CN116064454A - 一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 - Google Patents
一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116064454A CN116064454A CN202211459585.4A CN202211459585A CN116064454A CN 116064454 A CN116064454 A CN 116064454A CN 202211459585 A CN202211459585 A CN 202211459585A CN 116064454 A CN116064454 A CN 116064454A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yojk
- mutant
- glycosyltransferase
- rebaudioside
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 37
- RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N rebaudioside D Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N 0.000 claims abstract description 18
- HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N entered according to Sigma 01432 Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 claims description 6
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009510 drug design Methods 0.000 abstract 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 101100320939 Bacillus subtilis (strain 168) yojK gene Proteins 0.000 description 7
- 101100323393 Escherichia coli (strain K12) apbE gene Proteins 0.000 description 7
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 7
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 4
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 4
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000004383 Steviol glycoside Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 235000019411 steviol glycoside Nutrition 0.000 description 2
- 229930182488 steviol glycoside Natural products 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101100101356 Stevia rebaudiana UGT91D2 gene Proteins 0.000 description 1
- QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N Steviol Natural products C1CC2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C)C1C(C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N Stevioside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N steviol Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N 0.000 description 1
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 description 1
- -1 steviol glycoside compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000008144 steviol glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229940013618 stevioside Drugs 0.000 description 1
- OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N stevioside Natural products CC1(CCCC2(C)C3(C)CCC4(CC3(CCC12C)CC4=C)OC5OC(CO)C(O)C(O)C5OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C(=O)OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/20—Preparation of steroids containing heterocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体，属于生物催化合成技术领域，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK‑I241T/G327N的基础上，将第158位、第218位及第369位同时突变得到的。本发明通过理性设计确定了能够提高YojK热稳定性和活性的突变位点，通过组合突变高效地得到了组合突变体YojKM1。相比较YojKM0，该变体在50℃的半衰期由2.16h提高至58.64h，酶活提高了1.39倍；最终通过分批补料反应，表明该突变体转化率在25mmol/L Reb A条件下转化率高达87.7％，为莱鲍迪苷D的生产提供了一条高效且绿色的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体，属于生物催化合成技术领域。
背景技术
由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷A等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖250-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的回苦味严重影响它们作为甜味剂的口感。而在甜菊糖苷中含量较少的莱鲍迪苷D(Reb D)相较于莱鲍迪苷A(Reb A)和甜菊糖具有更高的甜度，并且减少了甜味之外的苦后味而因此作为甜味剂具有更好的口感，被认为是非常具有潜力的下一代甜味剂。然而，Reb D其在甜叶菊干叶中的含量仅为0.4％-0.5％，仅为Reb A含量的十分之一左右，这也使得通过传统的叶片提取Reb A的方法并不适用于Reb D的提取。繁琐且复杂的提取方法使得仅从甜叶菊叶子中提取难以实现规模化生产，也难以满足市场需求。
目前，通过酶催化方法以甜叶菊中含量较高的Reb A为底物催化合成Reb D被认为是一种可行的提高Reb D生产量的技术路线。通过相关科学家不断探索和挖掘，与以Reb A为底物合成Reb D相关的糖苷转移酶(EUGT11、UGT91D2、UGTSL2)已被挖掘和鉴定。并且通过大肠杆菌等微生物实现这些糖基转移酶的异源表达和Reb D的异源生物合成也又成功的案例，但植物来源的糖基转移酶表达量太低，限制了Reb D的生产和市场的使用。针对以上情况，我们实验室前期挖掘得到了来自枯草芽孢杆菌BS168的糖苷转移酶YojK，该酶在大肠杆菌中能够实现可溶性高效表达，并且在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)存在的情况下具有催化Reb A合成Reb D的活性。通过基于蛋白质结构的定向进化，成功获得高效突变体YojK-I241T/G327N。但是在级联反应中发现该酶热稳定性较差，很难满足工业化生产的条件。
因此，改造突变体YojK-I241T/G327N，进一步提高其酶活和热稳定性，对于工业化生产Reb D具有重要意义。
发明内容
本发明基于YojK-I241T/G327N，成功高效地得到了一种组合突变体。本发明提供一种能够高效催化Reb A生物合成Reb D的糖基转移酶突变体，进一步提高其热稳定性和催化活性，满足工业化生产的要求。
本发明以实验室前期构建的枯草芽孢杆菌BS168来源的糖基转移酶的突变体YojK-I241T/G327N(以下简称YojKM0)为模板(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，对其进行定点突变，得到突变体YojKM1。
本发明提供了一种糖基转移酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的基础上，将第158位、第218位及第369位同时突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的基础上，将第158位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第218位的丙氨酸突变为组氨酸，同时将第369位丙氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为YojKM1(或YojKM0/S158E/A218H/A369K)。
在本发明的一种实施方式中，所述糖基转移酶突变体YojKM1氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述糖基转移酶突变体YojKM1核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供了一种编码上述糖基转移酶突变体YojKM1的基因。
本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-21b(+)为表达载体。
本发明还提供了一种表达上述糖基转移酶突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
本发明还提供了一种提高糖基转移酶的热稳定性和活力的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的第158位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第218位的丙氨酸突变为组氨酸，同时将第369位丙氨酸突变为赖氨酸。
本发明还提供了一种催化合成莱鲍迪苷D的方法，所述方法为，向含有莱鲍迪苷A的反应体系中，添加所述突变体YojKM1，或所述重组细胞，反应制备得到莱鲍迪苷D。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有，1-25mmol/L莱鲍迪苷A，5-25％(v/v)DMSO，25-50mmol/L Tris-HCl缓冲液，150-300mmol/L NaCl。
在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为，40～50℃反应0～48h，不为0。
本发明还提供了采用上述糖基转移酶突变体YojKM1，或上述基因，或上述重组细胞在制备含有莱鲍迪苷D的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明提供了一种催化活性和热稳定性均提高的糖基转移酶YojKM0的突变体YojKM1，在50℃下对Reb A的催化效率为YojKM0的1.39倍，热稳定性提高了27倍。
(2)采用本发明的糖基转移酶突变体YojKM1催化合成莱鲍迪苷D，分批补料的长时间反应中，突变体的Reb A的转化率相对YojKM0提高了20％左右。
实验结果证实本发明能够促进生物合成Reb D的工业化应用，可以节省酶量，增加利用次数，降低生产成本。
附图说明
图1为YojK的SDS-PAGE结果。
图2为YojKM0以及突变体最适温度测试结果。
图3为YojKM0以及突变体半衰期测试结果。
图4为YojKM0与YojKM1分批补料测试结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所涉及的糖基转移酶YojKM0为实验室前期构建的突变体YojK-I241T/G327N(以下简称YojKM0)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其构建方法记载于公开号为CN 114164191 A的中国发明专利中。下述实施例中所涉及的pET-21b(+)-YojK及pET-21b(+)-YojK-I241T/G327N的构建方法记载于公开号为CN 114164191 A的中国发明专利中。
下述实施例中所涉及的重组质粒pET-21b(+)-YojKM0的构建方法记载于公开号为CN114164191A的中国发明专利中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB固体平板：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，20g/L琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl。
2xYT液体培养基：16g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，5/L NaCl。
下述实施例中所涉及检测方法如下：
糖基转移酶的酶活的检测：通过液相分析糖基化反应结果检测酶活。
糖基化反应在200μL反应体系中进行，反应体系如下：50mmol/L Tris-HCl pH8.0，5mmol/L UDPG，10mmol/L MnCl2，1mmol/L Reb A，糖基转移酶浓度为10μM。在35℃下反应20min。反应结束后，用等体积甲醇稀释，20000×g离心5min，0.22μM滤膜进行抽滤后进行超高效液相色谱(UPLC)进行检测分析Reb D的产量。UPLC采用waters公司BEH C181.7μM反向柱，进样量4μL，柱温40℃，流动相采用A管路：乙腈，B管路：1.38g/L NaH2PO4缓冲液(pH2.6)，流速0.3mL/min，具体程序如表1所示：
表1：UPLC分析程序
酶活定义：一分钟内反应1微摩尔Reb A所需要的YojK的酶量。
实施例1：含有糖基转移酶突变体的重组大肠杆菌的构建
1、YojKM0/S158E突变体的构建
以重组质粒pET-21b(+)-YojKM0为模板，利用设计的相应引物S158E_F和S158E_R进行全质粒PCR，(引物如表2所示)，构建携带突变体的重组质粒pET-21b(+)-YojKM0/S158E。
表2：引物名称及引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| D87I_F | aaagcctgtaagATCatcgcgactcatatttatgaggaagtca |
| D87I_R | gcgatGATcttacaggctttcaaaaaagcgca |
| V115I_F | tcgcgggtaaaATTattgccaacatgctgaagctg |
| V115I_R | gcaatAATtttacccgcgagaagatggtgat |
| S158E_F | attatgaaGAGtaccagcagcttgcagaaacg |
| S158E_R | gctggtaCTCttcataatgaggcgaatcttcaagtgatc |
| D169K_F | acgttaaatgaaAAGtttcaagcagagatcaagaagccatt |
| D169K_R | aaaCTTttcatttaacgtttctgcaagctgct |
| L199N_F | cagccaAACgctgagcaatttggcgagcg |
| L199N_R | ttgctcagcGTTtggctgaaatccccttgatgtaaag |
| A218H_F | agaaagaCATggaaacaatgatttcccatttgatcagatt |
| A218H_R | attgtttccATGtctttctgtaatggaaggaccgacaaat |
| L253F_F | aatcaatgcTTTgaagtgtgtaaggactttgacggtaaag |
| L253F_R | cacttcAAAgcattgattaaaaaactgcttttgattatt |
| T273I_F | atattaaaATTagtgagttaaacgacattccggagaat |
| T273I_R | actcactAATtttaatatgcttgccgatggaaagca |
| A369K_F | cgttcgtatAAGgaaaaggcaaaagaaattggacaatcact |
| A369K_R | cttttcCTTatacgaacgattattcattacttcttgtat |
PCR扩增体系为(50μL)：模板DNA0.1ng-1ng，2×Prime star max Buffer 25μL，突变引物上游和下游各1μL，其余用ddH2O补充至总体积。PCR反应参数：(1)95℃预变性30s；(2)95℃变性15s；(3)63℃退火15s；(4)72℃延伸35s，步骤(2)-(4)循环30次；(5)72℃彻底延伸10min，4℃保存。PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析为阳性后，使用康为GelExtraction Kit纯化得到DNA产物。
将所得质粒pET-21b(+)-YojKM0/S158E进行测序鉴定并分别转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，采用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板)进行筛选，得到含有突变体的重组菌株：E.coli BL21(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/S158E。
2、含有YojKM0/T45E、YojKM0/D87I、YojKM0/V115I、YojKM0/S158E、YojKM0/D169K、YojKM0/G204D、YojKM0/A218H、YojKM0/Q247D、YojKM0/L253F、YojKM0/T273I和YojKM0/A369K单点突变体的重组菌的构建
具体构建方法同步骤1，引物如表2所示。
分别制备得到重组菌：E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/D87I、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/V115I、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/S158E、E.coliBL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/D169K、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/L199N、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/A218H、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/L253F、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/T273I和E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0/A369K。
3、含有组合突变体的重组大肠杆菌的构建
以YojKM0为模板，先以设计的A218H相应引物进行第一步的质粒构建得到组合突变体YojKM0/S158E/A218H；
再以YojKM0/S158E/A218H为模板，以设计的A369K相应引物进行第二步的质粒构建得到组合突变体YojKM1(YojKM0/S158E/A218H/A369K)；
所述引物如表1所示，具体实施方式同步骤1。
按照上述方法制备的到含有组合突变体的重组菌：E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM1。
作为对照，按照上述方法制备得到重组菌：E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojK、E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojK-I241T/G327N(E.coli BL2l(DE3)/pET-21b(+)-YojKM0)
实施例2：YojKM0及其突变体纯酶的制备
(1)摇瓶发酵生产酶
分别将实施例1得到的基因工程菌在含氨苄青霉素(100μg/mL)LB平板上划线，37℃培养12h后，挑取单菌落接种于氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中摇瓶发酵，37℃，转速200rpm培养12h，获得种子液。
吸取5mL种子液转移到500mL氨苄青霉素(100μg/mL)2xYT液体培养基中摇瓶发酵，37℃培养至OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，降低温度到18℃，诱导产酶，培养12h后离心收集菌体。
(2)粗酶液的制备
离心收集的菌体加入适量(10倍体积)裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/LNaCl，20mmol咪唑，pH＝8)重悬菌体，高压匀浆机破碎后，4℃，20000xg离心30min收集上清液；分别制备得到粗酶液；蛋白胶图如图1所示，结果显示，糖基转移酶得到了表达。
(3)酶的纯化
将粗酶液利用Ni+柱进行亲和层析纯化，上样结束后，10倍体积裂解液冲洗杂蛋白，用洗脱缓冲液进行目的蛋白洗脱。收集洗脱的目的蛋白，通过脱盐柱(HistrpTM 5mLDesalting)进行脱盐，脱盐缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，10％甘油)。脱盐后浓缩至10mg/mL，进行后续反应，分别制备得到纯酶液。
(4)YojKM0及其突变体催化Reb A反应合成Reb D的酶活测试
将步骤(3)获得的纯化后的野生型酶YojK、YojK-I241T/G327N(YojKM0)及上述制备得到的突变体进行糖基化反应。
通过液相分析可得知突变体的相对酶活(以YojKM0为标准)，结果如表3所示。
表3：突变体的相对酶活
结果显示，突变体A218H及YojKM1的酶活最高。
实施例3：YojKM0及其突变体变性温度的测试
按照实施例2中步骤获得YojKM0和突变体的纯酶用以测试酶的变性温度。
具体步骤如下：
测试样品酶浓度为1mg/mL，缓冲液为25mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150mmol/LNaCl。测试使用Nano-DSC，基线测试区间为30-90℃，样品测试温度区间为30-80℃，温度上升速率为1min/℃。测得数据如表4所示，相较于YojKM0，突变体变性温度有所提升。
表4：相对酶活和变性温度的改变
ΔTm：与YojKM0变性温度的差值。
实施例4：YojKM0及其突变体最适温度的测试
按照实施例3中步骤获得YojKM0和突变体的纯酶用以测试酶的最适温度。
具体步骤如下：
200μL的反应体系包含25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl，10mmol/LUDPG，4mmol/L Reb A，10μM纯酶；反应温度测试区间为30～50℃；反应在反应器中进行，反应时间为20min，反应震荡转速为800rpm；
反应体系95℃加热10min确定为反应终止，产物测定按照上文提及的检测方法进行即可。
结果如图2所示，结果显示，YojKM0的最适温度为45℃，而单点突变YojKM0/A218H与YojKM0/A369K的最适温度提高了5℃，为50℃；
而YojKM0/S158E与YojKM1的最适温度相较于YojKM0提高了10℃，均为55℃。结果表明最终得到的突变体明显提高了该酶的热稳定性。
实施例5：YojKM0及其突变体半衰期的测试
按照实施例3中步骤获得YojKM0和突变体的纯酶用以测试酶的半衰期。
具体步骤如下：
YojKM0与突变体均在25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150mmol/L NaCl缓冲液中，酶浓度为1mg/mL，样品在50℃条件下孵育相应的时间，之后取出20μL孵育后的酶液加入到含有25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl，10mmol/L UDPG，4mmol/L Reb A的180μL的体系中反应，反应温度为35℃，反应时间为20min。反应终止和产物测定均以实施例4为准。反应结果如图3所示。
结果显示突变体半衰期明显变长，YojKM0的半衰期为2.16h，YojKM1的半衰期为58.64h，突变后的YojKM1的半衰期与YojKM0的半衰期相比，提高了27.15倍。
实施例6：YojKM0与YojKM1分批补料制备Reb D
按照实施例3中步骤获得YojKM0和突变体的纯酶用以测试酶在分批补料反应中的实际效果，具体步骤如下：
(1)向含有25mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl缓冲液中，添加YojKM0酶，纯酶酶浓度为500mg/L，得到反应体系，反应温度为45℃，分别在0h、1h、2h、4h和6h的时间点加入5mmol/L Reb A、10mmol/L UDPG。
反应终止：反应体系95℃加热10min确定为反应终止。
挑取1,2,3,4,6,8,10和12h时间段测定底物与产物含量并计算其产率。结果如图4所示。
(2)向含有25mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl缓冲液中，分别添加突变体酶，纯酶酶浓度为500mg/L，得到反应体系，反应温度为50℃，分别在0h、1h、2h、4h和6h的时间点加入5mmol/L Reb A、10mmol/L UDPG。
反应终止：反应体系95℃加热10min确定为反应终止。
挑取1,2,3,4,6,8,10和12h时间段测定底物与产物含量并计算其产率。结果如图4所示。
结果显示，在分批共计投入25mM Reb A后，YojKM1与YojKM0相比，转化率提高了23.7％，达到了87.7％，产量为23.73mg/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的基础上，将第158位、第218位及第369位同时突变得到的。
2.如权利要求1所述的糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的基础上，将第158位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第218位的丙氨酸突变为组氨酸，同时将第369位丙氨酸突变为赖氨酸得到的。
3.编码权利要求1或2所述糖基转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述的基因的重组载体。
5.表达权利要求1或2所述的糖基转移酶突变体、或含有权利要求3所述的基因、或含有权利要求4所述的重组载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种提高糖基转移酶的热稳定性和活力的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶YojK-I241T/G327N的第158位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第218位的丙氨酸突变为组氨酸，同时将第369位丙氨酸突变为赖氨酸。
8.一种催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于，所述方法为，向含有莱鲍迪苷A的反应体系中，添加权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述重组细胞，反应制备得到莱鲍迪苷D。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中含有，1～25mmol/L莱鲍迪苷A，5～25％(v/v)DMSO，25～50mmol/L Tris-HCl缓冲液，150～300mmol/L NaCl。
10.权利要求1或2所述的糖基转移酶突变体、或权利要求3所述的基因、或权利要求5或6所述的重组细胞在制备含有莱鲍迪苷D的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211459585.4A CN116064454A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211459585.4A CN116064454A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116064454A true CN116064454A (zh) | 2023-05-05 |
Family
ID=86169028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211459585.4A Pending CN116064454A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116064454A (zh) |
-
2022
- 2022-11-16 CN CN202211459585.4A patent/CN116064454A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109750072B (zh) | 一种酶法制备莱鲍迪苷e的方法 | |
| CN104726523B (zh) | 一种酶法制备莱鲍迪苷m的方法 | |
| CN111518782B (zh) | 一种糖基转移酶ugtzj1突变体及其应用 | |
| EP2963122B1 (en) | Method for preparing rebaudioside a from stevioside | |
| CN112375750B (zh) | 一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷a的方法 | |
| EP4365285A1 (en) | Glycosyltransferase mutant and method for catalytic synthesis of rebaudioside m by means of using same | |
| US11976313B2 (en) | Enzymatic method for preparing rebaudioside N | |
| WO2023087518A1 (zh) | 一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷d的方法 | |
| CN112063678A (zh) | 一种Siamenoside I的生物合成方法 | |
| CN113862319A (zh) | 人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用 | |
| CN111154748B (zh) | 一种提高l-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体 | |
| CN114574460B (zh) | 一种利用糖基转移酶ugt76g1突变体高效生物合成莱鲍迪苷m的方法 | |
| CN116064454A (zh) | 一种热稳定性和活力提高的糖基转移酶突变体 | |
| EP4349989A1 (en) | Glycosyltransferase and application thereof | |
| CN115404226B (zh) | 一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用 | |
| CN115418358B (zh) | 一种糖基转移酶及其应用 | |
| CN116286770B (zh) | 一种来自梭状菌属的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其应用 | |
| CN118222532A (zh) | 一种利用糖基转移酶ugt94e13突变体高效生物合成莱鲍迪苷m8的方法 | |
| CN115478060B (zh) | 一种糖基转移酶及其应用 | |
| CN116286712B (zh) | 鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 | |
| CN116463311A (zh) | 一种糖基转移酶突变体及其应用 | |
| CN106367458A (zh) | 重组蔗糖磷酸化酶在制备功能性低聚糖中的应用 | |
| CN115786223A (zh) | 一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用 | |
| CN116004417A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN116555240A (zh) | 一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240520 Address after: No.19, Renmin South Road, Lingui District, Guilin City, Guangxi Zhuang Autonomous Region Applicant after: GUILIN LAYN NATURAL INGREDIENTS Corp. Country or region after: China Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Applicant before: Jiangnan University Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |