CN116064708A - 具有抗氧化活性的蜂王浆多肽、小分子肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜂王浆多肽，其制备方法为：(1)取蜂王浆，加水制成蜂王浆溶液，加入酸性蛋白酶，在30～70℃条件下反应3～8小时，得酶解液；(2)酶解液通过G‑15葡聚糖凝胶层析柱分离洗脱，共出现5个洗脱峰，收集F1～F5中的任意一种或两种以上的洗脱液，冻干，即得蜂王浆多肽。本发明还公开了若干条小分子肽，氨基酸序列如如SEQ ID NO.1、2、3所示。所述蜂王浆多肽、小分子肽均具有作为抑制氧化应激的功能性产品的潜力，可用于制备具有抗氧化活性功效的药物或保健品，制备具有抑制氧化应激功效的药物或保健品。

Description

具有抗氧化活性的蜂王浆多肽、小分子肽及其应用
技术领域
本发明涉及具有抗氧化活性的蜂王浆多肽、小分子肽及其应用，属于酶解加工产品技术领域。
背景技术
蜂王浆是年轻工蜂下咽和下颌腺分泌物，由水、蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物质和维生素组成，具有很高的营养价值，广泛应用于食品、生物和医疗等领域，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、增强机体免疫等多种生理功能。但是其加工利用程度很低，经济附加值低。
生物活性肽是蛋白质在水解、裂解或成熟过程中产生的功能性肽片段，其相对分子质量通常小于6000Da。常见的生物活性肽有大豆肽、谷胱甘肽、酪蛋白磷酸肽等，酶生物技术是一种适用于生产生物活性肽的高效方案，已被广泛应用于生物活性肽的生产。
氧化应激是动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、糖尿病和神经退行性疾病等的诱因。机体内自然存在的抗氧化体系在外界刺激下时常不能满足人体需求，需要额外通过膳食或药物补充抗氧化剂来减少氧化应激，以达到延缓衰老、改善亚健康状态、降低疾病发生率的效果。人工合成的抗氧化剂例如BHA、BHT、没食子酸等具有良好的抗氧化效果，然而这些物质具有一定的副作用。天然，安全性高的抗氧化物质是当今研究的热点问题。
发明内容
针对上述现有技术，为综合利用蜂王浆，本发明提供了一种蜂王浆多肽，其具有抗氧化活性，具有高附加值。本发明还提供了若干条具有抗氧化活性的小分子肽。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种蜂王浆多肽，通过以下方法制备得到：
(1)取蜂王浆，加水制成蜂王浆溶液，蜂王浆与水的料液比为1:3～11(单位g:ml)，调节蜂王浆溶液的初始pH值为2～6(用氢氧化钠溶液或盐酸调节)，加入酸性蛋白酶，加酶量为2000～10000U/g(酶活/蜂王浆)，在30～70℃条件下反应3～8小时，得酶解液；
(2)酶解液通过G-15葡聚糖凝胶层析柱分离洗脱，流动相为超纯水，洗脱速度为3.5mL/min，共出现5个洗脱峰，收集F1～F5中的任意一种或两种以上的洗脱液，冻干，即得蜂王浆多肽。
优选的，所述步骤(1)中，料液比为1:3。
优选的，所述步骤(1)中，初始pH值为4.0。
优选的，所述步骤(1)中，加酶量为8000U/g。
优选的，所述步骤(1)中，酶解温度为50℃。
优选的，所述步骤(1)中，酶解时间为5小时。
优选的，所述步骤(2)中，收集洗脱峰F4或F2的洗脱液，冻干，得组分F4或F2；经分离富集后的组分F4的DPPH自由基清除率较原酶解液和其它组分有显著提高，经分离富集后的组分F2的OH自由基清除率较原酶解液和其它组分有显著提高。
所述蜂王浆多肽在制备具有抗氧化活性功效的药物或保健品中的应用，在制备具有抑制氧化应激功效的药物或保健品中的应用。
一种小分子肽，其氨基酸序列为FDRIW，如SEQ ID NO.1所示。
一种小分子肽，其氨基酸序列为YPDWSW，如SEQ ID NO.2所示。
一种小分子肽，其氨基酸序列为WHDKIF，如SEQ ID NO.3所示。
经实验证明,上述3种小分子肽均具有良好的DPPH自由基清除活性，具有作为抑制氧化应激的功能性产品的潜力，因此，可用于制备具有抗氧化活性功效的药物或保健品，可用于制备具有抑制氧化应激功效的药物或保健品。
本发明通过特定方法(酶解+凝胶过滤层析)处理蜂王浆，得到了具有抗氧化活性的蜂王浆多肽，经LC-MS/MS鉴定，筛选得到了对DPPH自由基具有高清除活性的三条小分子肽，分别为：FDRIW(IC50＝3.63mg/ml)，YPDWSW(IC50＝3.59mg/ml)，WHDKIF(IC50＝1.00mg/ml)，这三条小分子肽均具有作为抗氧化功能性产品的潜力。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1A：蛋白酶对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图1B：蛋白酶对OH自由基清除率的影响示意图。
图2A：酶解时间对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图2B：酶解时间对OH自由基清除率的影响示意图。
图3A：温度对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图3B：温度对OH自由基清除率的影响示意图。
图4A：加酶量对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图4B：加酶量对OH自由基清除率的影响示意图。
图5A：料液比对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图5B：料液比对OH自由基清除率的影响示意图。
图6A：初始pH值对DPPH自由基清除率的影响示意图。
图6B：初始pH值对OH自由基清除率的影响示意图。
图7：1.5mL/min流速对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图8：3.5mL/min流速对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图9：5.5mL/min流速对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图10：7.5mL/min流速对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图11：0.5mL上样量对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图12：1mL上样量对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图13：1.5mL上样量对Sephadex G-15分离效果的影响示意图。
图14：Sephadex G-15最佳洗脱曲线示意图。
图15A：各组分对DPPH自由基清除率测定结果示意图。
图15B：各组分对OH自由基清除率测定结果示意图。
图16：样品质谱Basepeak图。
图17：FDRIW的质谱图。
图18：YPDWSW的质谱图。
图19：WHDKIF的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
下述实施例所采用的蜂王浆，购自山东丰采健康产业有限公司，置于密封不透光袋中，置于-20℃环境，备用。
实施例1蜂王浆酶解工艺单因素优化
1.筛酶
选取木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶对原料进行酶解。准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:8配成底物液，按加酶量4000U/g(酶活/蜂王浆)分别加入五种蛋白酶，在50℃、200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率。
DPPH自由基清除率的测定：分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至517nm。取500μl酶解液，与1000μl 0.2mM的DPPH溶液(溶解于无水乙醇中)混合，震荡摇匀，室温下置于黑暗环境中反应20min，过滤。测定其在517nm处的吸光值Ai，以500μl无水乙醇替代DPPH溶液测得吸光值Aj，用500μl水替代酶解液测得吸光值A0。DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH清除率＝(1-Ai-Aj/A0)×100％。以BHA(丁基羟基茴香醚)为对照。
OH自由基清除率的测定：取待测液0.1mL，然后精确加入0.5mL水杨酸-乙醇溶液(9mmol/L)、0.5mL硫酸亚铁溶液(9mmol/L)和0.5mL H2O2溶液(8.8mmol/L)，混匀后在37℃下避光反应30min，测定其在510nm处的吸光值Ai。同时将0.5mL H2O2溶液换成0.5mL蒸馏水，测其吸光值Aj；将0.1mL样品溶液换成0.1mL蒸馏水，测其吸光值A0。OH自由基清除率计算公式为：OH自由基清除率＝(1-Ai-Aj/A0)×100％。以Vc(维生素C)为对照。
本实验选择了五种蛋白酶对蜂王浆进行酶解，结果如图1A、图1B所示。木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶分别对蜂王浆进行酶解，DPPH自由基清除率实验中酸性蛋白酶效果最好，其次是碱性蛋白酶和中性蛋白酶。OH自由基清除率实验中酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶均具有较好的自由基清除效果。综合考虑蛋白酶效果与添加成本等因素，选择酸性蛋白酶作为进一步优化的酶制剂。
2.酶解时间优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:8配成底物液，按加酶量4000U/g加入酸性蛋白酶，调节底物液的初始pH值为4，在50℃、200rpm条件下分别反应3h、4h、5h、6h、7h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)，取一定量上清液测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率，测定方法同上。
结果如图2A、图2B所示。DPPH自由基清除活性在短时间内随着酶解时间的增加而增加，酶解3或4小时与酶解5小时之间存在显著性差异(P<0.05)，酶解5～8小时之间没有显著性差异(P>0.05)。OH自由基清除活性在酶解时间为5h时活性最高，与其他组具有显著性差异(P<0.05)。综合考虑酶解效果与酶解效率，最终选定5h为酶解处理时间。
3.酶解温度优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:8配成底物液，初始pH值为4，按加酶量4000U/g加入酸性蛋白酶，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率，测定方法同上。
结果如图3A、图3B所示。随着酶解温度的升高，DPPH自由基清除活性呈现先升高后降低的趋势，其中，当酶解温度为50℃时，DPPH自由基清除活性最高，与60℃无显著性差异(P>0.05)，而显著高于其他组(P<0.05)。OH自由基清除活性随温度变化不大。综合考虑酶解效果，选定50℃为酶解处理温度。
4.加酶量优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:8配成底物液，按加酶量2000、4000、6000、8000、10000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃、200rpm条件下反应5h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率，测定方法同上。
结果如图4A、图4B所示。随着加酶量的增加，酶解液的DPPH自由基清除率总体呈现逐渐上升的趋势，加酶量为6000U/g与加酶量为8000U/g之间没有显著性差异(P>0.05)；加酶量为8000U/g与加酶量为10000U/g之间具有显著性差异(P<0.05)。酶解液的OH自由基清除率与加酶量变化关系不大。综合成本考虑选择加酶量为8000U/g进行进一步实验。
5.料液比优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，分别以料液比1:3、1:5、1:7、1:9、1:11配成底物液，按加酶量8000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃、200rpm条件下反应5h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率，测定方法同上。
结果如图5A、图5B所示。随着料液比的增加，酶解液的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率呈现逐渐下降的趋势。料液比为1：5与料液比为1：3之间酶解液的DPPH自由基清除率没有显著性差异(P>0.05)。料液比为1：5与料液比为1：3之间酶解液的OH自由基清除率存在显著性差异(P<0.05)。综合考虑，选定料液比为1：3进行下一步实验。
6.初始pH值优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:3配成底物液，以1M盐酸或1M NaOH溶液调底物液的初始pH值为2、3、4、5、6，按加酶量8000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃、200rpm条件下反应5h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清液测定DPPH自由基清除率和OH自由基清除率，测定方法同上。
结果如图6A、图6B所示。随着初始PH值的升高，酶解液的DPPH自由基清除率先升高后下降，初始pH 4与初始pH 5之间没有显著性差异(P>0.05)，酶解液的OH自由基清除率在初始pH在3～5之间较好，在初始pH为2或8时较差。综合蜂王浆本身酸碱特性，选定初始pH为4进行下一步实验。
7.蜂王浆酶解工艺正交优化
在上述单因素实验基础上，以料液比、酶解pH、酶解温度，加酶量为实验考察因素，以DPPH自由基清除率、OH自由基清除率为评价指标，设计L9(43)正交实验优化提取条件(酶解时间为5小时)，因素与水平设计与实验结果见表1、表2。
表1DPPH自由基清除率正交试验结果
Figure BDA0003872947800000061
表2OH自由基清除率正交试验结果
Figure BDA0003872947800000062
Figure BDA0003872947800000071
DPPH自由基清除率正交优化实验结果如表1所示。从R值分析可得知，料液比、初始pH值和酶解温度对酶解液DPPH自由基清除率影响的主次效应为：A>B>C>D，即料液比影响最大，其次是初始pH值和酶解温度，加酶量对酶解液DPPH自由基清除率的影响最小。最终优化组合为A1B2C3D3，即当料液比1:4，初始pH为5，酶解温度为50℃，加酶量9000U/g时，酶解效果最佳。
OH自由基清除率正交优化实验结果如表2所示。从R值分析可得知，料液比、初始pH值和酶解温度对酶解液OH自由基清除率影响的主次效应为：A>D>C>B，即料液比影响最大，其次是加酶量和酶解温度，初始pH对酶解液OH自由基清除率的影响最小。最终优化组合为A1B1C1D3，即当料液比1:4，初始pH为4，酶解温度为45℃，加酶量9000U/g时，酶解效果最佳。
相比较酶初始pH 4时所得产物，初始pH 5时所获蜂王浆酶解产物对DPPH的清除率提高2％，OH自由基清除率值下降1％。因素B对蜂王浆酶解产物清除DPPH影响次序排在第二，对OH自由基清除影响次序排在第四。因此，初始PH最终确定为5。相比温度为45℃时所得产物，温度为50℃时所获蜂王浆酶解产物对DPPH的清除率提高2％，OH自由基清除率值下降3％。因素C对蜂王浆酶解产物清除DPPH和OH自由基影响次序均排在第三，因此，温度最终确定为45℃。
经过上述验证实验，在酶解条件为：料液比1:4，初始pH为5，酶解温度为45℃，加酶量9000U/g，酶解时间5h时，DPPH自由基和OH自由基清除率最高，分别可达93％和91％。
实施例2凝胶过滤层析条件优化及其组分活性分析
1.酶解液分子量测定
采用高效液相色谱法测定分子量的分布情况，色谱条件为：色谱柱，TSK gel2000SWXL300mm×7.8mm；流动相，V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)＝45：55：0.1；检测波长UV220nm；流速0.5mL/min；柱温30℃。
以实施例1.7中制备的酶解液(料液比1:4，初始pH为5，酶解温度为45℃，加酶量9000U/g，酶解时间5h)作为样品，待测样品用流动相稀释后，0.22μm微孔滤膜过滤后进样。凝胶过滤色谱柱分子量标准品为：细胞色素C(12384Da)，猪胰岛素(5733.49Da)，杆菌肽(1422.69Da)，谷胱氨肽(307.32Da)。根据标准品出峰时间绘制标准曲线，根据绘制的标准曲线拟合计算蜂王浆酶解液多肽分子量，结果如表3所示，分子量范围在727Da以下，故选择葡聚糖凝胶G-15(Sephadex G-15)作为尺寸排阻层析柱的填料。
表3蜂王浆多肽分子量分布结果
Figure BDA0003872947800000081
2.不同洗脱流速对纯化效果的影响分析
将填料在过量去离子水，室温条件下膨胀3小时，溶胀过程中，去除上层碎胶。将溶胀好的填料，所有的缓冲液等材料平衡至实验操作温度。
将柱内及柱子底端用水润湿并保持一小段液位务必使底端无气泡。用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
上样前平衡层析柱5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止。样品一定要离过滤后(0.45μm)上样。
以实施例1.7中制备的酶解液作为样品进行上样，上样前过0.45μm滤膜。上样浓度及体积为：200mg/mL，2mL；收集出峰的组分，流动相为超纯水。
合适的洗脱流速会提高Sephadex G-15的分离效果。在上样量和样品浓度不变的情况下，考察1.5mL/min、3.5mL/min、5.5mL/min，7.5mL/min四种不同的洗脱流速对分离效果的影响。
结果如图7、图8、图9、图10所示。洗脱流速为1.5mL/min时，流速较低，样品流动性差，扩散加剧，峰型不佳。流速为3.5mL/min时，峰型改善。洗脱流速为5.5mL/min时峰型较好。洗脱流速为7.5mL/min时，流速较大，小分子多肽未进入凝胶介质中就被洗脱下来，且峰与峰之间存在拖尾现象。因此，综合考虑锋型，最终确定使用3.5mL/min的流速进行试验。
3.不同加样量速对纯化效果的影响分析
不同的上样量影响Sephadex G-15柱子的分离效果，控制上样浓度和洗脱流速不变的情况下，考察0.5mL、1mL、1.5mL的上样量对分离效果的影响，结果如图11、图12、图13所示。上样量为0.5mL时，分离后各组分含量较少，导致峰型不佳；上样量为1.5mL时，由于样品较多，出现拖尾。综合考虑峰型和峰数，最终选择1mL的上样量进行后续试验。
4.最佳洗脱曲线和各组分测定结果
如图14所示，依次收集洗脱峰F1～F5(各洗脱峰得到的组分分别命名为F1～F5)，冻干后复配成多肽浓度为24mg/mL的溶液，测定各组分的DPPH的清除率、OH自由基清除率，结果如图15A、图15B所示(图中组分1～5分别为F1～F5)。F4在浓度为24mg/mL时DPPH的清除率可达86％，F2在浓度为24mg/mL时OH自由基清除率可达59％。
实施例3F4肽段组成LC-MS/MS质谱鉴定
1.多肽提取
样品(实施例2得到的F4)加入适量0.1％TFA(三氟乙酸)溶液复溶，OD280nm测定肽段浓度，以备LC-MS分析。
2.LC-MS/MS分析
每例样品取适量肽段，使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统(ThermoScientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸、乙腈和水混合溶液(其中乙腈为80％)。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样到TrapColumn(100μm×20mm，5μm，C 18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm×150mm，3μm，C 18，Dr.MaischGmbH)进行梯度分离，流速为300nl/min。
液相分离梯度如下：0分钟～2分钟，B液线性梯度从2％到5％；2分钟～44分钟，B液线性梯度从5％到28％；44分钟～51分钟，B液线性梯度从28％到40％；51分钟～53分钟，B液线性梯度从40％到100％；53分钟～60分钟，B液维持在100％。
肽段分离后用Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围:350～1800m/z，一级质谱分辨率:60000@m/z 200，AGC target:3e6，一级Maximum IT:50ms。
肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(fμll scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率:15000@m/z 200，AGCtarget:le5，二级Maximum IT:50ms，MS2 Activation Type:HCD，Isolation window：1.6m/z，Normalized collisionenergy:28。
3.数据库检索
本项目采用的质谱数据库检索软件为Pfind。使用如下蛋白质数据库：UniprotProtein Database。其中Pfind搜库软件分析参数设置如表4所示。
表4pFind分析参数设置
Figure BDA0003872947800000101
质谱数据检索后采用PSM FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01分别为肽段、位点与蛋白鉴定的筛选标准。得到821条肽段序列和57条蛋白序列，样品质谱Basepeak图如图16所示。
实施例4肽段筛选、合成及验证
1.多肽活性预测
根据Peptide Raker对多肽生物活性的预测分数进行排序，821个肽段中预测评分大于0.8的有36个肽段。目前抗氧化肽的定量构效关系还未完全阐明，但是大量的研究统计结果发现，氨基酸组成及其位于肽序列中的位置对多肽抗氧化活性起着至关重要的作用：活性肽N末端的氨基酸残基(Tyr、Phe、Trp、Pro)，C端的蛋氨酸可能是作用于自由基清除的关键位点。N端的Pro能够向DPPH自由基提供质子，从而阻止自由基链式反应，C端的Met氧化产物甲硫氨酸亚砜抗氧化效果明显，含硫氨基酸中Met上的S原子的巯基使其具有清除自由基的能力。此外，Leu、Val、Ala等可以用作芳香残基侧链上自由基过氧化的供氢体，提高肽的抗氧化性。以氨基酸特征进行筛选，36个多肽中共有15个肽符合上述特征。采用ToxinPred在线工具测定15个潜在的生理活性多肽的SVM分数，均为负值，说明都没有毒性。
综合考虑，筛选符合氨基酸特征且Peptide Ranker预测评分前10的肽段(FDRIW、YPDWSF、YPDWSW、FPYQPP、YPDWY、FNFDDVNFRIL、YPDWSFA、WHDKIF、WISPLY和YPDWSWT)进行合成并验证DPPH自由清除活性。
2.多肽合成
肽段FDRIW、YPDWSF、YPDWSW、FPYQPP、YPDWY、FNFDDVNFRIL、YPDWSFA、WHDKIF、WISPLY和YPDWSWT均由生工生物工程(上海)股份有限公司采用Fmoc固相合成方法合成。
3.活性验证
将多肽配成终浓度3.3mg/mL的溶液，按照实施例1的方法测定合成多肽的体外DPPH自由基清除率，结果如表5所示。10条肽段中，FDRIW、YPDWSW、WHDKIF活性最强，肽段自由基清除率IC50如表6所示，质谱图如图17、18、19所示。
表5肽段DPPH清除率
Figure BDA0003872947800000111
表6肽段自由基清除率IC50
Figure BDA0003872947800000112
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种蜂王浆多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取蜂王浆，加水制成蜂王浆溶液，蜂王浆与水的料液比为1:3～11，调节蜂王浆溶液的初始pH值为2～6，加入酸性蛋白酶，加酶量为2000～10000U/g，在30～70℃条件下反应3～8小时，得酶解液；
(2)酶解液通过G-15葡聚糖凝胶层析柱分离洗脱，流动相为超纯水，共出现5个洗脱峰，收集F1～F5中的任意一种或两种以上的洗脱液，冻干，即得蜂王浆多肽。
2.根据权利要求1所述的蜂王浆多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，料液比为1:3；初始pH值为4.0；加酶量为8000U/g；酶解温度为50℃；酶解时间为5小时。
3.根据权利要求1或2所述的蜂王浆多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，收集洗脱峰F4或F2的洗脱液，冻干，得组分F4或F2。
4.利用权利要求1～3中任一项所述的制备方法制备得到的蜂王浆多肽。
5.权利要求4所述的蜂王浆多肽在制备具有抗氧化活性功效的药物或保健品中的应用，或在制备具有抑制氧化应激功效的药物或保健品中的应用。
6.一种小分子肽，其特征在于：其氨基酸序列为FDRIW。
7.一种小分子肽，其特征在于：其氨基酸序列为YPDWSW。
8.一种小分子肽，其特征在于：其氨基酸序列为WHDKIF。
9.权利要求6或7或8所述的小分子肽在制备具有抗氧化活性功效的药物或保健品中的应用，或在制备具有抑制氧化应激功效的药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗氧化活性是DPPH自由基清除活性。
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