 또는 결여하는 호모폴리뉴클레오티드로부터 획득되었다. 훈련 세트로부터 파라미터 값은 이후, 참조로서 기계 학습 모형을 구축하는데 이용되었다. 다양한 기계 학습 모형, 예를 들면, 나이브 베이스 모형이 이용될 수 있는데, 이것은 새로운 데이터 포인트가 특정한 군에 속하는 베이지안 확률에 근거하여, 이전에 규정된 군을 분류한다. 이러한 모형에서, 파라미터는 서로로부터 독립된 것으로 가정되고 (순진하게), 그리고 참조와 비교된다. 이후, 새로운 데이터 포인트가 각 군에 속하는 전반적인 점수 또는 확률이 전산되고 출력으로서 제공된다. 일정한 군으로부터 가장 높은 점수/확률은 호출된 군으로서 규정된다.

그 다음, 터널링 전류 데이터가 미지의 핵염기에 대해 수집된다. 이러한 터널링 전류 데이터는 다양한 파라미터에 대한 값을 결정하기 위해 처리되었다: HOMO, LUMO, 에너지 밴드갭 V_{트랜스, e-}, V_{트랜스, h+}, Φ_0,e-, Φ_0,h+, △Φ 및 m_{eff e-}/m_{eff h+}. 이들 값은 이후, 미지의 핵염기가 훈련 세트로부터 개별 군에 속하는 확률을 확인하기 위해, 훈련 세트로부터 획득된 값에 대하여 비교된다. 호출된 군 (미지의 핵염기의 군에 정합하는 가장 높은 확률을 갖는 군)은 상기 핵염기에 배정되고 서열 정렬에 이용된다. 이러한 방법은 서열과 구조 둘 모두의 동시 확인을 허용한다. 이용될 수 있는 데이터 분류를 위한 다른 기계 학습 과정 (감독된 기계 학습)은 다음을 포함한다: 분석적 학습, 인공 신경망, 역전파, 부스팅 (메타 알고리즘), 베이지안 통계, 사례-기초된 추론, 의사결정 나무 학습, 귀납 논리학 프로그래밍, 가우스 과정 회귀, 데이터 취급의 군 방법, 커널 추정량, 학습 오토마타, 최소 메시지 길이 (의사결정 나무, 결정 그래프 등), 다중선형 부공간 학습, 나이브 베이스 분류기, 최근접 이웃 알고리즘, 아마도 대략 정확한 (PAC) 학습, 리플 다운 규칙, 지식 획득 방법, 상징 기계 학습 알고리즘, 상징이하 기계 학습 알고리즘, 서포트 벡터 기계, 랜덤 포레스트, 식별자의 앙상블, 순차적인 분류, 데이터 전처리, 불균형된 데이터세트 취급, 통계학적 관계 학습, Proaftn, 그리고 다규준 분류 알고리즘.

실시예 3- 전이 전압 값

단일 분자 (여기에서 뉴클레오티드)로부터 터널링 전류 데이터의 상술된 분석이 또한, 염기서열결정 적용에서 핵염기의 확인을 더욱 보조하기 위해 수행되었다. 이들 실험을 위해, 터널링 전류가 파울러 노드하임 (F-N) 플롯을 이용하여 분석되었다. 이러한 분석은 단일 뉴클레오티드를 통한 전하 터널링을 지배하는 근원적인 생물물리학적 파라미터를 확인하기 위해 수행되었다. 터널링 전류 (I)-전압 (V) 데이터는 전이 전압 (V_트랜스) 및 터널링 체제 (삼각형 장벽에 대한)의 기울기를 도출하기 위해, ln(I/V²) 대 (1/V)로서 플롯팅되었다. 이러한 분석의 실례는 도면 4e에서 T에 대한 F-N 플롯에서 도시된다. 전이 전압, V_트랜스,e-는 터널링으로부터 전계 방출 체제로의 전이를 나타내고, 그리고 기울기, S는 터널링 장벽 (여기에서 전자에 대한)의 척도이다.

터널링으로부터 전계 방출로의 전이 전압, 그리고 전하 터널링에 대한 장벽을 지시하는 기울기와 같은 터널링 파라미터의 세심한 분석 시에, 3가지 생물물리학적 파라미터/상수가 도출될 수 있다. 이들 터널링 상수 (V_트랜스,h+, V_트랜스,e- ,S=S_e+S_h)는 전하가 터널링되는 분자 (여기에서 뉴클레오티드)의 특징을 이루었고, 그리고 각각, HOMO-LUMO와 밴드갭에 대한 추가 성능 지수를 개발하는데 이용되었다. 가령, V_트랜스,h+를 이용하여 구멍 터널링 확률에서 변화를 분석 시에, 이것은 상이한 pH 조건 하에 뉴클레오티드에 대한 HOMO 수준처럼 이용될 수 있는 것으로 관찰되었다 (도면 21, 표 III). 유사하게, V_트랜스,e-는 LUMO 수준과 유사하게, 전자 터널링의 용이함을 나타낸다 (더욱 낮은 값은 더욱 쉬운 전자 터널링을 보여준다). 기울기 S는 이들 생체분자에서 관찰된 밴드갭을 모의한다. 더욱 세심한 분석 시에, 유사한 행태가 이들 파울러 노드하임 (F-N) 전이 전압 (V_트랜스)에 대해 관찰되었다 (도면 21, 표 III). V_트랜스는 전자 또는 구멍의 삼각형 터널링으로부터 전계 방출로의 이동을 나타낸다. V_트랜스는 HOMO (V_트랜스,h+)와 LUMO (V_트랜스,e-) 수준과 pH에 따른 동일한 패턴을 보여주는데, 이것은 DNA와 같은 생체분자에 대해 적용된 F-N 터널링의 배경이 되는 생물물리학적 이론을 확증한다. 따라서, 이들 터널링 파라미터는 이러한 작업에서 개발된 추가 새로운 QM-Seq 서명/성능 지수로서 이용될 수 있다.

전이 전압 (V_트랜스)을 계측함으로써 생체분자에서 직접적인 터널링으로부터 파울러 노드하임 터널링으로의 전이를 이용하여, 우리는 터널링 장벽 높이 (금속 첨단부 페르미 수준 (E _F ) 및 프론티어 분자 궤도, 다시 말하면, HOMO 또는 LUMO 사이에 에너지 상쇄)를 추정한다. 적용된 바이어스 전압 (바이어스)이 장벽 높이보다 적을 때, 직접적인 터널링이 지배적인 운반 기전에 배정된다. 제로-바이어스 한계에서, 상기 장벽은 직사각형인 것으로 가정되고, 그리고 근사될 수 있는데, 여기서 효과적인 전자 질량은 일치하고, 장벽 높이는 일치하고, d는 터널링 거리이고, 그리고 h (ħ=h/2π)는 플랑크 상수이다. 높은 바이어스 전압에서, 전도 기전은 파울러 노드하임 터널링, 또는 전계 방출에 의해 지배되고, 그리고 삼각형 장벽이 근사될 수 있다. 이런 이유로, 직접적인 터널링 (F-N 플롯에서 대수)으로부터 파울러 노드하임 터널링 (F-N 플롯에서 선형)으로의 전이는 F-N 플롯 (ln(I/V ²) 대 1/V) 상에서 변곡점 (V_트랜스)을 전시한다. 직사각형 (V = 0 V)으로부터 사다리꼴 (V < Ф _B /e), 이후 삼각형 형태 (V > Ф _B /e)로의 터널링 곡선의 모양에서 전이는 증가하는 바이어스에서 목격될 수 있다. 이런 이유로, V_트랜스는 직사각형으로부터 삼각형 장벽으로의 전이를 계측하고, 따라서 생체분자에서 터널링 운반과 연관된 본래 직사각형 장벽의 높이를 계측하는 실험적 방법을 제공한다.

이들 실험은 뉴클레오티드 서열을 통한 전자 (V_트랜스,e-)와 구멍 (V_트랜스,h+) 터널링에 대한 이들 파라미터가 서명 성분을 나타내고, 그리고 서열을 특징짓고 확인하기 위해 HOMO-LUMO와 밴드 갭 값과 유사하게 이용될 수 있다는 것을 지시한다. 개별 뉴클레오티드에 대한 이들 파라미터를 도출 시에, 도면 4f에 나타나 있는 바와 같이, 산성 조건 하에 V_트랜스,e-와 V_트랜스,h+ 값의 분리가 관찰될 수 있다 (표 III, 그리고 상기 논의). 상이한 pH 조건 하에 전자와 구멍 전이 전압에서 유사한 이동 역시, 도면 21 및 표 III에 나타나 있는 바와 같이 관찰되었다. 이런 이유로, HOMO-LUMO 수준, V_트랜스 및 기울기 (S)를 확인 서명의 성분 (또는 파라미터)으로서 이용하여, 뉴클레오티드는 전하 (전자와 구멍) 터널링 데이터를 이용하여 분리될 수 있다.

실시예 4- AmpR 염기서열결정

가령, 그리고 아래에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 개시된 기술은 베타 락탐 항생제에 내성을 인코딩하는 ampR 유전자의 85와 700 nt 영역; 그리고 HIV-1 RNA분해효소 서열의 350 nt 영역의 서열 상에서 전자 지문 (또는 터널링 데이터)을 결정하는데 이용되었다. 본원에서 개시된 기술은 이들 염기서열결정 프로젝트에서 단일 양자 분자 염기서열결정 주사/판독에서 95% 이상의 성공률로 성공하였는데, 여기서 성공은 미지의 뉴클레오티드의 정체와 공지된 서열의 정체가 정합하는 것으로 규정된다. 많은 구체예에서, 성공률은 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 클 수 있다.

앞서 설명된 생물물리학적 연구와 생화학적 연구를 이용하여, 산성 pH는 식별가능한 이성질체 (A, G, T와 C에 대한 pKa가 각각, 4.1, 3.3, 9.9, 그리고 4.4이다)의 형성을 증진하는데 사용될 수 있고, 그리고 이들 식별가능한 이성질체는 단일 뉴클레오티드를 재현적으로 염기서열결정하는데 이용될 수 있는 것으로 결정되었다 (밴드 갭, HOMO-LUMO, V_트랜스 및 S를 이용하여, 도면 4a,b,e,f).

이들 실험에서, 산성 pH 하에 단일 STM-STS 계측은 단일 분자 DNA (STM을 이용하여) 및 단일 뉴클레오티드 (STS 데이터를 이용하여, 도면 5a에서 A 및 도면 22에서 T, G, C에 대해 도시된)를 염기서열결정하는데 이용되었다. 이것은 수 분의 시간 척도 내에서 달성가능하였다.

이러한 방법의 단순함, 그리고 약제 내성과 돌연변이 병원체를 연구하기 위한 잠재적 적용을 증명하기 위해, 세균 항생제 내성 유전자 ampR의 염기서열결정이 수행되었다. ampR 유전자는 병원체 치료에 유용한데, 그 이유는 이것이 페니실린 유래된 항생제를 저해하는 β-락타마아제를 인코딩하기 때문이다. ssDNA 용액은 생리학적 수준을 모의하기 위해, 낮은 농도 (1-5 nM)에서 제조되었다 (하기 참조, 도면 24).

암피실린 내성 유전자 (ampR) 유전자의 단일 가닥 DNA는 2 단계에서 획득되었다. 먼저, 이중 가닥 ampR DNA가 Phusion 높은-충실성 PCR 키트 (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써, 플라스미드 pZ12LUC 플라스미드 (Expressys, Germany)로부터 증폭되었다. 플라스미드 pZ12LUC는 genejet 플라스미드 미니프렙 키트 (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 대장균 (Escherichia coli) 균주 DH5α-Z1로부터 추출되었다. 전방 프라이머(CGAGCTCGTAAACTTGGTCTGA) 및 후방 프라이머 (GTGAAGACGAAAGGGCCTCG) (Invitrogen, USA)가 1091 bp의 ampR 유전자를 증폭하는데 이용되었다. 단일 가닥 ampR DNA는 주형 DNA로서 이중 가닥 ampR 및 전방 또는 후방 프라이머 단독을 이용한 두 번째 라운드의 PCR에 의해 획득되었다. 각 반응의 산물은 ZymoClean Gel DNA 회수 키트 (Zymo Research, USA)로 겔 추출을 이용하여 정제되고 0.1M Na₂SO₄에서 5 nM (1.7 ng/μL)까지 희석되었다 (생리학적 농도를 모의하기 위해, 도면 25). DNA 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계 (Thermo scientific, USA)를 이용하여 계측되었다.

앞서 설명된 3-단계 압출 침적 기술을 이용하여, ssDNA의 가늘고 긴 선형 가닥의 단일 분자가 기질 상에 재현적으로 침적되었다 (도면 6b, 그리고 도면 23). ampR DNA의 단일 가닥의 동시적 STM 영상과 STS 분광법이 수행되었다 (도면 6b,c,d에 나타나 있는 바와 같이). STS 주사 계측 셋업은 1 nm의 측면 분해능 (우리의 피에조 스캐너와 셋업의 분해능에 의해 제한됨, 하기를 참조한다)을 가졌다. STS 주사를 이용하여, 뉴클레오티드는 각 계측에서 정확하게 확인되고, 그리고 인접한 핵염기 역시 이차 확인 기술 (방법 참조)을 이용하여, 95% 이상의 정확도에서 확인되었다 (도면 6c). 전체적으로, 총 40개 뉴클레오티드가 ampR 유전자 상에서 85개 염기 영역 내에서 성공적으로 확인되었다 (도면 6c,d).

도면 36은 본 발명의 일부 구체예에 따른 서열분석기 100 (폴리뉴클레오티드 서열 결정 장치)의 한 가지 실례를 도해한다. 도면 36에 나타나 있는 바와 같이, 판독 헤드 106은 표본 108 위에 배치된다. 표본 108은 앞서 논의된 바와 같이, 편평한 (111) 정향된 금일 수 있는 기질 상에 배치된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 갖는 DNA 또는 RNA 표본의 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, 표본 108은 병진 스테이지 110 상에 배치되고, 그리고 판독 헤드 106이 고정된다. 일부 다른 구체예에서, 표본 108은 판독 헤드 106이 병진 스테이지 상에 적재되는 동안 고정될 수 있다. 판독 헤드 106은 앞서 논의되고 도면 1a와 3b에서 예시된 바와 같은 단일 첨단부 판독 헤드일 수 있고, 또는 도면 27(a)-(c)에서 예시된 바와 같은 첨단부의 어레이일 수도 있다. 표본 108은 예로서, 상기 실시예 1-3에서 논의되고, 그리고 도면 3b와 27(c)에서 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. 표본 108 위에서 판독 헤드 106의 배열은 예로서, 도면 1a, 3b, 그리고 27a-c에서 예시된다. 표본 108의 제조의 예시는 도면 3a에서 도해되고 상기에서 상세하게 논의된다.

도면 36에서 더욱 보여지는 바와 같이, 바이어스 전압 V는 바이어스 전압 발생기 104에 의해 표본 108 및 판독 헤드 106 사이에 산출되고, 그리고 전류 I는 전류 센서 116에 의해 계측된다. 바이어스 전압 발생기 104는 다양한 바이어스 전압 V에 걸쳐 주사하도록 프로세서 102에 의해 제어될 수 있고, 그리고 각 바이어스 전압 V에서 전류 I는 전류 센서 116에 의해 판독되고 프로세서 102에 제공된다. 따라서, 프로세서 102는 표본 108 위에서 판독 헤드 106의 각 x-y 위치에 대한 I/V 곡선 (스펙트럼, 터널링 데이터로서 달리 지칭됨)을 수집할 수 있다. 도면 36에서 더욱 보여지는 바와 같이, 프로세서 102는 병진 스테이지 110에 연계되는 스캐너 112를 제어하도록 연계된다. 병진 스테이지 110은 예로서, 표본 108을 판독 헤드 106에 관하여 스캐너 112에 의해 지향된 바와 같이 이동시킬 수 있는 압전 x-y-z 스테이지일 수 있다. 하지만, 표본 108을 정밀한 방식으로 이동시킬 수 있는 임의의 병진 스테이지가 활용될 수 있다.

프로세서 102는 이런 이유로, 판독 헤드 106에 관하여 표본 108의 위치를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 데이터 중추 104, 따라서 데이터 저장 126, 메모리 124, 인터페이스 122, 그리고 사용자 인터페이스 120에 더욱 연계될 수 있다. 데이터 저장 126은 고정된 저장, 예를 들면, 메모리 하드 드라이브, FLASH 드라이브, 자성 드라이브 등일 수 있다. 메모리 124는 데이터 및 소프트웨어 명령을 저장할 수 있는 휘발성 또는 비휘발성 메모리일 수 있다. 인터페이스 122는 외부 장치 또는 네트워크에 연결하는 임의의 인터페이스일 수 있다. 인터페이스 122는 예로서, 서열분석기 100을, 서열분석기 100에 의해 획득된 전자 서명 데이터의 분석을 수행하는 외부 전산 시스템에 연계하는데 이용될 수 있다. 사용자 인터페이스 120은 예로서, 비디오 스크린, 오디오 장치, 자판, 지시자 장치, 터치 스크린, 또는 프로세서 102가 사용자와 통신하도록 허용하는 다른 장치일 수 있다.

도면 37은 DNA 또는 RNA의 하나 또는 그 이상의 가닥의 염기서열결정을 제공하기 위해, 도면 36에서 도시된 염기서열결정 장치, 예를 들면, 서열분석기 100 상에서 이행될 수 있는 과정 200을 도해한다. 도면 37에 나타나 있는 바와 같이, 과정 100은 단계 202에서 판독 헤드 106을 배치함으로써 시작된다. 도면 36에 나타나 있는 바와 같이, 판독 헤드 106을 배치하는 것은 표본 108을 판독 헤드 106에 관하여 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 주사 위치결정은 첨단부를, (x,y) = (0,0)으로서 임의적으로 지정된 시작 위치에 배치함으로써 수행될 수 있다. 추가 반복은 주사 패턴에 따라 x,y 위치를 밟아 나갈 수 있다. z 위치 (판독 헤드 106 및 표본 108 사이에 거리)는 과정 200의 이행에 앞서, 금에 대한 터널링 정보를 이용한 보정 단계에 의해 조정되고 수정될 수 있다. 단계 204에서, I/V 데이터가 전류 (x,y) 위치에서 판독 헤드 106 상에 각 판독 첨단부에 대해 획득된다. 단계 206에서, 터널링 데이터 또는 I/V 데이터가 추후 분석을 위해 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 터널링 데이터 또는 I/V 데이터의 분석이 자료 획득과 동시에 수행될 수 있다.

단계 208에서, 프로세서 102는 주사가 완성되는 지를 확인하기 위해 점검한다. 주사는 터널링 데이터가 기질 상에 각 x-y 위치에서 수집되면 완성된다. 일부 구체예에서, 사용자는 분석을 위한 x-y 위치의 부분집합을 선별할 수 있다. 주사가 완성되지 않으면, 프로세서 102는 단계 202로 복귀하는데, 여기서 판독 헤드 106은 표본 108 위에서 다음 x-y 위치에서 배치된다. 주사가 완성되면, 데이터 분석이 단계 210에서 시작된다. 일부 구체예에서, 데이터 분석은 서열분석기 100에서 프로세서 102에 의해 수행될 수 있고, 그리고 서열분석기 100은 별개의 컴퓨터에서 추가 분석을 위해, 획득된 터널링 데이터를 전송할 수 있다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 프로세서 102는 데이터를 분석 컴퓨터 (도시되지 않음)에 제공할 수 있는데, 여기서 이러한 과정의 나머지가 달성된다.

단계 210에서, 획득된 터널링 데이터 또는 I/V 데이터에 근거하여, 개별 뉴클레오티드의 x-y 위치가 획득될 수 있다. 이러한 과정은 예로서, 도면 10a-b에 대하여 도해되고 상기 논의된다. 특히, dI/dV 데이터는 LUMO와 HOMO 피크를 확인하기 위해 분석될 수 있는데, 이것은 판독 헤드 106이 표본 108 내에 뉴클레오티드 위에 배치된다는 것을 지시할 수 있다. 단지 낮은 전압 피크만 획득되면, 판독 헤드 106은 금 기질 위에 배치된다. 다중첨단부 어레이에서, 각 첨단부로부터 데이터는 표본 108 상에서 개별 뉴클레오티드의 위치를 결정하기 위해 별도로 분석될 수 있다.

단계 212에서, 개별 파라미터는 뉴클레오티드 위에 있는 것으로 확인되는 각 x-y 위치에서 터널링 전류 데이터, 또는 I/V 데이터를 이용하여 계산된다. 파라미터는 전역에서 논의된 바와 같이, dI/dV, I/V², HOMO, LUMO, 에너지 밴드갭 V_{트랜스, e-}, V_{트랜스, h+}, Φ_0,e-, Φ_0,h+, △Φ 및 m_{eff e-}/m_{eff h}를 포함할 수 있다. (앞서 논의되고, 그리고 도면 36과 37에서 도해된 바와 같이). 뉴클레오티드에 대한 3가지 또는 그 이상의 파라미터 값의 수집물은 미지의 뉴클레오티드에 대한 전자 서명을 포함한다.

단계 214에서, 미지의 뉴클레오티드는 단계 212에서 획득된 뉴클레오티드의 서명 및 동일한 환경에서 수집된 공지된 뉴클레오티드에 대한 파라미터 값의 데이터베이스의 비교에 근거하여 확인된다. 비교를 위해, 미지의 핵염기의 서명을 결정하기 위해 선별된 파라미터 (가령, HOMO, LUMO, 밴드갭, V_트랜스,e-, 그리고 V_{트랜스, h+})의 값이 공지된 핵염기로부터 동일한 파라미터 (이 경우에, HOMO, LUMO, 밴드갭, V_트랜스,e-, 그리고 V_{트랜스, h+})의 값에 대하여 비교된다 (실시예 2에서 앞서 설명된 바와 같이). 다양한 구체예의 경우에, 공지된 핵염기의 파라미터의 값이 표 VIII-X에서 제공된다. 일부 구체예에서, 공지된 핵염기 (변형된 및 변형되지 않은)에 대한 이들 값은 값의 "참조 라이브러리"로서 지칭되고 데이터베이스에서 전자 데이터로서 저장될 수 있다.

개별 변형된 또는 변형되지 않은 올리고로부터 확인된 파라미터 (충분히 특징화된, 공지된 서열, 예를 들면, 변형을 내포하는 또는 결여하는 호모폴리뉴클레오티드로부터 훈련 세트에서 결정된 바와 같이)는 기계 학습 모형 (가령, 새로운 데이터 포인트가 특정한 군에 속하는 베이지안 확률에 근거하여, 이전에 규정된 군을 분류하는 나이브 베이스 모형)을 구축하는데 이용된다. 이러한 모형에서, 파라미터는 이들이 서로로부터 독립된 것으로 가정되고 (순진하게), 그리고 참조와 비교된다. 이후, 파라미터 지문이 각 군에 속하는 전반적인 점수 또는 확률이 전산되고 출력으로서 제공된다. 파라미터 지문이 일정한 군으로부터 도출되는 가장 높은 점수 또는 확률이 규정된다. 이후, 미지의 파라미터 지문은 모형 내에 훈련 세트로부터 각 개별 군에 속하는 파라미터 지문의 확률을 확인하기 위해 상기 모형에 대하여 비교된다. 가장 높은 확률을 갖는 군은 본래 스펙트럼에 배정되고 서열 정렬에 이용된다. 이러한 방법은 서열과 구조 둘 모두의 동시 확인을 허용한다. 일부 구체예에서, 파라미터 지문은 핵염기가 확인됨에 따라서 모형에 부가될 수 있다.

이용될 수 있는 데이터 분류를 위한 다른 기계 학습 과정 (감독된 기계 학습)은 다음을 포함한다: 분석적 학습, 인공 신경망, 역전파, 부스팅 (메타 알고리즘), 베이지안 통계, 사례-기초된 추론, 의사결정 나무 학습, 귀납 논리학 프로그래밍, 가우스 과정 회귀, 데이터 취급의 군 방법, 커널 추정량, 학습 오토마타, 최소 메시지 길이 (의사결정 나무, 결정 그래프 등), 다중선형 부공간 학습, 나이브 베이스 분류기, 최근접 이웃 알고리즘, 아마도 대략 정확한 학습 (PAC) 학습, 리플 다운 규칙, 지식 획득 방법, 상징 기계 학습 알고리즘, 상징이하 기계 학습 알고리즘, 서포트 벡터 기계, 랜덤 포레스트, 식별자의 앙상블, 순차적인 분류, 데이터 전처리, 불균형된 데이터세트 취급, 통계학적 관계 학습, Proaftn, 그리고 다규준 분류 알고리즘.

앞서 논의된 바와 같이, 터널링 전류 데이터로부터 도출된 파라미터, 예를 들면, HOMO, LUMO, 밴드 갭, 전이 전압 (양성과 음성), 전자/구멍 유효 질량의 비율, 전자와 구멍에 대한 Φ₀ 및 △Φ₀에 대한 값이 확인되었다. 이들 값은 다양한 환경에서 변형되지 않은 호모 소중합체 또는 변형된 (NMIA 또는 DMS로) 호모 소중합체 둘 모두에 대해 확인되었다. "훈련 세트"로서 지칭된 이들 확인된 파라미터는 충분히 특징화된, 공지된 서열, 예를 들면, 변형을 내포하는 또는 결여하는 호모폴리뉴클레오티드로부터 획득되었다. 훈련 세트로부터 파라미터 값은 이후, 참조로서 기계 학습 모형을 구축하는데 이용되었다. 다양한 기계 학습 모형, 예를 들면, 나이브 베이스 모형이 이용될 수 있는데, 이것은 새로운 데이터 포인트가 특정한 군에 속하는 베이지안 확률에 근거하여, 이전에 규정된 군을 분류한다. 이러한 모형에서, 파라미터는 서로로부터 독립된 것으로 가정되고 (순진하게), 그리고 참조와 비교된다. 이후, 새로운 데이터 포인트가 각 군에 속하는 전반적인 점수 또는 확률이 전산되고 출력으로서 제공된다. 일정한 군으로부터 가장 높은 점수/확률은 호출된 군으로서 규정된다.

단계 216에서, 데이터 분석이 완전하지 않으면 (가령, 각 확인된 핵염기 부위에서 모든 데이터가 분석되지 않으면), 과정은 단계 212로 복귀한다. 하지만, 모든 데이터가 분석되면, 이러한 과정은 단계 218에서 결정된 서열을 전시한다.

표 VII: 염기 호출을 위해 DNA 뉴클레오티드 (A, T, G, C)에 대한 전자 지문을 결정하는데 이용된 생물물리학적 파라미터에 대한 "참조 라이브러리". 이들 값은 표에서 열거된 pH 환경에서, 코팅된 (폴리 리신, 앞서 설명된 바와 같이) 또는 코팅되지 않은 Au(111) 기질 상에서 결정되었다.

표 VIII: 염기 호출을 위한 변형된 (메틸화된) DNA 뉴클레오티드 (A, T, G, C)에 대한 전자 지문으로서 이용된 생물물리학적 파라미터에 대한 "참조 라이브러 리"

표 IX: 염기 호출을 위한 변형된 RNA 뉴클레오티드 (A, U, G, C)에 대한 전자 지문으로서 이용된 생물물리학적 파라미터에 대한 "참조 라이브러리"

표 X: 염기 호출을 위한 변형된 RNA 변형 (A, U, G, C)에 대한 전자 지문으 로서 이용된 생물물리학적 파라미터에 대한 "참조 라이브러리"

실시예 5- 변형된 핵염기의 검출

이들 실험을 위해, DNA 소중합체는 디메틸 황산염 (DMS)을 이용하여 메틸화되었다 (도면 8a). 메틸화는 후성적 유전자 침묵을 위한 특히 중요한 변형이고, 그리고 암과 같은 질환의 초기 발병의 검출에 잠재적으로 이용될 수 있다. DNA 메틸화는 비메틸화된 뉴클레오티드와 비교하여, 메틸화된 뉴클레오티드의 생화학적 구조의 변화를 유발한다 (도면 8b,8c, 24a). 디메틸 황산염은 DNA와 반응하여 단일 가닥 영역 상에서 구아닌과 아데닌을 메틸화하는 것으로 알려져 있고, 반면 시토신은 제한된 정도로 반응하는 것으로 알려져 있다. 생체내에서, DNA는 메틸화된 시토신 염기, 구체적으로, 5-메틸시토신을 내포할 수 있다. 다른 잠재적인 메틸화된 염기는 5-히드록시메틸시토신, 7-메틸구아노신, N6-메틸아데노신을 포함한다.

메틸화는 전하 터널링의 확률을 변화시킬 수 있고, STS 계측은 스펙트럼에서 결과적인 변화를 조사하기 위해 수행되었다. 관찰된 바와 같이 (도면 8, 24, 표 VI), 퓨린 또는 피리미딘 고리의 화학적 변형은 접합에 영향을 주고, 그리고 전자와 구멍 둘 모두의 터널링 확률을 감소시킨다.

표 VI: 변형된 금 표면 상에서 메틸화되고 비메틸화된 A, C와 G에 대한 LUMO, HOMO, 밴드 갭 에너지 수준의 요약. 값은 평균 ± 표준 편차에 상응한다.

DNA의 메틸화

DNA 메틸화는 메탄올에서 800 μM까지 희석한 후에, 디메틸 황산염 (DMS) (SPEX CertiPrep, USA)을 이용하여 수행되었다. 10 μL의 DNA 소중합체 (20μM)는 10 μL의 800 μM DMS (DNA 소중합체에 대하여 2.6 과잉에 동등한)와 혼합되고 실온에서 24 시간 동안 배양되었다. 메틸화된 DNA는 표준 에탄올 침전을 이용하여 침전되었다. 용액은 무균 재증류수로 90 μL까지 희석되고, 그 이후에 10 μL의 아세트산나트륨 (3M, pH 5.5) 및 200 μL의 냉각된 무수 에탄올의 첨가가 이어졌다. 용액은 혼합되고 -20℃에서 최소한 20 분 동안 배양되었다. 그 후에, 이것은 13,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액이 제거되었다. 획득된 DNA 펠렛은 500 μL와 1000 μL의 70% 에탄올로 2회 세척되고, 그 이후에 원심분리되었다. 청소된 DNA는 이후, 무균수에서 재현탁되고, 그리고 이의 농도가 Nanodrop을 이용하여 결정되었다. 획득된 메틸화된 DNA는 STM에서 계측을 위해 0.1M Na₂SO₄를 이용하여 절반까지 희석되었다.

구아닌과 아데닌 뉴클레오티드의 메틸화 (도면 8b,c)는 LUMO와 HOMO 에너지 수준 둘 모두의 증가를 유발하고, 따라서 개별 HOMO/LUMO 에너지 갭 역시 증가시켰다 (도면 8d,e). 전자 에너지 수준에서 관찰된 변화는 도면 8b,c에서 이성질체에서 도시된 바와 같이, 접합의 상실을 유발하는 퓨린의 메틸화에 기인할 수 있다. 접합의 상실은 전자와 구멍 둘 모두의 터널링에 대한 더욱 큰 장벽을 유발할 수 있다 (도면 8d,e, 표 VI). 메틸화는 또한, 피리미딘에서 연구되었고 (도면 9a,b, 표 VI), 그리고 상응하는 전자 이동이 관찰되었다. 이들 조사 이후에, DNA의 단일 가닥이 메틸화되었다. 이들 연구로부터 결과는 메틸화된 뉴클레오티드와 비메틸화된 뉴클레오티드가 단일 핵염기 분해능에서 식별될 수 있다는 것을 증명하였다 (도면 8a). 이들 결과는 단일 DNA 분자뿐만 아니라 이들 내에서 단일 뉴클레오티드 변형을 검출하기 위한 이러한 기술의 적용가능성을 가리킨다.

실시예 6- 대량 평행 염기서열결정

개시된 방법을 이용한 대량 평행 염기서열결정은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 한 구체예에서, 1 메가픽셀 (또는 1 메가팁) 2cm X 2cm 칩이 CCD 또는 카메라 칩과 유사한 과정에서 이용된다. 가령, 전압이 복수의 첨단부에 동시에 적용될 수 있고, 전류가 수집되고 저장되고, 그리고 복수의 첨단부로부터 모든 전류 값이 동시에 판독될 수 있다 (CCD 카메라와 유사). 전류가 판독된 후에, 대형 2cm X 2cm 기질에 걸쳐 전체 전류 전압 곡선을 재현하기 위해 다른 바이어스 전압이 적용될 수 있고, 그리고 기타 등등일 수 있다. 따라서, 수 천 개의 유전체가 배치되고 동시에 판독될 수 있다. 피에조는 다음 핵염기의 염기서열결정을 허용하기 위해, 표본을 몇 옹스트롬 이동시키는데 이용될 수 있고 - 그리고 이러한 과정은 추가 핵염기를 분석하기 위해 반복될 수 있다. 이런 이유로, 단일 2 마이크로미터 주사 움직임 (또는 피에조 주사)에서, 대량 평행 서열분석기로서 셋업된 개시된 방법은 단순한 미소유체 장치를 이용하여 패턴화된 상대적으로 큰 표본 바이오칩 상에서 모든 가능한 핵염기를 염기서열결정할 수 있다. 다양한 구체예에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 다양한 크기, 예를 들면, 약 1.0 cm 보다 작은 크기를 갖는 기질 위에 압출될 수 있다.

도면 27a는 단순한 광학적 석판인쇄, 그 이후에 비등방성 KOH 에칭을 이용하여, 센티미터 규모 광학적으로 창출된 첨단부 패턴의 그림이다. 다중첨단부 서열분석기는 변형된 주형 스트리핑 과정을 이용하여 제작된 메가픽셀 첨단부 어레이를 이용하여 만들어질 것이다 (Nagpal et. al., Science, 325, 594, 2009). 만약 그렇지 않으면 보호된 실리콘 (100) 표면에서 환상 또는 사각형 구멍의 광학적 석판인쇄를 이용함으로써, 우리는 자기 한정 비등방성 수산화칼륨 에칭 (KOH 에칭) 과정을 활용하여 부드러운 실리콘 웨이퍼 상에 패턴화된 반전된 피라미드 디벳을 만들었다. 반전된 피라미드 첨단부는 주기적이고, 그리고 주기성, 패킹, 그리고 패턴화가 노출된 실리콘 웨이퍼의 광학적 석판인쇄를 이용하여 쉽게 변화된다. 이들 반전된 피라미드는 이후, 금, 은, 또는 구리 금속으로 코팅되고, 그 이후에 기계적으로 안정된 필름을 허용하기 위한 에폭시 또는 두꺼운 전착된 금속-층 받침으로 뒤채움이 이어진다. 이들 귀금속이 실리콘 주형에 부착되지 않기 때문에, 이들 패턴화된 메가픽셀 첨단부 어레이는 벗겨지고, 그리고 이러한 메가픽셀 첨단부 어레이는 판독기 어레이 및 CCD-유형 메가픽셀 판독을 이용하여, 패턴화된 양자 서열 판독기를 만드는데 이용될 것이다. 미소유체 장치 치수는 대량 평행 자료 획득 및 뉴클레오티드 서열, 변형과 구조의 검출을 할 수 있게 하기 위해, 메가픽셀 첨단부 판독기의 주기성과 정합된다. 도면 27b는 금으로부터 만들어진 높은 충실성 및 주기적으로 패턴화된 STM 첨단부를 보여주는 SEM 이미지이다. 울트라플랫 기질 상에서 큰 면적 (cmXcm) 규모 STM 칩을 이용하여, 2 μm x 2 μm 표면이 주사되고, 그리고 대량 평행 주사 및 칩으로부터 단순한 판독에 의해, 상기 도면에서 도시된 것들과 유사한, cm 규모에서 전체 서열을 창출할 수 있다.

특허 또는 비-특허인지에 상관없이, 본원에서 개시된 모든 참고문헌은 마치 각각이 전체적으로 이의 인용에서 포함되는 것처럼, 본원에 참조로서 편입된다.

비록 본 발명이 일정한 정도의 특수성에서 설명되긴 했지만, 본 발명은 예시로서 만들어졌고, 그리고 상세 또는 구조에서 변화가 첨부된 청구항에서 규정된 바와 같은 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있는 것으로 이해된다.

Claims

첫 번째 미지의 핵염기를 확인하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
주사형 터널링 현미경검사를 이용하여 첫 번째 미지의 핵염기에 대한 전자 서명을 결정하여 터널링 전류 데이터를 수집하고;
첫 번째 미지의 핵염기의 전자 서명을 하나 또는 그 이상의 공지된 핵염기에 대한 전자 지문에 비교하고;
첫 번째 미지의 핵염기의 전자 서명을 공지된 핵염기의 전자 지문에 정합하고; 그리고 따라서
첫 번째 미지의 핵염기를 확인함.
청구항 1에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기의 전자 서명 및 공지된 핵염기의 전자 지문은 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)의 값에서 선택되는 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지, 또는 최소한 9가지 값을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 2 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기는 하나 또는 그 이상의 인산염 분자를 통해 두 번째 미지의 핵염기에 공유 부착된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서, 두 번째 미지의 핵염기는 청구항 1의 방법에 의해 확인된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기는 변형되고 변형되지 않은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민과 우라실로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기의 전자 서명은 산성, 중성과 염기성에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 pH 환경에서 결정되고, 그리고 동일한 pH 환경에서 수집된 하나 또는 그 이상의 공지된 염기의 전자 지문과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서, pH 환경은 염기성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 7에 있어서, pH는 보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서, pH 환경은 산성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9에 있어서, pH는 3보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9 또는 10 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 pH 환경은 염기성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, pH는 9보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기는 리보오스 또는 데옥시리보오스 분자에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 13 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기는 메틸화된 핵염기인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 14 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 미지의 핵염기의 전자 서명은 부드러운 정연한 금 기질 상에서 결정된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 15에 있어서, 부드러운 정연한 금 기질은 Au(111)인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 16에 있어서, 부드러운 정연한 금 기질은 플라즈마 세정에 종속된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 15 내지 17 중에서 어느 한 항에 있어서, 부드러운 정연한 금 기질은 코팅된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서, 코팅은 기질을 하나 또는 그 이상의 이온성 분자를 포함하는 용액으로 처리함으로써 형성된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 19에 있어서, 용액은 폴리-L-리신을 포함하고, 그리고 기질은 하전된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 15 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 핵염기는 폴리뉴클레오티드 내에 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 21에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 압출과 침적의 과정에 의해 기질 상에 침적되고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 병진 운동으로 기질 위에 압출된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 11 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 통로 또는 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 23에 있어서, 통로 또는 웰은 미소유체 통로 또는 웰인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음을 포함하는 조성물:
기질, 여기서 기질은 부드러운 정연한 금 기질이고;
상기 기질 상에서 코팅; 그리고
상기 기질과 접촉하는 하나 또는 그 이상의 핵염기.
청구항 25에 있어서, 기질은 Au(111)인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 25 내지 26 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 하전된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 25 내지 27 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 플라즈마 세정에 종속된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 25 내지 28 중에서 어느 한 항에 있어서, 코팅은 기질을 하나 또는 그 이상의 이온성 분자를 포함하는 용액으로 처리함으로써 형성된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 29에 있어서, 용액은 폴리-L-리신을 포함하고, 그리고 기질은 하전된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 25 내지 30 중에서 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵염기가 폴리뉴클레오티드에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 31에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 압출과 침적의 과정에 의해 기질 상에 침적되고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 병진 운동으로 기질 위에 압출된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 25 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 통로 또는 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 33에 있어서, 통로 또는 웰은 미소유체 통로 또는 웰인 것을 특징으로 하는 조성물.
미지의 핵염기의 전자 서명을 결정하기 위한, 청구항 25 내지 34 중에서 어느 한 항의 조성물의 용도.
청구항 35에 있어서, 전자 서명은 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)의 값에서 선택되는 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지 값을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 35 내지 26 중에서 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵염기가 하나 또는 그 이상의 인산염 분자를 통해 두 번째 미지의 핵염기에 공유 부착된 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 37에 있어서, 두 번째 미지의 핵염기는 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)의 값에서 선택되는 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지 값을 포함하는 두 번째 미지의 핵염기의 전자 서명을 결정함으로써 확인된 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 35 내지 38 중에서 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵염기는 변형된 또는 변형되지 않은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민과 우라실로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 35 내지 39 중에서 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵염기의 전자 서명은 산성, 중성과 염기성에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 pH 환경에서 결정되고, 그리고 동일한 환경에서 수집된 하나 또는 그 이상의 공지된 염기의 전자 지문과 비교되는 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 40에 있어서, pH 환경은 염기성인 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 41에 있어서, pH는 9보다 큰 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 40에 있어서, pH 환경은 산성인 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 43에 있어서, pH는 3보다 작은 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 41 내지 44 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 pH 환경은 염기성인 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 45에 있어서, pH는 9보다 큰 것을 특징으로 하는 용도.
첫 번째 미지의 뉴클레오티드를 확인하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
폴리 리신 코팅된 울트라스무드 정향된 금 (111) 표면 상에 배치된 미지의 뉴클레오티드에서 주사형 터널링 분광법을 수행하고;
산성 pH에서 미지의 뉴클레오티드에 대한 주사형 터널링 데이터를 수집하고;
주사형 터널링 데이터를 처리하여 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)에서 선택되는 3가지 또는 그 이상의 파라미터에 대한 값을 산출하고;
HOMO 값이 -1.09 내지 -1.69이고;
LUMO 값이 약 1.66 내지 1.18이고;
밴드갭 값이 약 3.22 내지 2.40이고;
V_트랜스+ 값이 약 1.34 내지 0.96이고;
V_트랜스- 값이 약 -0.19 내지 -0.83이고;
Φ_e- 값이 약 2.02 내지 0.88이고;
Φ_h+ 값이 약 1.64 내지 0.42이고;
m_e-/m_h+ 값이 약 0.52 내지 0.06이고; 및/또는
△Φ 값이 약 3.46 내지 1.5이면 뉴클레오티드를 아데닌으로서 확인하고; 또는
HOMO 값이 -1.17 내지 -1.55이고;
LUMO 값이 1.72 내지 1.24이고;
밴드갭 값이 3.11 내지 2.57이고;
V_트랜스+ 값이 1.26 내지 1이고;
V_트랜스- 값이 -0.19 내지 -0.77이고;
Φ_e- 값이 1.63 내지 1.03이고;
Φ_h+ 값이 1.29 내지 0.29이고;
m_e-/m_h+ 값이 0.57 내지 0.07이고;
△Φ 값이 2.77 내지 1.47이면 뉴클레오티드를 구아닌으로서 확인하고; 또는
HOMO 값이 -1.47 내지 -2.15이고;
LUMO 값이 2.79 내지 1.99이고;
밴드갭 값이 4.69 내지 3.71이고;
V_트랜스+ 값이 1.65 내지 1.03이고;
V_트랜스- 값이 -0.54 내지 -1.06이고;
Φ_e- 값이 3.51 내지 1.73이고;
Φ_h+ 값이 2.2 내지 0.94이고;
m_e-/m_h+ 값이 0.95 내지 0.33이고;
△Φ 값이 5.36 내지 3.02이면 뉴클레오티드를 시토신으로서 확인하고; 또는
HOMO 값이 -1.19 내지 -1.57이고;
LUMO 값이 2.98 내지 2.38이고;
밴드갭 값이 4.38 내지 3.74이고;
V_트랜스+ 값이 1.8 내지 1.06이고;
V_트랜스- 값이 -0.25 내지 -0.63이고;
Φ_e- 값이 3.44 내지 2.06이고;
Φ_h+ 값이 1.25 내지 0.45이고;
m_e-/m_h+ 값이 0.5 내지 0.16이고;
△Φ 값이 4.34 내지 2.88이면 뉴클레오티드를 티민으로서 확인함.
다음을 포함하는 서열분석기:
프로세서;
최소한 하나의 양자 터널링 첨단부를 갖는 판독 헤드;
표본을 지지하는 스테이지, 상기 표본은 폴리뉴클레오티드에 결합된 핵염기의 하나 또는 그 이상의 군을 포함하고;
프로세서에 연계되고 판독 헤드 및 스테이지 사이에 전압을 제공하는 바이어스 전압;
바이어스 전압 및 판독 헤드 사이에 연계된 전류 센서, 상기 전류 센서는 전류를 프로세서에 제공하고,
여기서 프로세서는 표본에 걸쳐 한 세트의 위치에서 전자 서명 데이터를 획득하고 전자 서명 데이터를 위치에 따라 저장하도록 하는 명령을 이행하고, 그리고
여기서 개별 핵염기는 전자 서명 데이터에 근거하여 확인될 수 있음.
청구항 48에 있어서, 판독 헤드는 단일 첨단부 판독 헤드인 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 48에 있어서, 판독 헤드는 다중첨단부 어레이이고, 상기 다중첨단부 어레이는 다중첨단부 어레이의 개별 첨단부로부터 전류가 독립적으로 판독될 수 있도록 배열된 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 50에 있어서, 다중첨단부 어레이의 개별 첨단부로부터 전류는 동시에 판독되는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 48에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 전도성 기질 위에 압출된 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 52에 있어서, 전도성 기질은 폴리뉴클레오티드가 압출되는 통로를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 52 또는 53에 있어서, 전도성 기질은 편평한 (111) 금 기질인 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 48에 있어서, 프로세서는
(a) 판독 헤드를 시작 위치에서 표본에 관하여 배치하고;
(b) 전압을 주사하고 전류를 계측하여 전자 서명 데이터를 획득하고;
(c) 전자 서명 데이터를 판독 헤드 및 표본 사이의 위치에 관하여 저장하고;
(d) 판독 헤드를 표본에 관하여 주사 패턴에 따라 재배치하고; 그리고
(e) 주사 패턴이 완전할 때까지 단계 (b) 내지 (e)를 반복하도록 하는 명령을 이행하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 48에 있어서, 프로세서는
전자 서명 데이터에 근거하여 핵염기의 위치를 확인하고;
확인된 위치에서 전자 서명 데이터로부터 파라미터 지문을 계산하고; 그리고
파라미터 지문에 근거하여 핵염기를 확인하도록 하는 명령을 더욱 이행하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 48에 있어서, 전자 서명 데이터는
전자 서명 데이터에 근거하여 핵염기의 위치를 확인하고;
확인된 위치에서 전자 서명 데이터로부터 파라미터 지문을 계산하고; 그리고
파라미터 지문에 근거하여 핵염기를 확인하도록 하는 명령을 이행하는 별개의 전산 시스템에 제공된 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 56 또는 58에 있어서, 핵염기의 위치는
전자 서명 데이터로부터 dI/dV, HOMO와 LUMO 파라미터를 계산하고;
이들 파라미터를 전도성 기질의 것들과 비교하고; 그리고
첨단부가 단지 전도성 기질 위에만 배치되는 곳 및 첨단부가 비교에 근거하여 핵염기 위에 배치되는 곳을 확인함으로써 확인된 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 56 또는 57에 있어서, 파라미터 지문을 계산하는 것은 LUMO, HOMO, 밴드갭, V_트랜스+ (V), V_트랜스- (V), Φ_e- (eV), Φ_h+ (eV), m_e-/m_h+ 및 △Φ (eV)의 군에서 선택되는 파라미터 중에서 최소한 3가지, 최소한 4가지, 최소한 5가지, 최소한 6가지, 최소한 7가지, 최소한 8가지 또는 최소한 9가지를 전자 서명 데이터로부터 계산하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 59에 있어서, 파라미터 지문에 근거하여 핵염기를 확인하는 것은 파라미터 지문을 지문 데이터베이스에서 저장된 공지된 지문과 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
청구항 60에 있어서, 파라미터 지문을 비교하는 것은 파라미터 지문이 지문 데이터베이스에서 저장된 공지된 지문의 군의 범위 안에 있는 확률을 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 서열분석기.
하나 또는 그 이상의 핵염기를 포함하는 조성물을 확인하기 위한 장치에 있어서, 상기 장치는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치:
금 기질, 여기서 금 기질은 플라즈마 세정에 종속된 부드러운 정연한 Au(111)이고; 그리고
이온성 중합체를 포함하는 이온성 코팅.
청구항 62에 있어서, 중합체는 폴리-리신인 것을 특징으로 하는 장치.