CN116064773B - 一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物及其应用。所述的生物标志物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的序列。该组生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著相关，可应用于铅对儿童智力影响的定量健康风险评估并应用于智力检测和早期预防。特别是，该组生物标志物中的2个标志物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12)与儿童智力有明确的定量关系，不仅能够判定特定个体智力是否受损，还能做早期预警。

Description

一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物及其应用。
背景技术
作为一种广泛存在于环境中的重金属污染物，铅暴露是导致人类神经系统疾病的重要独立风险因素。铅对儿童神经系统的危害是完全可以预防的，这有赖于相关的生物标志物的应用。而生物标志物也可用于智力检测，相较于传统的标准化量表更加简便快捷，更有利于进行相关的定量环境健康风险评估。
生物标志物是可以指示疾病的发生和发展过程，因此可以用于铅中毒的预防和干预。目前，已经报道了多个与铅暴露导致的神经系统效应有关的生物标志物。胞嘧啶DNA甲基化作为研究最广泛的表观遗传修饰方式之一，具有疾病关联性和可逆性，使其可用于监测疾病的发生发展并作为干预治疗的靶点，目前已有针对DNA甲基转移酶的靶向药物用于白血病治疗；另外，相较于基因表达和基因变异，DNA甲基化更为稳定动态且变化范围小，因此是一种有潜力的生物标志物。
发明内容
本发明针对现有评估血铅对儿童智力影响的生物标志物不足的问题，而提供一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物，该组生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著相关，可应用于铅对儿童智力影响的定量健康风险评估并应用于智力检测和早期预防。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物，所述的生物标志物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的序列。
优选的，上述的生物标志物中，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著正相关，如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著负相关。
优选的，上述的生物标志物中，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力存在线性关系。
优选的，上述的生物标志物中，如SEQ ID NO.2所示序列的生物标志物的DNA甲基化在51.40％-78.78％之间时，儿童智力与该生物标志物的DNA甲基化有良好的线性关系。
优选的，上述的生物标志物中，如SEQ ID NO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化在31.41％-74.19％之间时，儿童智力与该生物标志物的DNA甲基化有良好的线性关系。
本发明的第二个目的是提供上述的生物标志物在制备检测血铅诱导儿童智力降低的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供检测上述的生物标志物的试剂在制备检测血铅诱导儿童智力降低的产品中的应用。
优选的，所述试剂包括检测所述生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测所述生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
优选的，所述的产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测血铅诱导儿童智力降低的产品，其包含用于检测上述的生物标志物的试剂。
本发明提供了一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物，该组生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著相关，可应用于铅对儿童智力影响的定量健康风险评估并应用于智力检测和早期预防。特别是，该组生物标志物中的2个标志物(SEQ ID NO.2、SEQID NO.12)与儿童智力有明确的定量关系，不仅能够判定特定个体智力是否受损，还能做早期预警。
附图说明
图1为2个生物标志物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12)甲基化与儿童智力的相关性(A-B)以及2个生物标志物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12)甲基化预测儿童智力的ROC曲线(C)。(相关分析的方法是皮尔逊相关；AUC：曲线下面积，定义为在ROC曲线下被轴包围的区域；AUC(0.5-1)越大，预测值的真实性越高)。
图2为SH-SY5Y细胞暴露于不同时间(A)和浓度(B)的Pb之后2个生物标志物(SEQID NO.2、SEQ ID NO.12)的基因表达。(图中Y轴展示的是相对于未处理组基因表达增加的倍数，大于0则表明基因表达上调。图A展示的是铅以1mg/L的浓度处理SH-SY5Y细胞三天和以0.1mg/L的浓度处理SH-SY5Y细胞一个月后2个生物标志物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12)的基因表达情况。图B展示的是铅以0.4、2、10和50mg/L的浓度处理SH-SY5Y细胞两天后2个生物标志物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12)的基因表达情况)。
图3为铅暴露与ROS生成(A)、铅暴露与生物标志物(SEQ ID NO.2)甲基化率(B)以及生物标志物(SEQ ID NO.2)甲基化率与ROS生成(C)之间的定量关系。(BMD：基准剂量，BMDL：基准剂量置信区间下限。铅暴露、生物标志物(SEQ ID NO.2)甲基化率和ROS产生之间的定量关系通过BMDS软件(美国环保局推荐的用于估计污染物基准剂量的软件)进行拟合。铅浓度对数与ROS产生之间的剂量-反应关系可用Hill模型最好拟合；铅浓度对数与生物标志物(SEQ ID NO.2)甲基化率之间的剂量-反应关系最好用线性模型拟合；ROS产生与生物标志物(SEQ ID NO.2)甲基化率之间的定量关系最好用线性模型拟合)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1、材料和方法
1.1人群调查
本研究中使用的血液样本来源于我们先前在某地展开的一项横断面研究。钢铁厂、冶炼厂和发电厂所在的马坝镇作为重金属污染区，其邻近的某镇作为对照区。我们分别从污染区和对照区募集到266名和264名9-11岁的儿童。他们的智力测试采用中国瑞文联合测验(CRT-C2)，该测验于1997年第二次修订。该方法基于用于流体智能的瑞文标准渐进矩阵(SPM)和彩色渐进矩阵(CPM)，类似于WISC-III(韦氏智力量表，第3版)中的功能量表。我们收集这些儿童的人口学信息和血液样本，然后进行重金属测定。患有神经障碍或身体疾病的人被从分析中剔除。这项研究由中国疾病预防控制中心环境卫生及相关产品研究所伦理委员会批准。
1.2MethylTarget测序
我们使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen,德国)试剂盒从收集到的血液样本中提取基因组DNA。DNA浓度和完整性分别用NanoDrop 2000分光光度计(NanoDropTechnologies，美国)和1％琼脂糖凝胶电泳法检测。采用可同时对多个基因片段进行测序的目标区甲基化富集区测序技术，对38个基因片段的DNA甲基化水平进行了分析。我们使用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒将500ng DNA转化为亚硫酸盐。用Takara热启动Taq聚合酶试剂盒(Takara，日本)，利用优化的引物和转换的样本基因组模板进行多重PCR扩增。引物序列如表1所示。
表1MethylTarget引物序列
表1MethylTarget引物序列(续表)
将与模板相同的样本基因组扩增的聚合酶链式反应产物混合，然后在文库中添加索引序列。将所有样品的指标性聚合酶链式反应产物等量混合，然后使用天根凝胶提取试剂盒(天根，中国)进行凝胶提取纯化，得到最终的文库。使用Agilent 2100生物分析仪验证文库中片段的长度分布。文库用Illumina 2×150-bp成对末端技术(Illumina，美国)进行测序。使用FastQC软件对原始数据进行质量控制，然后进行剪接，并使用BLAST+将其与靶区域的参考序列进行比对。覆盖90％的靶序列和其90％的碱基完全覆盖靶序列的读数被认为是有效的。一个位点的DNA甲基化水平是通过将覆盖该位点的甲基化读数除以覆盖该位点的所有读数来计算的。我们使用MW-U检验筛选差异甲基化的位点和片段，并进行了FDR校正。
1.3统计分析
各片段的DNA甲基化与儿童智力之间的相关性采用皮尔逊相关分析。为了鉴定候选片段的DNA甲基化是否介导血铅与儿童智力，我们使用了4-way分解中介分析，将暴露因素对结果的总效应分解为四个效应：受控直接效应，参照交互效应，中介交互作用以及纯粹的间接效应。血铅、DNA甲基化和儿童智力分别作为暴露变量、中介变量和结果变量被纳入模型中。儿童的性别和年龄、父母的年龄、职业和教育水平、家庭年收入和被动吸烟作为协变量纳入模型中。
2、结果
38个基因片段中共筛选得到12个基因片段的DNA甲基化与儿童智力显著相关。该12个基因片段序列如下所示：
SEQ ID NO.1：CAGGAGCCAGGAGGACCAGTGGTACTTGGGCTACCCGGGGGACCAGTGGTCTTCGGGCTTCTCCTACAGCTGGTGGAAAAATAGCGTCGGCAGCGAGAGCAAGCACGGTGAGGGCGCCTTAGACCAGCCCCAGCACGACGTCCGCCTGGAAGATCTTGGCGAGCTCCACAGAGCTGCCCGGTCGGGCGACGTCCCTGGGGTGGAGCACGTCTTGGCTCCTGGAGACACTGGCGTGGACAAGAGGGATAGGAAGAAGAGGTAATGGCC。
SEQ ID NO.2：GAAGAGGTCAAACAAGCTGAGTGCAGGTTTTGTCACGAAACTGGGGGGCGAGTAGGGTTCTATTATCAAAGAATGGTTGTGTTGGGGCCATAAGAAAGAATTACAGGCAGTGGTGCGCAGGTAATGTTCACGAGACGCCACAGCGGGGTAGCATCAGAGGCGGGAGGAGGAGGGTTGGAGAGCAGGGCCGTGTTGCAAGGCTCTCTGGGTGGCCACAGCAGCTTGCGCTGCGCCCACATTGCTTCTGCGTGTTTACAGTTGGG。
SEQ ID NO.3：GAGGAGAGTGCCAGGCTCCTGGTAGGGCGGCTGCGGAAACAGGAAGTGGAGGTGGATCGCCCCCTGGCGGGGAGGCGGGCCCTGGGAAGAGCTCCGGGCTCCTGGTAGGGGCGGTGCTCCTGTGGGGCGGGCCAGCGCGGGGAGGATCCTGGAGGAGGCGCTTCTGGCCCTGCCCAGCCGTGGCTGGCCGGGGCTCCTGTTTTCACGCTGTGGGCAGGGCGGGCCC。
SEQ ID NO.4：GGTGGTGTGGGCATTTACCTTTGGCTAGCTCTGAGCTCACCGCAGCATGGTAGCGGGAGCGCAGCTGCGCGGGCAACCGCCGGGTTTGTGGCCGGTTGGCGGGCTCAGTGCCGCCTCAGTGGGCTCTAGCAGTAGAAAAGTAAAGCGACTACCCTAAGATACCCAGAGCGAGAGGAGAGGGGCTAGAAGGGTGCTGGAGGCAGGCTGTAGTGGGGCTAA。
SEQ ID NO.5：GCCCCGGGGCTGCAGTGCCTCCAGCCGCTGCGCCCCGGGTTCCCCAGCACCTGCGGTTGCCCGACGCTGGGAGGGGCCGTGTGCGGCAGCGACAGGCGCACCTACCCCAGCATGTGCGCGCTCCGGGCCGAAAACCGCGCCGCGCGCCGCCTGGGCAAGGTCCCGGCCGTGCCTGTGCAGTGGGGGAA。
SEQ ID NO.6：GGAGGTGCTGCACTTCCAGTCCATGTGCTCGTGCCTGTGGTACAAGAGCCGCGAGAAGCTGCAGTACTCCATCCCCATGATCATCCCGCGGGACCTCTCCACGTCCGACACGTGCGTGGAGCAGAGCCACTCGTCGCCGGGAGGGGGCGGCCGCTACAGCGACACGCCCTCGCGACGCTGCCTGTGCAGCGGGGCGCCACGCTCCGCCATCAGCTCGGTGTCCACGGGTCTGCACAGCCTGTCC。
SEQ ID NO.7：GGGGGTGGGTAGGAGCAGATCTAGGGATCCTGGAGCAGGGAGTAGGCCTGGGGTGGCGGTGAAGGCTTGAGGGCCACGGAGGAAGATCCGACGACAGCCGACGGCCTTCGTTCGCTTCCGCCCTGCACAGCTGGTTCTTCAAGAACCTGAGCCGCAAGGACGCGGAGCGGCAGCTCCTGGCGCCCGGGA。
SEQ ID NO.8：GAGCAGGGGAGGCTTTGCACTCCCATCGCACTTTTCTCGTCCGAAGATACGAAACTCCGTCCGGGCGTCGCAAATAATTCGAATTCGGCTCTCTGACACCTACCTCGGCGGGCGCGCGCCGCTGGGAGGGCGGGGTGGGTGGCTGGAGGTAAGGAGGCGCACAGCAGGGGTAAGCGCCGCCGTCGCACACTTTGCACGCCGCCCAGGGCTACACCACTCACCGAAAATTGGGAGGCAGGTCTGG。
SEQ ID NO.9：CCGTCCAGTGAGTTCTCCGCACTGCAGAGGGCGAGATCCCGAAGGCCTGGATCCGCGCAGAAGCAGGGAGCACCTTCCATGGCCGCCGCCATCCTCAGCACCGTCCCGCGGCTGCCGCCATCCTCAGCACCGGAAGGAAAACCAGGCCGCCGCCATCCTCAGCACCGGAAGGAAAACCAGGC。
SEQ ID NO.10：TGCCCCACACGGAGGCCTCAGCATCTGCCCCACACGGAGCGCTGCACCTGCGCCTGCCCCACACGGAGGCCTCAGCGCCTGCCCCACACGGAGGCCTCAGCGCCTGCCCCACACGGAGCGCTGCACCTGCGCCTGCCCCACACGGAGGCCTCAGGGCTGCAAACAAGCGAGCCCGTGCGTGGCGCTACAGACCACAAGGGGCACGTGCAGCTCGGCTTCCAGGTGAGGAAGAGACGGATC。
SEQ ID NO.11：GGGGACGTGCAGGCTCCAGTGTGCCCTCGATGACGACGTCGTTGTCCTCATCGCTCTCCGCCTCGTCGGGGTGGAAGTTCTGCAGGACGCGCGGGGCGGGGGGACCCACGAAGCCCGCGGTGCCGTCCGAGGGCGGTCCCGAGCTGCCCAACGCGCGGCCGCCGCGCACCACGTTGTTGCGCTGGTTGGCGGGCTTGACGGTGACGATGAGGTTGTGGCTGTTGG。
SEQ ID NO.12：GCCAGAGGGGGACGATGCACCCCCCCGGCCGTCGATGCTGGACGATGCACCCCGCCTGCCGCTGGAGCTGGACGATGCACCCCTGCCGGAGGAGGAAACCCCCGAACCCACGGCCATCTGCAGGCACCGGCACCGCTGTCACACCGACTGCCTAGAGGGGCTGCTGTC。
上述12个基因片段的DNA甲基化与儿童智力显著相关，其中如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著正相关，如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力显著负相关。该12个基因片段可作为生物标记物应用于铅对儿童智力影响的定量健康风险评估并应用于智力检测和早期预防。具体见表2所示。
表2.12个生物标记物的DNA甲基化与儿童智力的相关性
实施例2
为了探究如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12序列所示的2个生物标记物的DNA甲基化是否能够较好的指示儿童智力，我们首先分析了这两个片段的DNA甲基化与儿童智力测试得分的线性相关性，结果显示上述2个生物标记物的DNA甲基化与儿童智力测试得分均有显著的线性正相关性(P<0.001)，皮尔逊相关系数r分别为0.56和0.58(图1A,B)。然后我们以上述2个生物标记物的DNA甲基化作为自变量，儿童智力测试得分作为因变量进行简单线性回归，结果显示如SEQ ID NO.2序列所示的生物标记物的DNA甲基化在51.40％-78.78％之间时儿童IQ与生物标记物的DNA甲基化有良好的线性关系，其表达式为(x表示SEQ ID NO.2或NO.12的DNA甲基化，y表示儿童智力)：
y＝82.68x+49.13 ①
如SEQ ID NO.12序列所示的生物标记物的DNA甲基化在31.41％-74.19％之间时儿童IQ与生物标记物的DNA甲基化有良好的线性关系，其表达式为：
y＝91.06x+48.16 ②
表达式显示当生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的DNA甲基化水平上升1％时，IQ测试得分将分别上升约0.83和0.91，表明这两个基因在指示IQ变化时比较接近的。而文献报道均显示血铅浓度每升高10μg/L，对应的儿童IQ测试得分将下降约1，表明IQ对DNA甲基化的变化要比血铅敏感的多(ACCLP 2012；Pan et al.2018；The 2012)。根据瑞文量表，不同测试得分的儿童可划分为七个智力等级：智力测试得分≤69分为智力低下；得分70-79分为接近智力低下的临界水平；得分80-89分为智力水平中等以下；得分90-109分为智力水平中等；得分110-119分为智力水平中等以上；得分120-129分为智力水平优等；得分≥130分为智力水平超优(Wang et al.2007)。基于此，智力等级为中等以下的儿童对应的生物标记物(SEQ ID NO.2)甲基化范围为＜55.48％，生物标记物(SEQ ID NO.12)甲基化范围为＜44.85％。因此，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12序列所示的2个生物标记物的DNA甲基化水平可以作为判断铅暴露所致的儿童智力是否受损的预警指标，当生物标记物(SEQID NO.2)和生物标记物(SEQ ID NO.12)的DNA甲基化水平分别低于55％和45％时，儿童智力可能因为铅中毒而受到损害，需要引起足够重视。
为了评估以上模型的稳定性，我们将实施例1的人群按照性别划分亚组，然后分析各亚组中2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的DNA甲基化与儿童智力之间的关系，结果显示在男女性亚组中二者之间均呈现良好的线性关系，表明模型的稳定性。ROC曲线图显示如果将两个生物标志物的敏感性水平设为70％，则对儿童智力水平预测的特异性可以达到80％，且这两个生物标志物对铅影响儿童智力的预测准确性都较好(分别为80.70％和79.20％)(图1C)。因为本研究中所有儿童的智力测试得分均高于70分(没有智力低下儿童)，儿童智力发育还没有受到明显的损伤，表明生物标记物(SEQ ID NO.2)/生物标记物(SEQ ID NO.12)的甲基化异常改变发生在儿童智力受损之前，可用于血铅对儿童智力影响的早期预警。
实施例3
1.材料
人神经母瘤细胞系SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学学院细胞库。
2.方法
SH-SY5Y细胞用添加了10％FBS和1％P/S的DMEM/F12(1:1)培养基培养，当细胞生长至培养面80％左右时传代。
SH-SY5Y细胞用不同浓度的(0.4、1、2、10和50mg/L)铅处理三天或0.1mg/L的铅处理三十天后，用TRIzol试剂(Takara，日本)提取细胞总RNA，然后用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser；TaKaRa，日本)将RNA逆转成cDNA，最后利用PowerUp SYBR Green预混液(Life Technology，美国)在实时荧光定量PCR(反应体系为20μL，包括10μL SYBR Green染料、0.8μL引物、2μL模板和7.2μL去离子水；设置程序如下：50℃活化UDG 5分钟，然后94℃预变性2分钟。然后94℃30s、60℃30s和72℃60s进行40个循环，最后72℃延伸5分钟)系统(QuantStudio 12K Flex，ABI，美国)上检测生物标记物(SEQID NO.2和SEQ ID NO.12)的基因表达。引物序列如下：
生物标记物(SEQ ID NO.2)引物：
AAGAGGTTCTCGGCGCATTAC(正向)
CGGGCCTTCATGTCGTTCA(反向)
生物标记物(SEQ ID NO.12)引物：
ACCTAGAGGAGCATTACACCC(正向)
GAAGCGGTAGGAGTCGTTGG(反向)
3.结果
我们考察了铅暴露后2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的基因表达情况。结果显示Pb以1mg/L处理三天和以0.1mg/L处理一个月分别能使生物标记物(SEQ IDNO.2)的基因表达上调0.8倍和1.7倍，使生物标记物(SEQ ID NO.12)的基因表达上调0.2倍和4.1倍(图2A)。当暴露时间增加时基因表达的上调幅度明显增加，表明铅可能在细胞内难以被代谢而蓄积，从而对细胞产生持久性的累积效应，说明长期低浓度铅暴露的风险可能比短期高浓度暴露的风险更大。我们将SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的铅两天，然后检测2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的基因表达。结果显示铅诱导的2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)基因表达上调是浓度依赖性的(图2B)。我们利用UCSC预测上述1个生物标记物的基因片段是否具有CTCF和RAD21的结合位点(基因表达和RNA聚合酶的调控因子)，结果这两个片段都拥有CTCF和RAD21的结合位点，说明这两个片段调控其所在基因的表达(Cowley et al.2018)。同时我们对体外SH-SY5Y细胞中这两个片段的DNA甲基化和基因表达的相关分析也显示其DNA甲基化均与基因表达有显著负相关性(R＝-0.88,P＝0.002)。
我们的研究结果表明在血液和体外细胞模型中2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的DNA甲基化均与铅暴露浓度负相关。
实施例4
为了验证在体外细胞中是否存在与人群相似的定量关系，我们设计了一系列浓度的铅(20、50、100、500、1000、5000、25,000和100,000μg/L)染毒SH-SY5Y细胞两天，并测定2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的DNA甲基化和细胞ROS水平，并分析了铅暴露浓度、2个生物标记物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12)的DNA甲基化水平和细胞ROS水平两两之间的剂量-效应关系以及可能的基准剂量，结果显示铅暴露浓度的对数值与细胞ROS水平之间能够用Hill方程最优拟合(AIC＝305.00，最小，表明该模型拟合最优，软件输出结果显示该模型“可行-推荐”)，细胞ROS水平对铅暴露剂量的表达式如下：
y＝100.81+85.05×x4.07/(5.80+x3.07)
其中y为处理组相对于对照(未经铅染毒的SH-SY5Y细胞)的ROS水平，x为铅暴露剂量以10为底对数减1。基于10％因变量扰动，最终有模型估测出的基准剂量(BMD)约为85.11μg/L，基准剂量的下限值(BMDL)约为50.51μg/L(与美国CDC推荐的血铅标准50μg/L接近)，基准剂量的上限值(BMDU)约为154.08μg/L(表3)。剂量-效应曲线如图3A所示。
表3.BMDS软件输出的铅暴露与ROS生成/生物标记物(SEQ ID NO.2)甲基化的最佳拟合模型参数
铅暴露导致的生物标记物(SEQ ID NO.2)甲基化水平降低在一定范围内是浓度依赖性的(铅染毒浓度在0-1000μg/L之间)，当铅暴露浓度高于1000μg/L时，该标记物的DNA甲基化水平随着浓度改变时高时低没有明显的变化规律。我们用BMDS软件对有浓度依赖性的这部分数据进行了模型拟合，结果显示铅暴露浓度的对数值与如SEQ ID NO.2序列所示的生物标记物的DNA甲基化水平之间能够用线性方程最优拟合(AIC＝-100.49，最小，表明该模型拟合最优，软件输出结果显示该模型“可行-推荐”)，生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化水平对铅暴露剂量的表达式如下：
y＝0.57-0.01x
其中y为各处理组生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化率，x为铅暴露剂量以10为底对数减1。基于10％因变量扰动，最终有模型估测出的基准剂量(BMD)约为41.68μg/L，基准剂量的下限值(BMDL)约为25.58μg/L(美国CDC未来可能将血铅标准设为25μg/L)，基准剂量的上限值(BMDU)约为184.67μg/L(表2)。剂量-效应曲线如图3B所示。可以看到毒性指标和标志物对应的BMDL值的比值远小于10，表明生物标志物的可用性。接着，我们考察了生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化水平与ROS生成之间的定量关系，结果显示生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化与ROS之间有较好的线性负相关性(R2＝0.88)，细胞ROS对生物标记物(SEQ ID NO.2)甲基化的线性回归图如图3C所示。
而生物标记物(SEQ ID NO.12)的DNA甲基化与铅暴露浓度间无单调关系，这可能是因为在SH-SY5Y细胞中生物标记物(SEQ ID NO.12)甲基化水平很低(7％左右)，与血样中有较大差异(该标记物DNA甲基化在30％-80％之间)，因此导致我们在血液和SH-SY5Y细胞中观察到不同的结果。
在血液和SH-SY5Y细胞中铅暴露、生物标记物(SEQ ID NO.2)甲基化和健康(毒性)结局(IQ和ROS)之间相似的定量关系表明生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化不仅可以作为关联血铅与儿童智力的定量生物标志物，而且还可能作为关联铅暴露与神经毒性和疾病的生物标志物而加以应用。基于生物标记物(SEQ ID NO.2)的DNA甲基化与铅暴露和ROS都有较好的量效关系，并且与人群样本中三者之间的关系类似，可以较好的验证人群结果，是可用的生物标志物。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (7)

1.一组用于检测血铅诱导儿童智力降低的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.12所示的序列。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化与儿童智力存在线性关系。
3.根据权利要求2所述的生物标志物，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示序列的生物标志物的DNA甲基化在51.40%-78.78%之间时，儿童智力与该生物标志物的DNA甲基化有良好的线性关系。
4.根据权利要求2所述的生物标志物，其特征在于，如SEQ ID NO.12所示序列的生物标志物的DNA甲基化在31.41%-74.19%之间时，儿童智力与该生物标志物的DNA甲基化有良好的线性关系。
5.权利要求1-4任一项所述的生物标志物在制备检测血铅诱导儿童智力降低的产品中的应用。
6.检测权利要求1-4任一项所述的生物标志物的试剂在制备检测血铅诱导儿童智力降低的产品中的应用；所述试剂包括检测所述生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测所述生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
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