CN116078427A - 一种纳米酶及采用其检测核基质蛋白22的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种纳米酶及采用其检测核基质蛋白22的方法。该纳米酶为磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子，实验中我们发现，不同的卤化物阴离子可以调节钙钛矿纳米粒子的催化活性。磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子具有明显提高的催化活性。尤其是CsPbI3NCs@PL的类过氧化物酶催化效率比CsPbBr3NCs@PL高24倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种纳米酶及采用其检测核基质蛋白22的方法。
背景技术
膀胱癌(BC)是泌尿系统的常见肿瘤。根据GLOBOCAN 2020全球癌症统计数据，BC是全球第10大流行癌症，2020年新增病例约573,000例，死亡病例213,000例。早期发现和及时干预是降低膀胱肿瘤复发和进展风险的关键。目前，膀胱镜检查仍是诊断BC的金标准，但具有侵入性，增加了患者的恐惧心理，并带来一定程度的医源性损伤和感染。因此，探索BC诊断的无创检查方法具有重要意义。近年来，许多具有潜在临床价值的新型肿瘤标志物被发现，如膀胱肿瘤抗原(BTA)、免疫细胞/UCYT+和细胞角蛋白(CK-18、CK-20和CYFRA21-1)等。其中，核基质蛋白22(NMP22)是核有丝分裂器蛋白复合物的一部分，其在膀胱癌尿液中的浓度比健康人尿液中的浓度高出30倍。美国食品和药物管理局(FDA)已将NMP 22认证为诊断BC的黄金肿瘤生物标志物(参见：Sajid,M.T.,Zafar,M.R.,Ahmad,H.,Ullah,S.,Mirza,Z.I.,Shahzad,K.,2020.Pak.J.Med.Sci.36(4),705-710；Zink,D.,Fischer,A.H.,Nickerson,J.A.,2004.Nat.Rev.Cancer 4(9),677-687)。目前，酶联免疫吸附测定(ELISA)是临床检测NMP 22的主要方法。然而，ELISA仍面临成本高、操作繁琐、天然酶易失活等缺点。
纳米酶是指在生理条件下催化类酶反应的纳米材料。由于纳米酶具有大规模制备、成本低和在苛刻条件下稳定性高等优点，已被广泛用于推进ELISA的发展。许多纳米材料的催化性能正在逐渐被发现，例如Fe3O4、金团簇、铂纳米粒子、金属有机框架和其他复合纳米材料。开发高效纳米酶替代天然酶可以提高免疫分析的检测性能。
钙钛矿纳米晶体(NCs)因其合成简单、荧光量子产率高、发射带宽窄等非凡的理化性质而成为光电子领域的新一代明星纳米材料。最近，我们课题组发现CsPbBr3 NCs作为一种代表性的钙钛矿纳米材料，可以作为一种新型的纳米酶，具有相当大的类过氧化物酶活性。基于此，一个典型的例子是磷脂包被的CsPbBr3 NCs(CsPbBr3 NCs@PL)作为检测前列腺癌特异性抗原(中国专利文献CN114295591A)。但CsPbBr3 NCs@PL催化活性相对较低，导致检测范围较窄，灵敏度较低，检出限较高，从而限制了它们潜在的临床应用。因此，非常需要开发一种简单的方法来提高钙钛矿的催化活性，这在钙钛矿的生物分析应用中起着至关重要的作用；然而，据我们所知，还没有关于钙钛矿类过氧化物酶活性调节的报道。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的钙钛矿纳米晶体应用于生物分析时存在的检测范围较窄，灵敏度较低，检出限较高的缺陷，从而提供了一种纳米酶及其制备方法。
为此，本发明提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子。
进一步的，所述的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子为CsPbI3纳米粒子、CsPbBr1I2纳米粒子或者CsPbBr2I1纳米粒子。
进一步的，所述磷脂选自1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-生物素)中的一种或者几种。在某些优选的实施方式中，磷脂由DOPC、DOPG和DSPE-PEG-生物素组成，采用市售产品，均可购自西安瑞禧生物有限公司，更优选的，磷脂由质量比为12:8:4的DOPC、DOPG和DSPE-PEG-生物素组成。在某些优选的实施方式中，所述纳米酶中磷脂与碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的质量比为0.5-2:0.2-0.3，更优选为1:0.24。
进一步的，本发明提供了上述任一所述的纳米酶的制备方法，包括：如下步骤：将含磷脂的溶液与含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液混合后在真空环境中除去有机溶剂，得到固体产物；固体产物与水溶液混合，超声，得到含有纳米酶的溶液。
进一步的，所述含磷脂的溶液中磷脂的添加量为170～300μg/mL。
进一步的，所述含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液中，碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的浓度为0.8～1.2μg/mL。
进一步的，所述磷脂溶液、含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液与水溶液的体积比为1～3：10～50：10～50。
进一步的，还包括纯化步骤，纯化步骤为含有纳米酶的溶液离心，取沉淀物，将沉淀物重新分散于水溶液中。例如在9000-13000rpm下离心5-15分钟。
本发明中的所述水溶液为纯水、PBS缓冲液、Tris缓冲液或醋酸钠缓冲液。
本发明还提供了一种检测尿液中核基质蛋白22的方法，所述方法为使用上述任一所述的纳米酶或者上述任一所述的方法制得的纳米酶对尿液中的核基质蛋白22进行检测。
进一步的，所述的检测尿液中核基质蛋白22的方法包括，
固定和封闭步骤：将初级抗原添加至酶标板中进行孵育，然后添加BSA溶液进行封闭；
孵育步骤：将NMP标准品溶液或者待测样品添加至封闭后的酶标板中进行孵育，然后将链霉亲和素标记的二级抗原添加至酶标板中进行孵育，再将生物素标记的权利要求1-3中任一所述的纳米酶以及显色底物TMB添加至酶标板中进行孵育，得到孵育产物；
检测步骤：采用酶联免疫吸附测定法检测孵育产物的吸光度值，根据标准品溶液的吸光度值和核基质蛋白22的浓度建立吸光度值与核基质蛋白22浓度之间的关系，结合待测样品测得的吸光度值，计算得到待测样品中核基质蛋白22的浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述检测步骤为：使用酶标仪检测孵育产物于685nm处的吸光度值，根据标准品溶液的吸光度值和核基质蛋白22的浓度拟合而得的拟合方程y＝–0.006+0.479lgx，结合待测样品测得的吸光度值，计算得到样品中NMP22的浓度。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供的纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子，实验中我们发现，不同的卤化物阴离子可以调节钙钛矿纳米粒子的催化活性。磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子具有明显提高的催化活性。尤其是CsPbI3 NCs@PL的类过氧化物酶催化效率比CsPbBr3 NCs@PL高24倍。
研究中，基于CsPbX3 NCs的增强型ELISA，用于检测尿液NMP22。通过钙钛矿的离子交换反应，我们合成了五种具有不同卤素的磷脂涂层CsPbX3 NCs(CsPbX3 NCs@PL)。同时磷脂(Phospholipid，PL)作为仿生保护涂层，不仅提高了钙钛矿纳米粒子的稳定性，还起到了防污作用，为后续的临床样品检测提供了极大的帮助。
实验表征和密度泛函理论(DFT)计算均证明，与其他对应物相比，磷脂包被的碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbI3 NCs@PL)表现出优异的过氧化物酶样反应活性。最后，基于这些发现，将CsPbI3 NCs@PL引入通用ELISA平台进行NMP22检测。灵敏度明显提高，最低检出限为0.03U/mL，在真实尿样中具有100％的灵敏度和94.3％的特异性。因此，我们的工作不仅揭示了磷脂包被的钙钛矿纳米粒子的纳米酶活性可以被卤素阴离子调节，而且还利用高活性碘掺杂钙钛矿纳米晶体来提高ELISA的检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CsPbX3 NCs和CsPbX3 NCs@PL的合成过程示意图。
图2为CsPbI3 NCs的透射电子显微镜(TEM)图像。
图3为CsPbI3 NCs@PL的TEM图像和元素映射图像。其中左侧为TEM图像，右侧(a)为HRTEM图，(b-f)为单个CsPbI3 NC@PL的元素映射图像，比例尺：20纳米。
图4为五个CsPbX3 NCs@PL的荧光光谱和相应的照片，光谱和照片从左到右依次为CsPbCl3 NCs@PL、CsPbBr3 NCs@PL、CsPbBr2I1 NCs@PL、CsPbBr1I2 NCs@PL、CsPbI3 NCs@PL。
图5为CsPbI3 NCs和CsPbI3 NCs@PL的动态光散射(DLS)分析。
图6为CsPbI3 NCs和CsPbI3 NCs@PL的傅立叶变换红外(FTIR)光谱。
图7为CsPbCl3 NCs@PL、CsPbBr3 NCs@PL和CsPbI3 NCs@PL以及H2O2处理后的TMB溶液的紫外-可见光谱和照片，光谱和照片从上到下依次为CsPbI3 NCs@PL、CsPbBr3 NCs@PL和CsPbCl3 NCs@PL。
图8为含有H2O2的TMB溶液与ZnI2、CsPbBr2I1 NCs@PL、CsPbBr1I2 NCs@PL和CsPbI3NCs@PL混合后的紫外-可见光谱和照片，光谱和照片从上到下依次为CsPbI3 NCs@PL、CsPbBr1I2 NCs@PL、CsPbBr2I1NCs@PL、和ZnI2。
图9为CsPbX3 NCs@PL催化下TMB的吸光度值比较(条形图数据表示为平均值±SD，n＝3)。
图10为CsPbI3 NCs@PL-ELISA的临床样本分析。(A)增强型ELISA测定的示意图。其中，Bladder cancer译为膀胱癌，Urine译为尿液。(B)使用CsPbI3 NCs@PL-ELISA(底部)、CsPbBr3 NCs@PL-ELISA(中间)和CsPbCl3 NCs@PL-ELISA(顶部)检测NMP22标准品的照片。
图11为CsPbI3 NCs@PL-ELISA的相应吸光度值(Absorbance)与不同浓度的NMP22(NMP22 concentration)的关系图。
图12为CsPbI3 NCs@PL-ELISA的选择性验证结果。误差条表示来自不同CsPbI3NCs@PL批次的三个测量值的标准偏差。
图13为通过本发明的方法检测不同组别(包括健康组Healthy)、良性膀胱炎对照组(Benign)、低级别膀胱癌患者(Low-grade)和高级别膀胱癌患者(High-grade))的尿液样本中NMP的吸光度值。**表示与健康组相比P<0.01，*表示与健康组相比P<0.05，ns表示与健康组相比无显着差异(P>0.05)。
图14为尿液样本数据的ROC曲线，横坐标为灵敏度(Sensitivity)，纵坐标为特异性(Specificity)。阴性对照组与阳性组(Negative vs Positive)的曲线下面积(AUC)为1，*P<0.05；低级别膀胱癌患者与高级别膀胱癌患者值(Low-grade vs High-grade)的AUC为0.918，*P<0.05。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明的数据统计分析方法如下：误差条表示来自不同批次的同种CsPbX3 NCs@PL三个测量值的标准偏差。除非另有说明，否则所有数据均以n＝3个独立批次重复的平均值±标准差表示。使用Origin 2020进行绘图和统计分析。使用未配对的双尾学生t检验对连续变量和分类变量的95％置信区间确定数据对之间的统计显着性。p<0.05的统计检验被认为具有统计学意义。
制备实施例1
本实施例提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbI3 NCs@PL)，原理图见图1所示。
所述纳米酶的制备方法包括如下步骤：
包裹步骤：将10mg的CsPbI3 NCs分散于9.8mL的氯仿中，得到分散液，取9.8mLCsPbI3 NCs氯仿分散液与200μL含DOPC、DOPG和DSPE-PEG-生物素的氯仿溶液混合。DOPC、DOPG和DSPE-PEG-生物素的最终浓度分别为120μg mL-1、80μg mL-1和40μg mL-1。CsPbI3 NCs的最终浓度为1mg/mL。随后，在真空环境下除去溶剂氯仿形成薄膜。然后，加入10mL纯水，超声处理30秒来水化薄膜，得到含有纳米酶的溶液。
纯化步骤：将含有纳米酶的溶液在13000rpm下离心15分钟以去除多余的脂质，得到沉淀物，将沉淀物重新分散于10mL醋酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.5)，得到含CsPbI3 NCs@PL的分散液，下述简称CsPbI3 NCs@PL。
其中，本实施例中采用的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子(CsPbI3 NCs)的合成方法，步骤如下：向10mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中加入0.1468gPbBr2、0.0851g CsBr、0.6mL油胺(2.5mM)和1.8mL油酸(8.4mM)。将混合物在90℃下搅拌2小时用作前体溶液。随后，将1mL前驱体溶液快速加入到50mL甲苯(Toluene)中，并在室温下持续搅拌2h。通过离心(9000rpm，5分钟)收集最终的CsPbBr3 NCs固体产物，并在室温下避光保存。
在连续搅拌下，将0.152mg的ZnI2作为阴离子源添加到10mL CsPbBr3NCs甲苯溶液(甲苯溶液中CsPbBr3 NCs的质量浓度为0.0232g/mL)中。CsPbBr3 NCs溶液发生明显的颜色变化，从绿色荧光变成红色荧光。整个阴离子交换反应在1分钟内完成。最后，通过以5000rpm离心5分钟，取固体，即得CsPbI3 NCs。
制备实施例2
本实施例提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbBr1I2 NCs@PL)。碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbBr1I2 NCs)和纳米酶的制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于碘掺杂钙钛矿纳米粒子制备过程中，将“0.152mg的ZnI2作为阴离子源”替换为“0.1mg的ZnI2作为阴离子源”。
制备实施例3
本实施例提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbBr2I1 NCs@PL)。碘掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbBr2I1 NCs)和纳米酶的制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于碘掺杂钙钛矿纳米粒子制备过程中，将“0.152mg的ZnI2作为阴离子源”替换为“0.05mg的ZnI2作为阴离子源”。
制备对比例1
本对比例提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的溴掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbBr3 NCs@PL)。纳米酶的制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于包裹步骤中采用同质量的溴掺杂的钙钛矿纳米粒子(CsPbBr3NCs)代替“CsPbI3 NCs”。制备方法如下其：向10mLDMF中加入0.1468g PbBr2、0.0851g CsBr、0.6mL油胺(2.5mM)和1.8mL油酸(8.4mM)。将混合物在90℃下搅拌2小时用作前体溶液。随后，将1mL前驱体溶液快速加入到50mL甲苯中，并在室温下持续搅拌2h。通过离心(9000rpm，5分钟)收集最终的CsPbBr3 NCs固体产物，并在室温下避光保存。
制备对比例2
本对比例提供了一种纳米酶，所述纳米酶为磷脂包被的氯掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbCl3 NCs@PL)。氯掺杂钙钛矿纳米粒子(CsPbCl3 NCs)和纳米酶的制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于氯掺杂钙钛矿纳米粒子制备过程中，将“0.152mg的ZnI2作为阴离子源”替换为“0.0213mg的ZnCl2作为阴离子源”。
实验例1CsPbI3 NC和CsPbI3 NCs@PL的表征
实验一：使用荧光分光光度计对实施例1～3和对比例1～3制备的钙钛矿纳米粒子(CsPbX3 NCs，X3＝Cl3、Br3、Br2I1、Br2I1和I3)进行扫描，荧光光谱和照片如图4所示，CsPbBr3NCs在掺杂卤素阴离子源(例如ZnCl2和ZnI2)后，Br部分或完全被Cl或I取代，并伴随着荧光颜色的变化，表明取代完成。其中，Br完全被Cl取代从绿色荧光变成蓝色荧光，Br被1个I取代、2个I取代以及完全取代颜色从绿色荧光变成黄色荧光和红色荧光。
实验二：使用透射电子显微镜获得实施例1的CsPbI3 NCs和纳米酶(CsPbI3 NCs@PL)的透射电子显微镜(TEM)图像。TEM图像见图2～3。TEM分析显示CsPbI3 NCs是均匀的立方纳米晶。在磷脂封装后，显示了立方核和薄膜层。
实验三：采用高分辨率透射电子显微镜和能谱仪(EDS)获得实施例1的纳米酶(CsPbI3 NCs@PL)的图像，如图3所示，进一步证明了Cs、Pb、I、P元素的存在。此外，P元素明显分布在纳米晶周围，表明成功合成了NCs@PL(磷脂包被的纳米粒子)。
实验四：采用动态光散射(DLS)对实施例1的CsPbI3 NCs和纳米酶(CsPbI3 NCs@PL)进行分析，CsPbI3 NCs的尺寸从66.8±8.8nm增加到75.9±10.2nm，证明了磷脂薄膜的修饰成功，这也与TEM结果一致。
实验五：使用UV/vis吸收和荧光光谱分析CsPbI3 NCs和实施例1的纳米酶(CsPbI3NCs@PL)，如图5所示，在PL封装后，CsPbI3 NCs的明显红移从607nm到617nm，荧光发射峰从647nm移动到672nm。
实验六：使用傅立叶变换红外(FTIR)光谱分析CsPbI3 NCs和实施例1的纳米酶(CsPbI3 NCs@PL)，用于研究纳米晶体核与PL涂层之间的相互作用。如图6所示，CsPbI3 NCs分别在3437、2924和2854cm-1处具有明显的吸收峰，对应于来自封端配体(油酸和油胺)的N-H、CH2和CH伸缩振动。1624和1456cm-1处的峰来源于封端配体的C＝O和CH2。PL涂层后，1739、1238和968cm-1处出现新峰，归因于脂质DOPC的CO-O、PO2-和N+-(CH3)3的存在，而油酸和油胺的C＝O在1624cm-1处的振动峰减少。这些结果表明，PL可能取代原始表面配体(油酸和油胺)以形成CsPbI3 NCs@PL。
实验例2五种CsPbX3 NC类过氧化物酶活性的比较
实验一：为了探索卤素是否可以调节钙钛矿纳米酶的活性，采用经典的四甲基联苯胺(TMB)比色法测定实施例1-3和对比例1-3得到的2五种纳米酶的活性，使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为显色试剂。以实施例1为例，将20μLCsPbI3 NCs@PL、100μL TMB(1mM)和100μL醋酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.5)充分混合。然后，加入100μL H2O2(100mM)。在室温下孵育20分钟后，监测450-900nm范围内的UV/vis光谱信号。以相同碘含量的0.152mg碘化锌(ZnI2)作为对照组。
各组反应后TMB溶液的吸收光谱和相应的照片如图7和8所示。CsPbCl3 NCs@PL和CsPbBr3 NCs@PL的活性最低，TMB溶液几乎无色。随着碘离子含量的增加，CsPbI3 NCs@PL的活性逐渐增强，CsPbBr1I2NCs@PL和CsPbBr2I1 NCs@PL次之，CsPbI3 NCs@PL溶液的颜色最蓝。这表明卤素确实对CsPbX3 NCs@PL的活性有影响，尤其是碘离子可以明显增强CsPbX3 NCs的催化活性。ZnI2的TMB溶液的吸光度非常有限，远低于磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子，CsPbI3 NCs@PL最高，表明碘本身确实具有催化作用，但明显不如磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子高效。
各组反应后TMB溶液的吸光强度如图9所示，CsPbCl3 NCs@PL和CsPbBr3 NCs@PL的吸光度分别比CsPbI3 NCs@PL低10.07倍和7.42倍。CsPbBr2I1 NCs@PL和CsPbBr1I2 NCs@PL的吸光度分别比CsPbI3NCs@PL低2.18倍和1.47倍。
实验二：进行稳态动力学实验以进一步评估了CsPbX3 NCs@PL的类过氧化物酶特性。通过Lineweaver-Burk图拟合后，酶催化的重要参数，如米氏常数(Km)、最大初始速度(Vmax)、催化常数(Kcat)和催化效率(Kcat/Km)归纳在表1中。
表1CsPbX3 NCs@PL与其他分析物的动力学参数结果
结果显示，CsPbI3 NCs@PL对H2O2和TMB的Km值分别为1.12mM和0.64mM，明显低于CsPbCl3 NCs@PL和CsPbBr3 NCs@PL，表明其对底物具有更高的亲和力。此外，与之前报道的其他过氧化物酶模拟物相比，CsPbI3 NCs@PL也表现出相当甚至更低的Km。因此，基于上述所有实验结果，我们可以发现，CsPbX3 NCs的纳米酶活性可以通过不同的卤化物阴离子进行调节。碘掺杂的CsPbX3 NCs@PL表现出很强的催化活性。
检测实施例1基于CsPbI3 NCs@PL的免疫分析
本实施例提供了一种定量检测核基质蛋白22(NMP22)的方法(检测原理见图10A)，所述方法包括如下步骤：
包被与封闭步骤：以每孔100μL的添加量将初级抗原溶液(NMP22Ab1，100μg/mL，购自Abcam公司)添加至酶标板中，于4℃孵育12h，使用PBS缓冲液洗涤3次。接着，以每孔100μL的添加量将BSA溶液(5％，w/v，g/100mL)添加至酶标板中，于37℃孵育2h后用PBS缓冲液洗涤，重复此操作两次，得到经封闭的酶标板；
孵育步骤：以每孔100μL的添加量将NMP22标准品溶液或者待测样品添加至经封闭的酶标板中于37℃孵育2h后，接着用BSA溶液37℃孵育2h后，PBS缓冲液洗涤三次，然后分别以每孔100μL的添加量将链霉亲和素标记的二级抗原溶液(NMP22 Ab2，100μg/mL，购自Abcam公司)添加至酶标板中，于37℃孵育1h，去除多余的Ab2分子后，以每孔100μL的添加量将生物素标记的纳米酶(生物素标记的纳米酶为CsPbI3 NCs@PL，由制备实施例1制得)添加至经封闭的酶标板中，以每孔100μL的添加量将显色底物TMB(购自西格玛公司)添加至酶标板中，于37℃孵育30分钟后，得到孵育产物；其中，待测样品为尿液或者不同浓度的NMP22标准品溶液(购自上海酶联生物科技有限公司)，标准品溶液的浓度分别为0、1、5、10、20、50、100、150、200、500、1000和2000U/mL。
检测步骤：使用酶标仪检测孵育产物于685nm处的吸光度值，将NMP22标准品溶液测得的吸光度值(y)作为纵坐标，以NMP22标准品溶液的浓度(x)的lg值作为横坐标绘制标准曲线，并拟合得到拟合方程，检测及拟合结果见图11。基于CsPbI3 NCs@PL的ELISA检测NMP22的线性范围为1至500U/mL(y＝–0.006+0.479lgx，R2＝0.990)。LOD为0.03U/mL(LOD＝3σ/S，σ为空白对照的标准差，S为校准曲线的斜率)。
使用酶标仪检测以尿液为待测样品按照上述方法制得的孵育产物于685nm处的吸光度值后，带入根据吸光度值与NMP22浓度之间的关系拟合而得的拟合方程y＝–0.006+0.479lgx，计算得到尿液样品中NMP22的浓度。
检测对比例1-2
本对比例提供了一种定量检测核基质蛋白22(NMP22)的方法，基本与检测实施例1相同，区别仅在于孵育步骤采用的生物素标记的纳米酶不同，检测对比例1-2的纳米酶分别采用对比例1制备的CsPbBr3 NCs@PL的分散液和对比例2制备的CsPbCl3 NCs@PL代替检测实施例1的CsPbI3NCs@PL进行定量检测。结果显示，基于CsPbCl3 NCs@PL和CsPbBr3NCs@PL的ELISA的LOD计算结果分别为10.4和12.7U/mL。线性范围分别是为5至100U/mL(y＝–0.007+0.193lgx，R2＝0.985)，20至150(y＝–0.107+0.143lgx，R2＝0.987)。
与检测实施例1比较可知，采用CsPbI3 NCs@PL纳米酶具有更宽的线性范围和更低的LOD，这表明检测实施例1的方法具有更好的分析性能。
实验例3
分别采用空白样品(溶剂种类：PBS缓冲溶液)、牛血红蛋白(BSA，浓度为10mg/mL)、半胱氨酸(Cysteine，浓度为10mg/mL)、葡萄糖(Glucose，浓度为10mg/mL)和尿酸(Urineacid，浓度为10mg/mL)以及NMP22(浓度为500U/mL)标准品和混合样品(NMP22+mix)为待测样品，采用检测实施例1的方法检测待测样品的吸光度值。结果见图12所示。
其中，混合样品(NMP22+mix)为含浓度为10mg/mL的牛血红蛋白、浓度为10mg/mL的半胱氨酸、浓度为10mg/mL的葡萄糖、浓度为10mg/mL的尿酸和浓度为500U/mL的NMP22的溶液。
当尿液中引入其他生物标志物或常见干扰分子，如血红蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、半胱氨酸、葡萄糖和尿酸时，得到检测阴性结果(图12)，说明检测方法选择性良好。
实验例4
人尿样由无锡市第二医院泌尿外科提供，经医学研究伦理委员会批准(批准文号：2022-338)。收集了两个病理分级(WHO 2004/2016)的膀胱癌患者的尿液样本作为阳性组，包括低级别乳头状尿路上皮癌(简称低级别患者，n＝20)和高级乳头状尿路上皮癌(简称高级别患者，PUNLMP，n＝15)。阴性对照组包括健康个体(n＝20)和良性慢性膀胱炎患者(n＝15)。从所有患者那里获得了知情的书面同意，并且样本是匿名的。留尿前，晚上8点以后禁水、进食，早上6-7点采尿(中段，二次排尿)。将尿液样本收集在塑料尿液容器中，并以1500rpm的转速离心5分钟以去除尿液沉淀物。然后在室温下2小时内进行后续测试。来自患者的所有样品均在经尿道膀胱肿瘤切除术之前收集。分别按照检测实施例1的方法测试各组尿液中的NMP含量。结果见表2所示。
临床特征数据(包括年龄、性别、病理分级)见表2。所有这些数据都是通过审查我院的电子病历获得的。
表2膀胱癌患者与健康人的临床数据*.
*膀胱癌的病理分期和组织学分级基于美国联合委员会TNM膀胱癌分期系统(2010年第7版)。Ta为低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤，T1为低级别乳头状尿路上皮癌，T2为高级别乳头状尿路上皮癌。
阴性对照组尿液中的NMP22的浓度低于15U/mL，阳性对照组的NMP22的浓度高于30U/mL”，说明本发明的方法可通过检测NMP22来于诊断膀胱癌，与市售ELISA试剂盒诊断结果一致，显示出其在实际应用中的巨大潜力。
表3本发明方法的测试结果
从SPSS Statistics获得接受者操作特征(ROC)分析。在接受者操作特征(ROC)分析中，本发明的方法不仅可以可靠地区分曲线下面积(AUC)值为阳性的患者(包括低级和高级患者)和阴性个体(包括健康和良性个体)，AUC值为1.0，也成功地区分高级别膀胱癌患者和低级别膀胱癌患者，AUC值为0.918(图14)，检测灵敏度100％和特异性94.3％。
总之，我们通过使用CsPbI3 NCs@PL开发了一种增强的免疫测定法来检测BC相关的NMP22。我们发现卤素阴离子可以调节CsPbX3 NCs的催化活性。与典型的CsPbBr3 NCs相比，在CsPbX3 NCs中掺杂I元素可以显着增强类过氧化物酶活性，催化效率提高24倍。这一优势确保了CsPbI3 NCs@PL作为一种高效的信号放大器。通过结合经典的ELISA模型，该传感平台可以灵敏、高效地分析临床尿液样本中的NMP22。功能化的CsPbI3 NCs@PL允许检测低至0.03U/mL的NMP22。通过引入基于碘化物增强纳米酶的比色平台分析膀胱癌患者的临床样本。结果表明，制造的传感器可以实现尿NMP22检测的高灵敏度(100％)和特异性(94.3％)，可以区分膀胱癌患者和健康个体。活性可调的CsPbX3 NCs的发现加深了我们对钙钛矿纳米酶的理解。CsPbX3 NCs的拟议应用对生物传感具有积极影响。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种纳米酶，其特征在于，所述纳米酶为磷脂包被的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的纳米酶，其特征在于，所述的碘掺杂的钙钛矿纳米粒子为CsPbI3纳米粒子、CsPbBr1I2纳米粒子或者CsPbBr2I1纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的纳米酶，其特征在于，所述磷脂选自1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、二油酰磷脂酰甘油和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素中的一种或者几种。
4.一种权利要求1-3中任一所述的纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将含磷脂的溶液与含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液混合后在真空环境中除去有机溶剂，得到固体产物；固体产物与水溶液混合，超声，得到含有纳米酶的溶液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含磷脂的溶液中磷脂的添加量为170～300μg/mL，所述含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液中，碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的浓度为0.8～1.2μg/mL。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂溶液、含碘掺杂的钙钛矿纳米粒子的分散液与水溶液的体积比为1～3：10～50：10～50。
7.如权利要求4～6中任一所述的制备方法，其特征在于，还包括纯化步骤，纯化步骤为含有纳米酶的溶液离心，取沉淀物，将沉淀物重新分散于水溶液中。
8.如权利要求4～7中任一所述的制备方法，其特征在于，所述水溶液为纯水、PBS缓冲液、Tris缓冲液或醋酸钠缓冲液。
9.一种检测尿液中核基质蛋白22的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-3中任一所述的纳米酶或者权利要求7-8中任一所述的方法制得的纳米酶对尿液中的核基质蛋白22进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测尿液中核基质蛋白22的方法，其特征在于，所述的检测尿液中核基质蛋白22的方法包括，
固定和封闭步骤：将初级抗原添加至酶标板中进行孵育，然后添加BSA溶液进行封闭；
孵育步骤：将NMP标准品溶液或者待测样品添加至封闭后的酶标板中进行孵育，然后将链霉亲和素标记的二级抗原添加至酶标板中进行孵育，再将生物素标记的权利要求1-3中任一所述的纳米酶以及显色底物TMB添加至酶标板中进行孵育，得到孵育产物；
检测步骤：采用酶联免疫吸附测定法检测孵育产物的吸光度值，根据标准品溶液的吸光度值和核基质蛋白22的浓度建立吸光度值与核基质蛋白22浓度之间的关系，结合待测样品测得的吸光度值，计算得到待测样品中核基质蛋白22的浓度。
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