CN116076363A

CN116076363A - 一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法

Info

Publication number: CN116076363A
Application number: CN202310033643.5A
Authority: CN
Inventors: 陈贵虎; 王友文; 黄平; 蒋万选; 王坤刚
Original assignee: Chongqing Tongliang District Guozhiwang Horticultural Research Institute
Current assignee: Chongqing Tongliang District Guozhiwang Horticultural Research Institute
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-05-09

Abstract

本发明提供一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法，属于农业种植技术领域，以解决一般用10％的次氯酸钠进行消毒，然后剥取茎尖，在培养基中进行培养，然后再对培养的新梢进行生根，从而获得脱毒母苗，导致污染率高，出苗慢的问题，包括取材、冷藏、预处理、消毒、二次消毒、茎尖剥离、初代培养、继代培养，利用酒精杀菌，搭配Hgcl₂相结合的方法，以及最合理的消毒时常，满足发芽率与存活率的达到最理想值，同时培养基的特殊配比增加了出芽率和出芽质量。

Description

一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法

技术领域

本发明属于农业种植技术领域，更具体地说，特别涉及一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法。

背景技术

蜂糖李是我国近年选育出的优良地方李子品种，由于期品质好，果实售价高，深受种植者喜欢迎，而这些苗木均为普通繁育，没有通过脱毒处理，特别是核果坏死环斑病毒(PNRSV)、核果矮缩病毒(PDV)等，其危害损失不仅限于矮化减产，因病毒株系不同，表现出褪绿、坏死、叶变畸形、流胶等多种症状，严重影响果农增收。

目前培育植物的方法中一般采用B5培养基进行培育，如申请号为CN113046296A的发明专利所提到的B5培养基，但对于蜂糖李来说，该培养基所得到的出芽率不足，且现有的脱毒处理培育，一般用10％的次氯酸钠进行消毒，然后剥取茎尖，在培养基中进行培养，然后再对培养的新梢进行生根，从而获得脱毒母苗。该方法的缺点是：污染率高，出苗慢，特别是在南方多雨地区，病虫害多，消毒难以彻底，茎尖苗易中途死亡。

于是，有鉴于此，针对现有的结构及缺失予以研究改良，提供一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法，以期达到更具有更加实用价值性的目的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法。

本发明一种蜂糖李组培苗培养基及其组培苗培养方法的目的与功效，由以下具体技术手段所达成：

一种蜂糖李组培苗培养基，由母液a、母液b、铁盐、有机物质a组成；

母液a：硝酸钾(KN03)960mg/L、硝酸铵(NH4NO3)800mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)410mg/L、硫酸钾(K2SO4)300mg/L、硫酸铵((NH4)2SO4)50mg/L；

母液b：硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、钼酸钠(NaMoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CUSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L；

铁盐：乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)37.25mg/L、硫酸铁(FeSO4·7H2O)27.85mg/L；

有机物质a：甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(vB1)0.4mg/L、盐酸吡哆醇(vB6)0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌酸100mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、细胞分裂素6-BA 0.8mg/L、细胞生长素IBA 0.2mg/L、赤霉素GA3 0.5mg/L。

基于该培养基用于蜂糖李组培苗培养方法，包括以下步骤：

1)取材；在植株落叶进入休眠期后，从中选取表面无露水、无病虫害的带叶芽的木质化枝条，从顶端往下30cm处剪取，得到外植体；

2)冷藏；将外植体清洗、消毒后冷藏，冷藏温度6℃，冷藏时间600小时；

3)预处理；将冷藏后的外植体用酒精喷雾除去表面污染物；

4)消毒；在灭菌室用紫外灯照射外植体，再将照射后产生的臭氧吸出，再用酒精擦拭表面，剪成固定长度放入无菌瓶中；

5)二次消毒；在无菌瓶中倒入酒精振荡30s，振荡后将酒精倒出，再利用升汞倒入无菌瓶中振荡8mi n～15mi n，再用水清洗无菌瓶中的外植体；

6)茎尖剥离；清洗完毕后，用镊子夹取枝条，去除枝条芽外的鳞片，再一层层去除幼叶，直到看到茎尖内部的分生组织后，切离得到0.2mm～0.3mm的带叶原基的茎尖；

7)接种；将剥好的茎尖接种到培养基中；

8)初代培养；将培养基放入培养室，培养室温度25℃，每天光照时间14～16h；

9)继代培养；将初代培养分化后的芽接种到继代培养基上，温度25℃，每天光照时间14～16h。

进一步的，步骤2中，通过75％酒精擦拭干净后，均匀喷洒200ppm的赤霉素溶液消毒，消毒后用保湿类薄膜包裹冷藏。

进一步的，在步骤5中，升汞倒入无菌瓶中振荡10mi n。

进一步的，在步骤7中，接种时需要随剥随接，每一个培养瓶中只放一个茎尖。

进一步的，在步骤8和步骤9中，光照选用白色LED灯，湿度小于40％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、利用酒精杀菌，搭配Hgc l₂相结合的方法，对外植体进行消毒处理，然后剥取茎尖再培养，得到的污染率更低，存活率更高的母苗，且消毒时间的把控，满足发芽率与存活率的达到最理想值。

2、通过培养基的成分配比，得到更高的出芽率和更好出芽质量。

3、通过冷藏的方式打破植物休眠，使得枝条能够正常发芽。

4、在休眠期采集外殖体，病菌更少，更利于消毒杀菌。

附图说明

图1是本发明中蜂糖李初代培养时茎尖情况。

图2是本发明中蜂糖李茎尖初代培养30天后的生长情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例：

本发明提供一种蜂糖李组培苗培养基，由母液a、母液b、铁盐、有机物质a组成；

其中，母液a：硝酸钾(KN03)960mg/L、硝酸铵(NH4NO3)800mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)410mg/L、硫酸钾(K2SO4)300mg/L、硫酸铵((NH4)2SO4)50mg/L；

在其他实施例中，细胞分裂素、细胞生长素、赤霉素含量有所不同，所得到的出芽率和出芽质量不同，具体对比如下表格：

由于李子、樱桃、桃都属于蔷薇科植物，因此所用的培养基也大体相同。在做蜂糖李茎尖培养试验时所用的改良CQM6培养基，如上表所示，其出芽质量和出芽率均优于B5培养基，且在细胞分裂素6-BA为0.8mg/L、细胞生长素I BA为0.2mg/L、赤霉素GA3为0.5mg/L时得到最优选。

利用改良CQM6培养基进行组培苗培养方法，包括以下步骤：1、取材：在蜂糖李植株落叶进入休眠期后，从母株中剪取表面无露水、无病虫害的带叶芽的木质化枝条，最好从顶端往下30cm剪取。在采摘过程中，最好选择晴天，这样的枝条表面带菌率更低，成活率高，生长速度快，增殖率高。

2、外植体的冷藏：将外植体从容器中取出，放在盛有中性洗衣粉溶液的盆中用牙刷清洗干净后晾干。然后用75％酒精将外植体仔细擦拭干净，均匀喷洒200ppm的赤霉素溶液，用毛巾包裹后再用保鲜膜保湿，放6℃冰箱低温冷藏25天(600小时)备用；

5、外植体的预处理：选取适量数量枝条，用75％酒精均匀喷雾2-3次，除去外植体表面的污染物；

6、消毒：外植体消毒之前，先将外植体消毒和接种的相关药品工具等放入超净工作台内，并开启器械消毒器以及超净工作台的紫外灯，紫外灯照射20mi n左右即可关闭紫外灯，然后换气扇抽气10mi n左右，抽出紫外灯灭菌室产生的臭氧，然后开始接种工作。

7、酒精的预处理：用浸有75％酒精的酒精棉球，仔细擦拭枝条的表面，然后用消毒后的剪刀将枝条剪成合适的长度放入无菌瓶中，使枝条能够平铺在无菌瓶中，方便后续的密闭消毒处理。

8、酒精消毒：将75％的酒精倒入装有枝条的无菌瓶中，迅速盖好瓶盖，振荡30s，使酒精与枝条充分接触杀菌，然后倒出酒精，尽可能的将酒精完全倒出。

9、升汞消毒：酒精处理后，然后将升汞倒入无菌瓶中，盖好瓶盖，振荡10mi n。若升汞密度增加，则减少步骤7中75％酒精消毒的振荡时间。

10、水清洗：用无菌水将消毒处理后的枝条清洗两次，每次90s，清洗完成后倒出无菌水。

11、茎尖剥离：消毒、清洗完毕后，用灭菌后的镊子一次夹取一根枝条，去除花芽，先在裸眼条件下去除枝条叶芽外部的鳞片，再转入解剖镜下，一层层的去除幼叶，直到看到茎尖内部圆润光亮的分生组织时，用灭菌后的刀尖将其切离下来，得到0.2～0.3mm带叶原基的茎尖。

12、接种：在超净工作台中将剥好的茎尖尽可能快速的接种到事先做好的培养基中进行培养。注意，接种过程中，做到随剥随接，每个培养瓶只放一个茎尖，减少在空气中的暴露时间，减少氧化，同时培养基的瓶盖开关操作均保持在超净工作台中进行。

13、初代培养：将接种好的培养基放入特定培养条件的培养室进行培养，培养30天左右。培养条件参数如下：温度设置为25℃，光照选用的是白色的LED灯，每天的光照时间控制在14～16h，湿度控制在40％以下。

12、继代培养：将分化后的芽接种到继代培养基上，经过一段时间的培养，便形成无根的试管苗。培养温度25％左右，光照选用的是白色的LED灯，每天光照时间控制在14～16h，湿度控制在40％以下。

初代培养和继代培养所用的培养基均为CQM6培养基。

在其他实施例中，利用升汞(Hgc l₂)振荡消毒的时间有所不同，具体试验数据如下：

通过试验表可得出，脱毒处理后的蜂糖李存活率更高，在酒精消毒之后利用升汞消毒，振荡10mi n可使发芽率满足需求的同时存活率达到最高。

本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims

1.一种蜂糖李组培苗培养基，其特征在于：由母液a、母液b、铁盐、有机物质a组成；

有机物质a：甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(vB1)0.4mg/L、盐酸吡哆醇(vB6)0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌酸100mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、细胞分裂素6-BA 0.8mg/L、细胞生长素IBA0.2mg/L、赤霉素GA3 0.5mg/L。

基于该培养基用于蜂糖李组培苗培养方法包括以下步骤：

1)取材；从植株中选取表面无露水、无病虫害的带芽的半木质化枝条，从顶端往下30cm处剪取，得到外植体；

3)预处理；将冷藏后的外植体用酒精喷雾除去表面污染物；

5)二次消毒；在无菌瓶中倒入酒精振荡30s，振荡后将酒精倒出，再利用升汞倒入无菌瓶中振荡8min～15min，再用水清洗无菌瓶中的外植体；

6)茎尖剥离；清洗完毕后，用镊子夹取枝条，去除枝条芽外的鳞片，再一层层去除幼叶，直到看到茎尖内部的分生组织后，切离得到0.3mm-0.5mm的带叶原基的茎尖；

7)接种；将剥好的茎尖接种到培养基中；

8)初代培养；将培养基放入培养室，培养室温度25℃，每天光照时间14-16h；

9)继代培养；将初代培养分化后的芽接种到继代培养基上，温度25℃，每天光照时间14-16h。

2.如权利要求1所述的蜂糖李脱毒组培果苗方法，其特征在于：步骤2中，通过75％酒精擦拭干净后，均匀喷洒200ppm的赤霉素溶液消毒，消毒后用保湿类薄膜包裹冷藏。

3.如权利要求1所述的蜂糖李脱毒组培果苗方法，其特征在于：在步骤5中，升汞倒入无菌瓶中振荡10min。

4.如权利要求1所述的蜂糖李脱毒组培果苗方法，其特征在于：在步骤7中，接种时需要随剥随接，每一个培养瓶中只放一个茎尖。

5.如权利要求1所述的蜂糖李脱毒组培果苗方法，其特征在于：在步骤8和步骤9中，光照选用白色LED灯，湿度小于40％。