CN116064687A - 一种生物质预处理和制备乙醇的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物质燃料生产技术领域，涉及一种生物质预处理和制备乙醇的方法及其应用。本发明提供了一种生物质预处理方法，包括：采用亚临界水‑乙醇对生物质进行预处理。本发明采用亚临界水‑乙醇对生物质进行预处理，较单一亚临界水或单一亚临界乙醇处理体系，对生物质中的木质素有着显著的去除作用，可以释放出更多易于酶解的纤维素。本发明还提供了生物质进行预处理后添加纤维素酶和纤维二糖酶进行酶解，采用同步糖化发酵或分布糖化发酵生产乙醇的方法，获得最优的参数下利用生物质转化为清洁能源乙醇。
Description
技术领域
本发明属于生物质燃料生产技术领域，涉及一种生物质预处理和制备乙醇的方法及其应用。
背景技术
生物质是一种重要的能源资源，提供世界能源需求的10％～14％。玉米秸秆是中国最丰富的农业废弃物，作为一种生物质，主要由三种聚合物组成：纤维素(33％～45％)、半纤维素(20％～30％)和木质素(11％～23％)，以及少量的果胶、提取物、蛋白质、灰分等。纤维素是一种聚合物，由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖单体组成，半纤维素是一种支链聚合物，由各种单糖组成，包括戊糖(l-阿拉伯糖、d-木糖)、己糖(d-半乳糖、d-葡萄糖、d-甘露糖)和己糖酸(d-葡醛酸)，而木质素包含大量酚单元(对羟基苯基、愈创木基、紫丁香基)。然而，木质素位于植物细胞壁的外层，以共价键附着在半纤维素上，而纤维素则嵌入在半纤维素和木质素中，因此分子间的相互作用决定了其复杂而难降解的结构，难以水解生成生物燃料。因此，为了打破玉米秸秆的刚性结构，便于水解发酵，进而生产生物乙醇、甲烷等生物燃料，预处理是不可避免的过程。
生物质的预处理方法主要分为三大类：化学方法，稀酸、碱溶液等：物理方法，热水、蒸汽爆炸等；生物学方法，真菌、细菌发酵等。虽然一些传统的化学或物理化学方法对生物质的预处理是有效的，但同时也带来了一些问题。
对于物理法而言，以蒸汽爆破、微波/辐照处理、机械粉碎等为主，虽然蒸汽爆破和微波/辐照预处理可对木质纤维素进行有效地预处理，但是蒸汽爆破耗能较高(蒸汽的产生)，同时设备的投资成本较高，微波/辐照预处理虽具有高均匀性、良好的选择性和低能耗的优点，但是前期的装置/设备投资成本较高，因成本问题限制了二者的大规模应用。比较而言，机械粉碎的成本较低，但是预处理效果较差。同时物理法对木质素的去除效果不佳。对于化学法而言，以稀酸(稀硫酸为主)和稀碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等为主)处理为主，且稀酸和稀碱预处理的应用比较广泛，技术基本成熟，对木质纤维素的预处理效果较好，但是二者最大的弊端就是酸性或碱性废液难以回收，处理废液需要成本，处理不好必然会造成环境污染。对于生物法而言，生物预处理主要通过细菌和真菌降解木质素，尤其是白腐菌的应用最为广泛，降解木质素效果也显著，但却很少有利用真菌降解木质素的工业化生产，这与真菌生长缓慢和木质素降解酶获得不易有关。
发明内容
本发明的目的在于开发一种生物质预处理和制备乙醇的方法，解决生物、物理或化学预处理方法中的环境污染、成本高、预处理效率低、工艺复杂等问题。
基于上述目的，本申请通过提供一种生物质预处理和制备乙醇的方法及其应用来解决该领域中的这种需要。
亚临界水预处理不需要任何化学试剂，被认为是一种生态友好的生物质预处理方法。但水的临界值较高(647.3K，22.1MPa)意味着亚/超临界水预处理工艺对操作条件要求较高，而乙醇的使用可以降低临界值(516.2K，6.38MPa)，使反应更加温和，同时乙醇具有增溶木质素和半纤维素的能力，使处理后的纤维素更适合酶的水解。因此，与单一溶剂(即水体系)相比，混合物(即水-乙醇体系)更有利于生物乙醇的生产。虽然亚临界水-乙醇对生物质预处理是可行的，但必须考虑能源成本(乙醇的使用和回收)和在极其严格和高效控制下的操作成本(乙醇的挥发性/可燃性)。因此，有必要对亚临界水-乙醇的最佳参数采取措施，以提高效率，使成本效益达到最大化。
一方面，本发明涉及一种生物质预处理方法，其包括：采用亚临界水-乙醇对生物质进行预处理；所述生物质包括：木质素、纤维素和半纤维。
进一步地，本发明提供的生物质预处理方法中，所述预处理的条件为：温度为180～240℃，乙醇浓度为20％～40％，时间为10～30min，液料比为1:20～40；优选地，所述预处理的条件为：温度为220℃，乙醇浓度为29.19％，时间为20min，液料比为1:35.73。
另一方面，本发明涉及一种生物质制备乙醇的方法，其包括：采用上述的生物质预处理方法对所述生物质进行预处理得到底物；添加纤维素酶和纤维二糖酶所述底物进行酶解，采用同步糖化发酵或分布糖化发酵生产乙醇。
进一步地，本发明提供的生物质制备乙醇的方法中，所述纤维素酶的用量20～40FPU/g，所述纤维二糖酶的用量为1～7U/g。
进一步地，本发明提供的生物质制备乙醇的方法中，所述底物的浓度为5％～17％；优选地，所述底物的浓度为16％。
进一步地，本发明提供的生物质制备乙醇的方法中，所述酶解的时间为72h，所述酶解的孵化条件为50℃200rpm。
另一方面，本发明涉及上述的生物质预处理方法在去除生物质中木质素的应用。
另一方面，本发明涉及上述的生物质制备乙醇的方法在生物质制备乙醇中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
木质素是影响生物质酶解生产乙醇的关键因素，木质素可以和酶进行非生产性的结合，从而增加酶解压力，所以在预处理的过程中，对木质素进行去除是一个关键性问题。本发明提供了一种生物质预处理方法，解决了亚临界水预处理方法中水的临界值较高(647.3K，22.1MPa)，以及对木质素的溶解能力有限的问题；与单一的亚临界水法相比，本发明采用亚临界水-乙醇处理增强了对木质素的溶解和去除，可以暴露出更多易于酶解的纤维素，从而释放出更多可用于发酵的糖。
附图说明
图1为生物质预处理响应面实验结果。a为料液比和时间的显著交互项，b为料液比和乙醇浓度的显著交互项。
图2为温度与葡萄糖浓度的关系。
图3为乙醇浓度与葡萄糖浓度的关系。
图4为料液比与葡萄糖浓度的关系。
图5为时间与葡萄糖浓度的关系。
图6为纤维素酶与葡萄糖浓度的关系。
图7为纤维二糖酶与葡萄糖浓度的关系。
图8为底物浓度与葡萄糖浓度的关系。
图9为亚临界水-乙醇预处理下分布糖化发酵的葡萄糖浓度。
图10为亚临界水预处理下分布糖化发酵的葡萄糖浓度。
图11为亚临界水-乙醇预处理下同步糖化发酵的葡萄糖浓度。
图12为亚临界水预处理下同步糖化发酵的葡萄糖浓度。
图13为不同预处理下的底物成分构成。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
本实施例提供了通过响应面优化实验确定最优的预处理条件和生产乙醇的试验。
试验原料：纤维素酶CEL-01，购自夏盛实业集团有限公司；纤维二糖酶SPE-007AL，购自夏盛实业集团有限公司；安琪干酵母，购自安琪酵母股份有限公司，已商业化菌种，型号CECA；生物质，玉米秸秆，玉米秸秆经过粉碎机粉碎过60目的筛网，于105℃下干燥24h。
对纤维素酶CEL-01和纤维二糖酶SPE-007AL的酶活进行测定。CEL-01酶活219.23FPU/g，SPE-007AL酶活28.62U/mL。
(1)生物质预处理响应面实验
以酶解后的葡萄糖浓度为指标(酶解条件50℃、72h、200rpm)，首先根据单因素实验进行选点(温度140～240℃，时间0～20mins，乙醇浓度0％～40％，液料比10～50)，再根据响应面实验得出最优的预处理条件。
乙醇浓度单因素：
乙醇浓度：0％、10％、20％、30％、40％。
条件：处理温度160℃(156℃～165℃)，处理时间5mins，料液比1：20，N2排气3mins，冷却时要在3mins以内降至100℃以下，并于70℃以下时打开反应釜。
料液比单因素：
料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50。
条件：处理温度160℃(156℃～165℃)，处理时间5mins，乙醇浓度20％，N2排气3mins，冷却时要在3mins以内降至100℃以下，并于70℃以下时打开反应釜。
处理时间单因素：
处理时间：0min、5min、10min、15min、20min。
条件：处理温度160℃(156℃～165℃)，乙醇浓度20％，料液比1:20，N2排气3mins，冷却时要在3mins以内降至100℃以下，并于70℃以下时打开反应釜。
处理温度：140℃(136℃～145℃)、160℃(156℃～165℃)、180℃(176℃～185℃)、200℃(196℃～205℃)、220℃(216℃～225℃)。
条件：料液比1:20，乙醇浓度20％，处理时间5min，N2排气3mins，冷却时要在3mins以内降至100℃以下，并于70℃以下时打开反应釜。
所得残渣和葡萄糖于105℃下烘干至恒重，利用高效液相色谱法测定酶解后葡萄糖的含量。高效液相色谱法的条件：色谱柱型号为AminexHPX-87H，柱温60℃，检测器为折光示差检测器，检测器温度40℃，流动相为0.005M硫酸，流速0.6mL/min，进样量为10μL。
在单因素试验中，玉米秸秆和G3砂芯漏斗于105℃下烘干24h，预处理后所获残渣于105℃下烘干(精确到两位小数)，葡萄糖于105℃下烘干至恒重(精确到四位小数，恒重定义±0.3mg)。
酶解条件：1.0g样品+20mL柠檬酸盐缓冲液(0.05M柠檬酸+0.05M柠檬酸钠调整pH至4.80)+20FPU/g纤维素酶+1U/g纤维二糖酶+72h。
试验结果如图2-5所示。
由图2可知，140℃～220℃时，葡萄糖浓度呈现上升趋势；220℃～240℃时，葡萄糖浓度呈现下降趋势。由图3可知，0％～30％时，葡萄糖浓度总体呈现上升趋势，在20％处有微弱的波动；30％～40％时，葡萄糖浓度呈现下降趋势。由图4可知，针对料液比，葡萄糖浓度总体呈现微弱的下降趋势，但是在后面的响应面的方差分析中可以看出，料液比的单因素对整个实验是没有显著影响的。由图5可知，对于时间的单因素，0～10分钟时，葡萄糖浓度呈现上升趋势，10～20分钟时，葡萄糖浓度呈现下降趋势。
响应面试验操作同上条件。
根据单因素试验结果进行选点，选点如表1所示。利用Design Expert8.0.6(Stat-Ease,Inc.,Minneapolis,USA)设计了28组试验，如表2所示。
表1，四因素三水平试验设计表
表2，预处理过程的响应面设计
表3，方差分析
注：**代表极显著(P<0.01)，*代表显著(P<0.05)，-代表不显著(P>0.05)。
根据软件预测，最优条件为温度220℃、时间20mins、乙醇浓度29.19％、料液比1:35.73。根据表3方差分析，可以看出模型极显著，失拟项不显著，说明模型拟合程度良好。得到模型：Y(葡萄糖浓度)＝11.42+5.84X1+1.90X2+0.50X3-0.13X4-0.83X2X4+0.96X3X4+2.06X1 2-1.75X2 2-1.66X4 2-0.88X1X2X4-2.09X1 2X2-2.38X1X2 2，R2＝0.9537。R2(相关系数)越大，说明方程的拟合程度越好。
(2)酶解过程的优化
对纤维素酶CEL-01(15FPU～40FPU)和纤维二糖酶SPE-007AL(1U～7U)的用量、酶解底物浓度(5％～17％)和酶解时间(0～96h)进行优化。
将在最佳预处理条件下获得的残渣置于100mL的锥形瓶中进行酶解，底物浓度设置为5％(1g残渣+20mLpH＝4.80的柠檬酸缓冲液)，纤维素酶设置为15、20、25、30、35、40FPU/g，同时加入1U/g的纤维二糖酶，在50℃、200rpm的摇床中培养，同时在12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、120h分别取出50μL上清液，测定葡萄糖浓度的变化规律，试验结果如图6所示。
由图6可知，以72小时为例，当酶量从20FPU上升至30FPU时，葡萄糖浓度上升了14.02％，从30FPU上升至40FPU时，葡萄糖浓度没有得到显著上升(p＞0.05)。当酶量低于20FPU时，所获得的葡萄糖浓度太低，不利于后期的乙醇发酵。
将在最佳预处理条件下获得的残渣置于100mL的锥形瓶中进行酶解，底物浓度设置为5％(1g残渣+20mLpH＝4.80的柠檬酸缓冲液)，纤维素酶设置为30FPU/g，纤维二糖酶的用量设置为1、2、3、4、5、6、7U/g，在50℃、200rpm的摇床中培养72小时，测定葡萄糖浓度和酶解率的变化规律，试验结果如图7所示。
由图7可知，根据实验结果，1～7U/g之间没有显著性差异，故选1U/g。
将在最佳预处理条件下获得的残渣置于100mL的锥形瓶中进行酶解，底物浓度设置为5％、7.5％、10％、12.5％、15％、16％、17％(40mLpH＝4.80的柠檬酸缓冲液，残渣量根底底物浓度进行添加)，纤维素酶设置为30FPU/g，纤维二糖酶的用量设置为1U/g，在50℃、200rpm的摇床中培养72小时，测定葡萄糖浓度和酶解率的变化规律，试验结果如图8所示。
由图8可知，5％～16％的底物浓度下，葡萄糖呈现上升趋势，这是由于底物浓度上升所致，酶解率呈现下降趋势，这与高底物浓度的抑制有关。当底物浓度到达17％时，因底物浓度太大，物料混合不均匀，酶解压力太大，造成葡萄糖浓度和酶解率均呈现下降趋势。
(3)不同亚临界预处理以及同步糖化发酵或分布糖化发酵生产乙醇的试验
残渣的获取条件：水-乙醇处理的残渣获取条件：温度220℃，时间20mins，乙醇浓度29.19％，料液比1:35.73；水处理的残渣获取条件：温度220℃，时间20mins，料液比1:35.73。
分布糖化发酵：在底物浓度16％，CEL-01用量30FPU/g、SPE-007AL用量1U/g、酶解时间72小时，孵化条件50℃、200rpm。酶解完毕，通过离心收集上清液，121℃灭菌20分钟，10％的接种量接种已活化的安琪干酵母，发酵72小时，间隔12小时监测葡萄糖浓度和乙醇浓度的变化规律。
同步糖化发酵：在底物浓度16％条件下121℃灭菌20分钟，待冷却后，CEL-01用量30FPU/g、SPE-007AL用量1U/g、酶解时间72小时，孵化条件50℃、200rpm。酶解完毕，立即以10％的接种量接种已活化的安琪干酵母，发酵72小时，间隔12小时监测葡萄糖浓度和乙醇浓度的变化规律。
图9为亚临界水-乙醇预处理下分布糖化发酵的葡萄糖浓度。图10为亚临界水预处理下分布糖化发酵的葡萄糖浓度。图11为亚临界水-乙醇预处理下同步糖化发酵的葡萄糖浓度。图12为亚临界水预处理下同步糖化发酵的葡萄糖浓度。
由图9和图10可知，对于分布糖化发酵而言，残渣在30FPU/g的纤维素酶，1U/g的纤维二糖酶的添加量下，在底物浓度16％的条件下，在50℃、200rpm的摇床里孵化72小时。孵化结束8000rpm离心15mins获取上清液，121℃灭菌20分钟，以10％(v/v)接种量接种已活化的酵母液。每隔12小时取样50μL，用于检测葡萄糖和乙醇的变化规律。经过72小时的发酵，水乙醇预处理的残渣可获得3.47％(v/v)的乙醇浓度，单一水预处理的残渣可获得2.24％(v/v)的乙醇浓度。水处理残渣酶解后葡萄糖浓度低是导致乙醇浓度低的直接因素。由图11和图12可知，对于同步糖化发酵而言，残渣和缓冲液先121℃灭菌20分钟，以16％的底物浓度在超净工作台中混合，酶解条件与分布糖化发酵相同，待时间达到72小时后，直接接种10％(v/v)已活化的酵母液，发酵72小时，间隔12小时取样50μL，用于检测葡萄糖和乙醇的变化规律。经过72小时的发酵，水乙醇预处理的残渣可获得3.80％(v/v)的乙醇浓度，水处理的残渣可获得3.00％(v/v)的乙醇浓度，水处理残渣酶解后葡萄糖浓度低是导致乙醇浓度低的直接因素，对于同步糖化发酵而言，可避免糖浓度过高引起的反馈抑制，这也是为什么乙醇浓度较分布糖化发酵高一点的原因。
图13为不同预处理下的底物成分构成。由图13可知，经过亚临界水-乙醇预处理，纤维素由34.68％增加至66.99％，木质素由27.10％增加至30.41％；经过亚临界水预处理，纤维素由34.68％增加至57.89％，木质素由27.10％增加至44.33％。从其中亚临界水-乙醇处理后残渣量为46.66％，亚临界水处理后残渣量为49.24％，可以说明，在处理结束后，两者在残渣量相差不大的情况下，亚临界水-乙醇后的残渣可以暴露出更多可用于酶解的纤维素，且亚临界水-乙醇预处理后残渣的木质素含量较低，从而说明亚临界水-乙醇预处理对木质素有更好的去除效果。在酶解后，亚临界水-乙醇预处理后的残渣酶解效果更好，酶解率达59.80％，而亚临界水预处理的残渣酶解率为47.09％(注释：虽然酶解率仅高12.71％，但是由于水-乙醇处理后的纤维素含量高于水处理后的纤维素含量，故实际上葡萄糖浓度大了20+g/L)，其中木质素是影响酶解的关键因素，亚临界水-乙醇对木质素的去除可更好的利于酶解，有益于发酵糖的获得，从而获得更高的乙醇。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种生物质预处理方法，其特征在于，包括：采用亚临界水-乙醇对生物质进行预处理；
所述生物质包括：木质素、纤维素和半纤维。
2.根据权利要求1所述的生物质预处理方法，其特征在于，所述预处理的条件为：温度为180～240℃，乙醇浓度为20％～40％，时间为10～30min，液料比为1:20～40。
3.根据权利要求2所述的生物质预处理方法，其特征在于，所述预处理的条件为：温度为220℃，乙醇浓度为29.19％，时间为20min，液料比为1:35.73。
4.一种生物质制备乙醇的方法，其特征在于，包括：采用权利要求1-3任一项所述的生物质预处理方法对所述生物质进行预处理得到底物；
添加纤维素酶和纤维二糖酶所述底物进行酶解，采用同步糖化发酵或分布糖化发酵生产乙醇。
5.根据权利要求4所述的生物质制备乙醇的方法，其特征在于，所述纤维素酶的用量20～40FPU/g，所述纤维二糖酶的用量为1～7U/g。
6.根据权利要求4所述的生物质制备乙醇的方法，其特征在于，所述底物的浓度为5％～17％。
7.根据权利要求6所述的生物质制备乙醇的方法，其特征在于，所述底物的浓度为16％。
8.根据权利要求4所述的生物质制备乙醇的方法，其特征在于，所述酶解的时间为72h，所述酶解的孵化条件为50℃200rpm。
9.权利要求1-3任一项所述的生物质预处理方法在去除生物质中木质素的应用。
10.权利要求4-8任一项所述的生物质制备乙醇的方法在生物质制备乙醇中的应用。
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