CN116059357A - 一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及纳米给药系统技术领域，具体涉及一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂及其制备方法与应用。本发明先将奥沙利铂(OXA)氧化成OXA‑COOH，继而将其与DA进行反应，生成OXA‑DA聚合物，然后利用OXA‑DA聚合物制备多孔纳米粒，并在该纳米粒的孔内附载靶向PD‑L1蛋白的siRNA(siPD‑L1)，最后在该纳米复合体系表面修饰PEOz，进而构建得到pH响应电荷翻转的纳米复合制剂。该纳米复合制剂具有pH响应的电荷翻转效应，可同时实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效应，增强恶性肿瘤的治疗效果，该纳米复合制剂有望发展作为一种新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及纳米给药系统技术领域，具体涉及一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术
奥沙利铂(Oxaliplatin)属于二价铂类抗肿瘤药物，其适应症广，抗肿瘤效果良好，已被广泛应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。但是奥沙利铂的靶向性差，且有强烈的剂量限制性毒性，导致其临床应用受到了严重限制。因此，为了提高奥沙利铂在肿瘤治疗过程中的用药安全性，研究者们构建了一系列奥沙利铂前药纳米递药系统，有效的改善了奥沙利铂药物的靶器官分布特性，提高了其疗效并降低毒副作用。比如，有研究构建了二元协同的奥沙利铂前药纳米载药系统(BCPN)，该BCPN由两亲性奥沙利铂前药和NLG919的同源二聚体共同构成，BCPN具有pH/酶双重响应特性，在肿瘤组织中能够顺利释放奥沙利铂和NLG919，从而增强肿瘤化疗/免疫治疗效果。而且，该BCPN可高效蓄积到肿瘤组织，诱导肿瘤细胞发生ICD效应并克服IDO-1酶引起的免疫抑制，从而有效抑制乳腺癌的增长和肺部转移。然而，二价铂类(II)药物对肿瘤组织具有低选择性，而四价铂类(IV)前药设计是提高二价铂类(II)药物对肿瘤组织低选择性的一种非常有前景的方法，有利于减少对健康组织的影响，从而降低严重的副作用。
多巴胺(DoDAmine，DA)是一种儿茶酚胺类生物神经递质，对帕金森氏病及阿尔茨海默氏症具有良好的治疗效果。2007年，科学杂志报道了一种基于贻贝仿生学的材料表面修饰方法，发现贻贝之所以能够粘附在几乎所有材料表面是因为其自身分泌能够大量具有左旋多巴结构的黏液蛋白，而在左旋多巴中真正起作用的是氨基和邻苯二酚基团，它们在基质表面协同形成极强的共价与非共价键，从而能够有效的吸附在基质表面。受此启发，研究者以多巴胺分子为单体，制备了一种能够快速吸附于材料表面的聚合物，即聚多巴胺(PolydoDAmine，PDA)。PDA结构中含有邻苯二酚结构和胺基官能团，对胺和硫醇基团具有潜在的反应性，通过亲核试剂和聚多巴胺表面之间的反应将生物分子共价固定在其表面，可以实现材料表面的功能化。由于PDA具有很强的近红外吸收率，在808nm的NIR激光照射下，PDA可将能量转换为热量，以增加肿瘤区域的温度并杀死癌细胞，因此PDA已被用作光热疗法研究中的有效PTC剂。除此以外，PDA还具有良好的生物相容性，可以在酸性条件下缓慢溶解，使其成为pH值控制的药物递送平台的理想材料。但是受限于PDA较小的比表面积，PDA在生物医药领域中的应用主要集中在肿瘤光热治疗领域。直到2017年研究人员首次报道了介孔聚多巴胺纳米粒作为药物递送载体，才进一步拓展了PDA在生物医药领域中的应用范围。介孔聚多巴胺纳米粒除了具有与常规多巴胺纳米粒相同的一些性质外，还具有较高的药物负载性能。因而，在随后几年的发展里，多巴胺纳米粒、多巴胺纳米空心胶囊等也被陆续报道出来。虽然如此，目前以介孔多巴胺纳米粒作为药物载体的报道仍然较少，而由于介孔聚多巴胺纳米粒既具备了介孔硅材料的结构特性，又具有聚合物多样化的可修饰性和功能性，再加上聚多巴胺自身优异的光学、电学性质，其在肿瘤治疗领域是具有巨大的应用前景和研究意义的。
在纳米给药系统治疗恶性肿瘤的应用过程中，表面电荷扮演了非常重要的角色。因此，电荷翻转型纳米给药系统在恶性肿瘤治疗中受到了广泛关注。纳米给药系统治疗的不同阶段，其最适合的表面电荷也是不同的，例如在血液循环中，纳米给药系统的表面宜带负电荷，这样不易与带负电的蛋白组分发生反应，从而减少被内皮网状系统清除的概率，提高纳米给药系统的机体稳定性，进而实现长效循环；在接近肿瘤组织时，表面带正电荷的纳米给药系统能够促进肿瘤细胞的胞吞作用，进而使纳米给药系统深入渗透到肿瘤组织的深部；在大面积地接触肿瘤细胞后，表面荷正电的纳米给药系统又能迅速被荷负电的肿瘤细胞所摄取，并能在进入溶酶体后通过“质子海绵效应”进行逃逸，从而将纳米给药系统释放到细胞质，发挥治疗作用。因此，在恶性肿瘤的治疗过程中，如果纳米给药系统能在血液循环中表面带负电，而到达肿瘤部位后能够响应性发生电荷翻转，表面带正电荷，则有利于提高纳米给药系统的机体稳定性，并促进其被肿瘤细胞摄取，进而有利于发挥药物的最佳治疗效果。现阶段对于电荷翻转型纳米给药系统研究的重点主要在于通过研究肿瘤微环境和血液环境的不同，设计能够响应环境改变而产生电荷翻转效果的物质对纳米给药系统进行表面改性，从而实现在肿瘤部位发生电荷翻转的目的。针对肿瘤微环境弱酸性、乏氧、含有特殊酶等特点，目前已有研究报道了多种响应性电荷翻转的纳米给药系统和pH响应性电荷翻转的纳米给药系统在恶性肿瘤治疗中的应用。众所周知，血液和正常组织的pH值约为7.4，而肿瘤微环境的pH值约为6.5，因此如果纳米给药系统表面修饰的物质带有能够随着环境pH值降低而质子化的化学基团(如咪唑、氨基等)，就可能实现纳米给药系统在进入pH较低的肿瘤环境时，发生电荷翻转，致使纳米给药系统表面电荷产生由负变正的转变。
聚-(2-乙基-2-噁唑啉)[Poly(2-ethyl-2-oxazoline)，PEOz]是一种生物相容性较好的亲水性长链聚合物，PEOz的主链中具有叔酰胺基团，因而具有接近于生理环境pH值的pKa值，且其pKa值可以通过改变其聚合度来进行调节。在pH 7.4的介质中PEOz带负电荷，而在pH 6.5的肿瘤微环境中，pH低于PEOz的pKa，致使其主链叔氨基发生质子化；同时，其侧链中的羰基与H+结合而发生电子发生转移，使链中的氮原子离子化，进而使主链带正电荷。细胞内溶酶体的pH值进一步降低，约为5.5左右，PEOz可以在其中进一步质子化，通过“质子海绵效应”涨破溶酶体，进而帮助纳米给药系统实现溶酶体逃逸。
使用检查点抑制剂是免疫疗法治疗肿瘤的重要手段之一，机体依赖多个检查点来避免免疫系统攻击健康细胞，免疫检查点蛋白能够抑制体内免疫反应的过度激活，而在肿瘤细胞中免疫检查点蛋白过度表达，从而逃避免疫系统的监视。因此，通过使免疫检查点抑制剂与免疫细胞表面或肿瘤细胞表面的免疫检查点蛋白相结合，可以增强机体自身的免疫应答。同时，程序性死亡分子1(Programmed death 1，PD-1)是CD28-B7受体家族的新成员，在调节免疫反应的过程中发挥着重要的作用，其配体PD-L1/PD-L2广泛分布于肿瘤细胞表面，是肿瘤治疗中应用最广泛的免疫检查点蛋白。有研究表明PD-1/PD-L1信号通路的激活能够诱导免疫抑制性肿瘤微环境的形成，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和杀伤。而阻断PD-1/PD-L1信号通路，可以逆转免疫抑制性肿瘤微环境，增强内源性抗肿瘤效应。
综上所述可见，开发一种具有多重功能且生物可降解的纳米复合制剂，在恶性肿瘤治疗领域具有巨大的潜在应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂，该纳米复合制剂具有良好的光热效应、生物可降解性和溶酶体逃逸效应等特点，可靶向肿瘤细胞PD-L1受体，特异性抑制PD-L1蛋白的表达，具有免疫抗肿瘤效应，有望广泛应用到恶性肿瘤的治疗领域。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面提供了一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、将奥沙利铂溶于水中，再加入H2O2溶液，35-45℃避光反应20-30h，经双氧水氧化得到化合物OXA-OH(IV)；
S2、将OXA-OH(IV)和丁二酸酐同时溶于有机溶剂中，反应至溶液呈澄清状态，经丁二酸酐氧化得到OXA-COOH(IV)化合物；
S3、将EDC、NHS和OXA-COOH(IV)同时溶于盐酸溶液中，反应10-20min后再加入DA，并调节pH至7.0-7.5，继续反应2-30h后干燥收集样品即得OXA-DA(IV)化合物；
S4、将F127和TMB溶液加入到有机溶剂中，反应25-35min后再加入DA、OXA-DA和Tris缓冲液，室温反应8-12h，制得OXA-DA纳米粒；
S5、将OXA-DA NPs和盐酸胍溶液分散于有机溶剂中，再加入siPD-L1，经离心处理后即得OXA-DA-siPD-L1 NPs；
S6、将OXA-DA-siPD-L1 NPs分散于Tris缓冲液中，再加入多巴胺，避光反应2-3h后即得OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs；
S7、将OXA-DA-siPD-L1@PDA NP和PEOz-NH2分散于Tris缓冲液中，室温反应10-15h后得到OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs。
本发明构建了一种pH响应性电荷翻转的奥沙利铂前药(IV)复合纳米递药系统，同时联合光热/免疫疗法协同治疗恶性肿瘤。首先，本发明合成了多巴胺修饰的奥沙利铂前药(IV)(OXA-DA)，提高了奥沙利铂在循环系统中的稳定性，改变其在机体组织中的分布特性并减少毒副作用。其次，利用OXA-DA前药作为载体制备多孔纳米颗粒，用于siPD-L1的靶向递送。一方面，多巴胺修饰奥沙利铂后，即保留了多巴胺的光热性能，同时也提高了奥沙利铂的机体稳定性；另一方面，在奥沙利铂-多巴胺纳米体系中载入siPD-L1，可以特异性沉默肿瘤细胞中的PD-L1蛋白，阻断PD-1/PD-L1信号通路，进而增强内源性免疫抗肿瘤效应，实现化疗/光热/免疫疗法协同抗肿瘤作用。以外，为了增强奥沙利铂前药复合纳米递药系统在肿瘤细胞中的摄取效率，在该复合纳米体系表面修饰PEOz，致使该复合纳米体系在pH7.4的生理条件下表面带负电荷，进而减少其被内皮网状系统清除的概率，提高复合纳米体系的体内稳定性，从而实现长循环效应。而在pH较低的肿瘤微环境中，PEOz主链中的叔氨基发生质子化，进而使复合纳米体系表面带正电荷，增强肿瘤细胞的摄取效率，进入肿瘤细胞后，PEOz主链中的叔氨基进一步质子化，产生“质子海绵效应”，帮助复合纳米体系逃离溶酶体，进而增加siPD-L1的生物利用度。PEOz修饰的奥沙利铂前药复合纳米递药系统可同时实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效应，增强恶性肿瘤的治疗效果，因此，该复合纳米给药系统有望发展作为新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。PEOz修饰的奥沙利铂前药复合纳米递药系统在体内作用的模拟过程如图1所示。
优选地，步骤S1中，奥沙利铂在水中的浓度为0.3-1g/100mL，奥沙利铂水溶液与H2O2溶液的体积比为100:1-3。
优选地，步骤S2中，OXA-OH(IV)与丁二酸酐的质量比为3-5:1，OXA-OH(IV)在有机溶剂中的浓度为0.5-5mM。
优选地，步骤S3中，EDC、NHS、OXA-COOH(IV)与DA的质量比为(70-130):(100-200):(70-130):(70-130)，OXA-COOH(IV)在盐酸溶液中的浓度为90-110mg/100mL。
优选地，步骤S4中，F127、DA、OXA-DA和Tris缓冲液的质量比为(0.3-0.4):(50-60):(5-7):(80-10)，F127在有机溶剂中的浓度为0.3-0.4g/120mL，TMB溶液与有机溶剂的体积比为0.4-0.6:120。
优选地，步骤S5中，OXA-DA NPs在有机溶剂中的浓度为1-3mg/267μL，盐酸胍溶液的浓度为38.4％，盐酸胍溶液与有机溶剂的体积比为60-70:267，siPD-L1使用前先用DEPC水处理成5nM的浓度，siPD-L1溶液与盐酸胍溶液的体积比为1:1。
优选地，步骤S5中，所述离心为先150-250rpm/min低速离心40-50min，再7000-9000rpm/min离心4-7min。
优选地，步骤S5中，所述siPD-L1的结构为GAGGTAATCTGGACAAACA。
优选地，步骤S6中，OXA-DA-siPD-L1 NPs在Tris缓冲液中的浓度为2mg/mL，OXA-DA-siPD-L1 NPs与多巴胺的比例为4：3。
优选地，步骤S7中，OXA-DA-siPD-L1@PDA NP在Tris缓冲液中的浓度为0.5mg/mL，OXA-DA-siPD-L1@PDA NP与PEOz-NH2的比例5：1。
本发明第二方面提供了第一方面所述的制备方法制备得到的pH响应电荷翻转的纳米复合制剂。
本发明第三方面提供了第二方面所述的pH响应电荷翻转的纳米复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明制备的PEOz修饰的奥沙利铂前药纳米复合递药系统具有pH响应的电荷翻转效应，可同时实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效应，增强恶性肿瘤的治疗效果，该纳米复合制剂有望发展作为一种新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。
优选地，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。更优选地，所述肿瘤包括但不限于由4T1肿瘤细胞引起的乳腺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，先将奥沙利铂(OXA)氧化成OXA-COOH，继而将其与多巴胺(DA)进行反应，生成OXA-DA聚合物，然后利用OXA-DA聚合物制备多孔纳米粒，并在该纳米粒的孔内附载靶向PD-L1蛋白的siRNA(siPD-L1)，最后在该纳米复合体系表面修饰PEOz，进而构建得到pH响应电荷翻转的纳米复合制剂。本发明具有以下优点：
(1)本发明以OXA-DA为基本骨架，将奥沙利铂通过化学键与多巴胺连接，合成了多巴胺修饰的奥沙利铂前药，并将二价奥沙利铂转化成四价奥沙利铂前药，再利用OXA-DA制备复合纳米体系，将奥沙利铂通过酰胺键镶嵌于体系内部，进而增强奥沙利铂循环过程中的稳定性，改善奥沙利铂在机体内的组织分布情况，减少毒副作用。
(2)本发明的纳米复合制剂OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz中，首次以OXA-DA作为核酸药物递送载体，在孔内引入了siPD-L1。
(3)本发明的纳米复合制剂OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz中，在OXA-DA/siPD-L1@PDA纳米体系表面修饰PEOz后，其在肿瘤微环境pH偏低的条件下可以实现电荷翻转，使复合纳米体系荷正电，从而增强复合纳米体系被肿瘤细胞摄取的效率，并在肿瘤细胞内实现溶酶体逃逸效应，提高siPD-L1的生物利用度。
(4)本发明的纳米复合制剂OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz，因为多巴胺的光热特性而具有良好的光热效应。
(5)本发明的纳米复合制剂OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEO还具有良好的生物可降解效应，不仅可以实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效果，而且毒副作用较小，具有良好的应用前景。
综上可见，本发明制备的PEOz修饰的奥沙利铂前药复合纳米递药系统可同时实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效应，增强恶性肿瘤的治疗效果，有望发展作为新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。
附图说明
图1为PEOz修饰的奥沙利铂前药复合纳米递药系统体内作用的模拟过程；
图2为OXA(II)、OXA-COOH和OXA-DA的1H-NMR氢谱图；
图3为奥沙利铂前药复合纳米递药系统的理化性质(A为透射电镜观察三组纳米体系表面形态；B为OXA在不同条件下的累计释放度；C为凝胶电泳法检测各组纳米体系对siPD-L1的包载情况；D为WB法检测不同纳米粒对4T1细胞中PD-L1蛋白的抑制情况)；
图4为奥沙利铂前药复合纳米体系的体外光热性能(A为不同纳米给药体系的光热升温情况；B为复合纳米体系在不同浓度下的光热升温情况；C为复合纳米体系在不同激光功率密度下的光热升温情况；D为复合纳米体系光热转换效率)；
图5为两种复合纳米递药系统OXA-DA-DiO@PDA-PEG和OXA-DA-DiO@PDA-PEOz在不同pH条件下被4T1肿瘤细胞的摄取情况(A)以及Zeta电位的变化情况(B)。
图6为在pH7.4或pH5.5时，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs的溶酶体逃逸效应；
图7为不同类型纳米粒在pH7.4、pH5.5和pH5.5+NIR条件下放置3天或7天后的降解特性；
图8为(A)不同类型NPs浓度的4T1细胞的相对细胞活力；(B)不同类型处理24小时和48小时的4T1细胞的相对细胞活力；数据是平均值±SD，n＝3；*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；(C)在10μgmL-1的OXA浓度下不同类型处理后的钙黄绿素/PI细胞活性和细胞毒性检测。
图9为(A)不同纳米粒组治疗后肿瘤体积的变化；(B)不同纳米粒治疗后小鼠体重的变化；数据是平均值±SD，n＝5；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；(C)给药结束后剥离肿瘤组织观察各组荷瘤小鼠肿瘤大小；(D)肿瘤重量；(E)肿瘤组织的Ki-67，TUNEL和H&E染色；
图10为复合纳米粒子的体内光热效应评估结果；
图11为复合纳米粒子的温度生长曲线随时间的变化情况；
图12为免疫组化测定法测定各组小鼠肿瘤组织中PD-L1，IFN-γ和CD8+T细胞密度和表达量；
图13为ELISA法检测不同纳米粒组治疗后典型促炎细胞因子TNF-α和IL-10的变化情况(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；
图14为H&E染色法对复合纳米系统体内安全性的评价结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1奥沙利铂前药纳米复合制剂的制备
1、奥沙利铂前药OXA-DA的合成与表征
(1)精确称量奥沙利铂0.5g加入到100mL去离子水中，超声溶解后再加入1mL H2O2溶液，40℃水浴避光反应24h。蒸发除去水分，将残留物溶于50mL蒸馏水中，过滤，收集沉淀结晶，蒸馏水洗涤数次后得到化合物OXA-OH(IV)。
(2)将0.4g OXA-OH(IV)(1mM)和0.1g丁二酸酐同时加到40mLDMSO溶液中，室温缓慢搅拌反应16h，反应完全后，溶液呈澄清状态。透析除去DMSO溶液，并冷冻干燥除去水分，得OXA-COOH(IV)化合物。
(3)将100mg EDC、150mg NHS和100mg OXA-COOH(IV)同时加到10mL盐酸溶液(pH5.3)中，室温反应15min后再加入100mg DA，并用0.1M NaOH溶液调节pH至7.4，继续反应24h，冻干收集样品，即得OXA-DA(IV)化合物。步骤(1)、(2)和(3)的反应式如下列所示：
OXA(II)、OXA-COOH(IV)和OXA-DA(IV)在DMSO中的1H-NMR谱如图2所示。溶剂DMSO和D2O(氘代水)的化学位移分别为2.5和3.3ppm。此外，OXA(II)在5.34ppm(br，2H)和6.10ppm(br，2H)两个特征峰来源于环己烷上的-NH2。在OXA(IV)-COOH 1H-NMR核磁图谱中，这两个特征峰向下场移动至6.9 -8.6ppm(br，4H)。OXA(II)和OXA(IV)-COOH化合物中环己烷的质子峰均在0.7～2.2ppm(m，10H)之间。此外，在2.2～2.4ppm处是丁二酸特征峰(-CH2-)，证实了OXA(IV)-COOH化合物的成功合成。而在OXA-DA共聚物的1H-NMR谱图中，OXA特征峰和多巴胺特征峰分别位于6.9～8.6ppm(br，4H)和6.5～6.8ppm处，表明OXA-DA化合物的成功合成。
2、纳米复合制剂的制备与表征
(1)精密称取F127 0.36g加入到120mL无水乙醇/水混合液(1：1，v:v)中，再加入500μL TMB溶液，室温反应30min后加入54mg DA、6mg OXA-DA和90mg Tris缓冲液(pH8.0)，0.1M NAOH溶液调pH8.0，室温反应过夜11000rps/min离心5min，乙醇/丙酮混合液(v/v＝2:1)洗涤三次，得OXA-DA纳米粒(即OXA-DA NPs)。
(2)精密称量2mg OXA-DA NPs分散于267μL无水乙醇溶液中，再加入67μL盐酸胍溶液(38.4％，wt)，超声处理10min，使混合物分散均匀。然后加入67μL DEPC水处理的siRNA(siPD-L1，5nM,GAGGTAATCTGGACAAACA)，200rpm/min低速离心45min后，再8000rpm/min离心5min，收集纳米粒，即得OXA-DA-siPD-L1 NPs。
(3)精确称量2mg OXA-DA-siPD-L1 NPs分散于1mL Tris缓冲液(pH 8.0，10mM)溶液中，然后加150mg/mL的多巴胺水溶液10μL，室温避光反应2.5h，8000rpm/min离心5min，超纯水洗涤2-3次，即得OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs。
(4)将5mg OXA-DA-siPD-L1@PDA NP分散于10mL Tris缓冲液(pH 8.5，10mM)中，再加入1mg PEOz-NH2，室温反应12h后，12000rpm/min离心10min，除去上清液，超纯水重复洗涤3次，冻干，即得OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NP(奥沙利铂前药纳米复合制剂)。此外，用相同方法制备OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs作为对照。
另外，用相同方法(用DiO替换siPD-L1)制备OXA-DA-DiO@PDA-PEG NPs和OXA-DA-DiO@PDA-PEOz NPs，以便于后续通过荧光模拟纳米复合制剂的作用过程。
实验例1奥沙利铂前药纳米复合制剂的理化性能测试
(1)对OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs进行理化性能测试。包括表面形态、奥沙利铂包封率和载药量、不同条件下奥沙利铂累计释放度，siRNA包封情况等。
(2)用DMEM(含10％FBS)体外培养4T1肿瘤细胞于37℃，5％ CO2环境的培养箱中，待细胞长势良好时，以5×104/孔密度接种于12孔板内，培养过夜，然后加入100μL PBS、裸siRNA、OXA-DA-N.CsiRNA@PDA-PEOz NPs、OXA-DA-siPD-L1@PEG NPs、OXA-DA-siPD-L1@PEOzNPs和OXA-DA-siPD-L1@PEOz NPs+RNase A，共孵育72h后，收集蛋白，WB法检测PD-L1蛋白的沉默情况。
(3)实验结果：
通过TEM对OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的表面形态进行观察，观察结果如图3所示。其中，图3A为表面未经修饰的OXA-DA纳米体系，可以观察到其表面具有清晰的孔道结构，分布较为均匀，粒径大约为200nm左右；OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG复合纳米体系在经过PEG层包覆之后，可以观察到表面形成了明显的高分子状包覆层，孔道结构也变得没那么清晰，粒径稍有增大，约为220nm左右，这可以推测PEG的成功包覆；OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系经过PEOz修饰后，也可以观察到表面具有一层包覆层，粒径约为220nm，可以推测PEOz的成功修饰。
在pH＝7.4或者pH＝5.5，以及给予/不给予808nm近红外光照的条件下对OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系中OXA药物的持续释放及光控释放性能进行评估。实验结果如图3B所示，当不给予光照时，pH 5.5的介质中持续释放24h后，OXA的累积释放率为50％，而pH7.4的介质中仅为28.88％，这可能是由于PDA在弱酸环境下响应性降解所导致的，同时也反映出PDA层具有良好的酸响应释放药物的性能，因而能够在中性pH环境中较好地保护药物，减少提前泄露。当处于pH 5.5的介质中，并且于取样的时间节点给予808nm近红外光照时，可以观察到，持续释放药物24h后药物累积释放率达到82.2％，相较于没有进行光照时有较大幅度的提升。这是由于光热作用所致的温度升高加速了PDA在酸性环境中的降解所致的，并且提示该纳米给药体系在治疗过程中可以根据患者的不同需求，通过体外近红外光照控制药物的增量释放，以产生更好的治疗效果。
通过凝胶电泳实验检测OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系包载siPD-L1的情况。实验结果如图3C所示，在OXA-DA-siPD-L1组，能够观察到清晰的白色条带，说明该组纳米体系包载的siPD-L1有泄漏现象，而OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs组均看不到白色条带，说明这三组纳米体系包载siPD-L1良好。
Western印迹(WB)实验的结果如图3D所示，可以看出，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEGNPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs均不同程度地抑制肿瘤细胞中的PD-L1蛋白的表达，在pH5.5时，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz对PD-L1蛋白表达的抑制作用进一步增强。这可能是由于在稍微酸性的环境中，PEOz修饰的纳米系统更容易被肿瘤细胞摄取，具有溶酶体逃逸效应，从而改善了siPD-L1的生物利用度。
实验例2 奥沙利铂前药纳米复合制剂的光热效应性能研究
(1)将实施例1制备的三种复合纳米体系(OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs)配成浓度为100μg·mL-1的水分散液，分别取200μL加入三个到微量离心管中，另取一个微量离心管加入等量去离子水作为对照组。使用固定光纤耦合连续半导体二极管激光器作为808nm近红外光激光光源分别给予10min的辐照，控制辐照激光功率密度为1.0W·cm-2。并采用近红外光热照相仪，每30s采集光热图像，记录溶液区域最高温度，绘制温度变化曲线。
(2)采用同样方法于激光功率密度为1.0W·cm-2的近红外光下照射下分别测定50μg·mL-1、100μg·mL-1、150μg·mL-1和200μg·mL-1不同浓度的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOzNPs复合纳米体系水分散液10min，绘制升温曲线图。同时，分别在激光功率密度为0.5W·cm-2、1.0W·cm-2、1.5W·cm-2和2.0W·cm-2的近红外光照射下测定浓度为100μg·mL-1的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs的水分散液的光热曲线。
(3)实验结果：
采用808nm近红外光辐照，观察复合纳米给药系统的光热性能，研究结果如图4所示。其中，图4A为浓度为100μg·mL-1的OXA-DA、OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs在激光功率密度为1.0W·cm-2的近红外光辐照下10min的温度变化情况，并以超纯水作为空白对照。可以看出，在进行了PDA层的包覆后，OXA-DA-siPD-L1@PDA纳米体系的温度升高至为21.8℃，与OXA-DA纳米体系在同样条件下的温度相当，高于超纯水组，可以证明，PDA的包覆赋予了该复合纳米递药系统较好的光热性质。在经过不具有光热性质的PEG修饰后，同样光照条件下OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG纳米体系升温16.5℃，与PEOz修饰的纳米体系相近，但仍然足以满足通过光热效应对肿瘤进行杀伤的要求。图4B和图4C分别为在激光功率密度为1.0W·cm-2的近红外光照射下不同浓度OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz纳米体系的升温情况，以及复合纳米体系在不同激光功率密度照射下的升温情况，通过计算得到复合纳米体系的光热转换效率为32.67％(图4D)。由此可见，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的升温情况与浓度及激光功率密度有着密切的关系，这表明在临床应用的过程中，可以通过对纳米给药系统浓度以及外部激光功率密度的控制，从而精确控制治疗所需的温度，进而在保障患者肿瘤治疗效果的同时，将对正常组织的伤害降到最低。
实验例3奥沙利铂前药纳米复合制剂的摄取能力评价
(1)奥沙利铂前药复合纳米递药系统的细胞摄取实验：用DMEM高糖培养液于37℃，5％CO2的培养箱中对4T1肿瘤细胞(5×104/孔密度)与100μLOXA-DA-DiO@PDA-PEOz NPs进行体外共孵育12h，同时建立pH 7.4和pH 5.5两种pH条件下的对比。共孵育6h后，用DAPI对细胞核进行染色以确定细胞位置，并用激光共聚焦显微镜观察DAPI荧光和DiO荧光的定位情况。
(2)奥沙利铂前药复合纳米递药系统摄取机制研究：在12孔平板中接种4T1肿瘤细胞，密度为5×104/孔，培养过夜。为了探讨OXA-DA-DiO@PDA-PEOz复合纳米体系在肿瘤细胞内的转运机制，在转染前，分别用甲基环糊精、5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利、氯丙嗪和染料木素处理肿瘤细胞，并采用流式细胞仪测定4T1肿瘤细胞对复合纳米体系的摄取效率，并以未经处理的细胞作为对照组。
(3)实验结果：
将荧光物质DiO包载于OXA-DA-DiO@PDA-PEOz复合纳米体系中，用于检测奥沙利铂前药复合纳米体系被肿瘤细胞摄取情况，由于该复合纳米体系表面修饰了PEOz，其能够在体内弱酸性环境下发生电荷翻转，即纳米体系由荷负电转化成荷正电，且随着pH值的进一步降低，质子化程度也会进一步增加，表面所带的正电荷也就越多，因此，在不同pH介质中，奥沙利铂前药复合纳米体系被肿瘤细胞摄取情况不同。
体外细胞摄取实验是通过将细胞和纳米给药系统在不同的pH条件下共孵育后，用激光共聚焦显微镜确定纳米给药系统和细胞核荧光染色的定位来进行评价的，细胞核采用DAPI荧光进行染色定位，OXA-DA-DiO@PDA-PEG和OXA-DA-DiO@PDA-PEOz复合纳米体系则是依靠DiO产生的红色荧光来进行定位，实验结果如图5A所示，相较于在pH7.4的环境以及OXA-DA-DiO@PDA-PEG组，在pH 5.5的环境下，OXA-DA-DiO@PDA-PEOz组的红色荧光最强，且环绕在细胞核蓝色荧光周围，这表明经过与肿瘤细胞共孵育后，OXA-DA-DiO@PDA-PEOz复合纳米体系在pH5.5的弱酸环境中电荷翻转所产生的表面正电荷能够很好的介导肿瘤细胞的摄取，从而增强纳米给药系统被肿瘤细胞摄取效率。
此外，两种复合纳米体系OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz在不同pH下的电荷翻转情况如图5B所示。可以看出，在pH7.4介质中，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的表面电荷分别是-38.37mV和-19.17mV，两种复合纳米体系在pH 7.4条件下均荷负电。但在pH 5.5介质中，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG纳米体系表面电荷为-23.07mV，而OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz纳米体系表面电荷为+13.59mV，这是由于在奥沙利铂前药复合纳米体系表面修饰的PEOz在pH较低的环境中发生了质子化所致的。
实验例4奥沙利铂前药纳米复合制剂的溶酶体逃逸能力研究
(1)将实施例1制备的OXA-DA-DiO@PDA-PEG NPs和OXA-DA-DiO@PDA-PEOz NPs，分别与4T1肿瘤细胞共孵育6小时。为了确定OXA-DA-DiO@PDA-PEOz纳米粒的溶酶体逃逸效应，将4T1肿瘤细胞的溶酶体用LysoTracker染料染色，并使用CLSM观察LysoTracker和纳米粒荧光的定位。
(2)实验结果：
通过用OXA-DA-DiO@PDA-PEG或OXA-DA-DiO@PDA-PEOz处理4T1细胞来检测纳米粒溶酶体的逃逸能力。用Cell Navigator溶酶体染色试剂盒染色的溶酶体显示深绿色荧光；用DiO标记的复合纳米制剂显示红色荧光；用DAPI染色细胞核，产生蓝色荧光。当纳米粒被捕获在溶酶体中时，绿色和红色荧光重叠在细胞核周围，产生黄色荧光。研究结果如图6所示，孵育6小时后，在OXA-DA-DiO@PDA-PEG组中，NPs均匀地被溶酶体包围。红色NPs和绿色溶酶体合并产生黄色荧光，表明OXA-DA-DiO@PDA-PEG在溶酶体内积累。尽管OXA-DA-DiO@PDA-PEOz NP出现在细胞核周围，但是它的绿色荧光与溶酶体明显分离。由此可见，OXA前体药物纳米复合给药系统可以促进siRNA从溶酶体逃逸，这种现象归因于PEOz质子化所导致的“质子海绵效应”，致使溶酶体膜破裂，从而释放siRNA进入细胞质。
实验例5奥沙利铂前药纳米复合制剂的在不同pH条件下降解性能研究
(1)将2mg OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs分别加到装有pH 7.4和pH 5.5PBS缓冲液的离心管中，于37℃恒温水浴下振荡1天、3天和7天，同时，从pH 5.5的PBS液中取500μL分散液装入微量离心管中，在激光功率密度为1.0W·cm-2下给予808nm近红外光照3h，以评价光热作用对于复合纳米递药系统降解的影响，最后所有样品均通过TEM对其体外降解能力进行观察。
(2)实验结果：
将OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系置于不同pH的体外环境中(pH 7.4、pH5.5以及pH 5.5+NIR)，通过TEM观察其在0天、3天及7天后形貌的变化情况，以确定其降解能力，实验结果如图7所示。可以看出，在pH 7.4的环境中，经过3天和7天模拟的体内环境，复合纳米体系仍能够观察到较为清晰的颗粒状外形和轮廓，并没有发生非常明显的降解；在pH 5.5的环境中，3天后已经无法观察到明显的颗粒状形貌，纳米粒的结构开始发生崩塌，而在7天后可以观察到纳米粒大部分被降解，仅剩一些微小颗粒，足以进一步被肾脏所清除。这表明，相较于pH 7.4的环境，在pH 5.5的环境中，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz纳米体系具有良好的可降解性，这可能是因为聚多巴胺在弱酸性环境中能够降解所致，同时，能够在7天左右降解殆尽非常符合临床治疗的需求，既有足够的时间产生治疗作用，又能够降低蓄积的风险。此外，当OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz纳米体系处于pH 5.5的环境中并在观察前给予一次性近红外光照，可以观察到，仅需要3天即可观察到微小颗粒的出现，而7天后则几乎完全观察不到OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的存在了。这表明808nm近红外光照所引起的温度升高会进一步对复合纳米给药系统的结构产生破坏，进而加速降解的进程，表明在治疗的过程中，可以通过给予肿瘤局部的近红外光照，可控地调节OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的降解速率，从而更好地满足治疗需求。
实验例6奥沙利铂前药纳米复合制剂的体外抗肿瘤效应评价
(1)体外培养4T1肿瘤细胞于37℃，5％ CO2环境的培养箱中，12h后分别加入10μL裸siRNA、DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs、游离OXA、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs+NIR和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOzNPs+NIR，通过CCK8法分别检测复合纳米体系给药24h和48h后，对4T1肿瘤细胞产生的细胞毒性。
(2)体外培养4T1肿瘤细胞于37℃，5％ CO2环境的培养箱中，分别加入不同浓度(0、0.63、1.25、2.5、5、10、20μg/mL)的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs，并在1.0W·cm-2激光功率密度下以808nm的近红外光照射10min，最后通过CCK8法分别检测复合纳米体系在给药24h和48h后，对4T1肿瘤细胞生长的抑制情况。
(3)体外培养4T1肿瘤细胞于37℃，5％ CO2的培养箱中，分别加入10μLOXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs，并在1.0W·cm-2激光功率密度下以808nm的近红外光照射10min，给药24h后，采用细胞活死试剂盒染色，荧光显微镜观察4T1肿瘤细胞的死亡情况。
(4)实验结果：
奥沙利铂前药复合纳米体系体外细胞安全性及细胞毒性的研究均采用CCK8法进行。细胞安全性实验采用不载药的裸siPD-L1、不载药的DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs、游离OXA、OXA-DA-DiO@PDA-PEG、OXA-DA-DiO@PDA-PEOz、OXA-DA-DiO@PDA-PEG+NIR、OXA-DA-DiO@PDA-PEOz+NIR进行对比，实验结果如图8A所示。可以看出，与4T1细胞共孵育后，裸siPD-L1组和不载药的DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs组的细胞存活率均接近100％，表明DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs内核的毒性极低；OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz组在给药24h后，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz对4T1具有明显的抑制效应。增加808nm的近红外光照后，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz组对肿瘤在细胞的增殖抑制效应进一步提高。
体外细胞毒性实验选用载药但无法进行电荷翻转的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG与具有电荷翻转能力的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz进行对照，同时，还引入10min 808nm近红外光照的变量，其实验结果如图8B所示。可以看出，采用OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG处理组对4T1肿瘤细胞的杀伤整体弱于OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz处理组，这可能是由于肿瘤细胞对OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米体系的摄取能力更强所导致的。同时给予过808nm光照组的细胞存活率明显低于无光照组，这是因为复合纳米给药系统的多巴胺通过光热转换使得培养基温度升高，进而促进了肿瘤细胞的凋亡。当所负载的OXA浓度为10μg·mL-1时，给予光照的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz处理组在与肿瘤细胞共孵育24h后，肿瘤细胞的存活率为38.06％，而负载的OXA浓度为20μg·mL-1时，共孵育24h后肿瘤细胞的存活率仅为20.66％，同时，不给予光照的OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz处理组在OXA浓度为10μg·mL-1时，仅有不足30％的肿瘤细胞存活率。
此外，通过Calcein/PI染色试剂盒检测细胞活性与细胞毒性，实验结果如图8C所示。可以看出，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR处理组中所含的死细胞比例最大。因此，综合比较可以得出结论，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz复合纳米递药系统能够通过化学治疗和光热治疗的协同作用对4T1肿瘤细胞产生非常好的治疗效果。
实验例7奥沙利铂前药纳米复合制剂的体内抗肿瘤效应评价
(1)考察奥沙利铂前药复合纳米递药系统在体内的化学/光热联合治疗效果：首先，采用4T1肿瘤细胞在BALB/c雌性小鼠左侧第四乳房垫上荷瘤，瘤体积长到100-120mm3后，将荷瘤小鼠随机分成六组，并分别做好标记，记录给药前的体重、肿瘤体积。六组荷瘤小鼠分别尾静脉注射100μL生理盐水、游离OXA、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs+NIR和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs+NIR。每4天给药一次，连续给药20天，每2天记录荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重，观察各组药物对肿瘤的抑制效果，尤其是光热效应对肿瘤治疗的影响和疗效。第20天将所有荷瘤小鼠处死，分离肿瘤组织进行体积和称重对比，并对肿瘤组织进行Ki-67、CD31、TUNUEL染色，检测肿瘤细胞增殖、肿瘤组织血管形成及肿瘤细胞凋亡等情况。
(2)实验结果：
用不同的纳米粒处理4T1荷瘤小鼠，共给药20天，记录肿瘤体积和体重的变化，评价其体内抗肿瘤活性。研究结果如图9所示。可以看出，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR治疗组抗肿瘤活性最高，这组肿瘤在最后一次测量时几乎消失(图9A)。注射不同纳米粒子的小鼠的体重变化显示稳定增加(图9B)，表明纳米粒子具有良好的生物相容性，而各组之间的体重没有显著差异。对最终切除的肿瘤(图9C)进行拍照并称量肿瘤的重量(图9D)，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR治疗组的抗肿瘤效果最好，有三只小鼠肿瘤完全消失，这是因为OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz可透过肿瘤部位的电荷逆转而达到最佳的富集效果，并透过化疗及光热疗法的协同效应而产生优良的综合治疗效果。此外，通过免疫组织化学研究了体内肿瘤细胞的增殖抑制和凋亡情况(图9E)，与其他组相比，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR治疗组显示出优越的肿瘤细胞增殖抑制效果，且有相当比例的肿瘤细胞发生凋亡。
实验例8奥沙利铂前药纳米复合制剂的体内光热效应评价
(1)考察奥沙利铂前药复合纳米递药系统在体内的光热升温效果：采用4T1肿瘤细胞在BALB/c雌性小鼠左侧第四乳房垫上荷瘤，瘤体积长到100-120mm3后，将荷瘤小鼠随机分成三组，分别尾静脉注射100μL生理盐水、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs，注射30min后，用808nm近红外激光器(激光功率密度1.0W·cm-2)持续辐照肿瘤部位5min，通过红外热像仪在一定时间间隔记录肿瘤部位温度并成像拍照，获得激光照射后肿瘤部位温度随时间的变化曲线。
(2)实验结果：
在808nm近红外光照射下，记录各组荷瘤小鼠体内红外热成像的性能(图10)。与对照组OXA-DA-siRNA@PDA-PEG相比，注射OXA-DA-siRNA@PDA-PEOz的荷瘤小鼠，在5分钟内显示出显著的温度升高现象(图11)。据此推测，在PEOz修饰后，更多的纳米颗粒可以实现长期循环并最终富集肿瘤部位，而不是被内皮网络系统清除，从而通过增加肿瘤部位的局部浓度产生更强的光热效应。
实验例9奥沙利铂前药纳米复合制剂的体内免疫学效应评价
(1)采用4T1肿瘤细胞在BALB/c雌性小鼠左侧第四乳房垫上荷瘤，瘤体积长到100-120mm3后，将荷瘤小鼠随机分成六组，并分别做好标记，六组荷瘤小鼠分别尾静脉注射100μL生理盐水、游离OXA、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs、OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEG NPs+NIR和OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs+NIR。每4天给药一次，连续给药5次后，取各组荷瘤小鼠眼球血，ELISA法检测各组荷瘤小鼠血液中TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10等细胞因子的表达情况。将所有荷瘤小鼠处死后，分离肿瘤组织，采用免疫组化法检测各组荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4、CD8和IFN-γ的变化，考察T淋巴细胞在肿瘤组织内的浸润情况。
(2)实验结果：
为了评价PD-L1蛋白表达的免疫调节作用，采用免疫组化方法检测皮下肿瘤组织中PD-L1蛋白表达的水平、IFN-γ水平以及CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润情况。发现在OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz治疗组中观察到PD-L1蛋白表达水平显著降低(图12)，这可能是由于PEOz在肿瘤组织中的溶酶体逃逸效应导致siPD-L1的生物利用度增加所致。此外，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR处理组的CD8+T细胞浸润水平较高，CD8+T细胞活化的重要标志物IFN-γ的表达水平也显着增加。值得注意的是，在OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR治疗组中TNF-α的表达水平显着降低，而该组中的IL-10的表达水平显着增加(图13)。这些结果表明，siPD-L1特异性抑制PD-L1蛋白的表达，可以增强肿瘤组织中T细胞的活化和浸润，从而达到抗肿瘤的作用。
实验例10奥沙利铂前药纳米复合制剂的体内安全性评价
(1)奥沙利铂前药复合纳米递药系统体内安全性评价：待给药结束后，将实施例8各组荷瘤小鼠处死，观察、记录肺组织转移灶数量，作为衡量荷瘤小鼠肺转移指标，并对各组荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官进行H&E染色，检测该复合纳米制剂的用药安全性。
(2)实验结果：
为了进一步评估纳米复合制剂的安全性，对各组荷瘤小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行了H&E染色，显微镜观察结果如图14所示。可以看出，OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz+NIR治疗组小鼠的主要器官无明显损伤，其他各组荷瘤小鼠的主要脏器也无明显病理改变，说明本发明构建的纳米递药系统是安全的。
综上可见，首先，本发明合成了多巴胺修饰的奥沙利铂前药(IV)(OXA-DA)：将二价奥沙利铂转化成四价奥沙利铂前药，利用OXA-DA制备的纳米复合体系将奥沙利铂通过酰胺键镶嵌于体系内部，提高了奥沙利铂在循环系统中的稳定性，并改变其机体组织分布，减少毒副作用。其次，利用OXA-DA前药作为载体制备多孔纳米颗粒，并首次用于siPD-L1的靶向递送：多巴胺修饰奥沙利铂后，既保留了多巴胺的光热性能，同时又提高了奥沙利铂的机体稳定性，在奥沙利铂-多巴胺纳米体系中载入siPD-L1，用于特异性沉默肿瘤细胞中的PD-L1蛋白，阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强内源性免疫抗肿瘤效应，实现化疗/光热/免疫疗法协同抗肿瘤作用。此外，为了增强奥沙利铂前药纳米复合递药系统在肿瘤细胞中的摄取效率，在该纳米复合体系表面修饰聚-(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz)，致使纳米复合体系可在不同pH条件下发生电荷翻转，在pH 7.4生理条件下表面带负电荷，减少被内皮网状系统的清除，提高纳米复合体系的体内稳定性，进而实现长循环效应，而在pH较低的肿瘤微环境中，PEOz主链中的叔氨基发生质子化，进而使纳米复合体系表面带正电荷，增强肿瘤细胞摄取效率，进入肿瘤细胞后，PEOz主链中的叔氨基进一步质子化，产生“质子海绵效应”，帮助纳米复合体系逃离溶酶体，从而提高siPD-L1的生物利用度。因此，本发明制备的PEOz修饰的奥沙利铂前药纳米复合递药系统具有pH响应的电荷翻转效应，可同时实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤效应，增强恶性肿瘤的治疗效果，该纳米复合制剂有望发展作为一种新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将奥沙利铂溶于水中，再加入H2O2溶液，35-45℃避光反应20-30h，经双氧水氧化得到化合物OXA-OH(IV)；
S2、将OXA-OH(IV)和丁二酸酐同时溶于有机溶剂中，反应至溶液呈澄清状态，经丁二酸酐氧化得到OXA-COOH(IV)化合物；
S3、将EDC、NHS和OXA-COOH(IV)同时溶于盐酸溶液中，反应10-20min后再加入DA，并调节pH至7.0-7.5，继续反应2-30h后干燥收集样品即得OXA-DA(IV)化合物；
S4、将F127和TMB溶液加入到有机溶剂中，反应25-35min后再加入DA、OXA-DA和Tris缓冲液，室温反应8-12h，制得OXA-DA纳米粒；
S5、将OXA-DA NPs和盐酸胍溶液分散于有机溶剂中，再加入siPD-L1，经离心处理后即得OXA-DA-siPD-L1 NPs；
S6、将OXA-DA-siPD-L1 NPs分散于Tris缓冲液中，再加入多巴胺，避光反应2-3h后即得OXA-DA-siPD-L1@PDA NPs；
S7、将OXA-DA-siPD-L1@PDANP和PEOz-NH2分散于Tris缓冲液中，室温反应10-15h后得到OXA-DA-siPD-L1@PDA-PEOz NPs。
2.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，奥沙利铂在水中的浓度为0.3-1g/100mL，奥沙利铂水溶液与H2O2溶液的体积比为100:1-3。
3.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，OXA-OH(IV)与丁二酸酐的质量比为3-5:1，OXA-OH(IV)在有机溶剂中的浓度为0.5-5mM。
4.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，EDC、NHS、OXA-COOH(IV)与DA的质量比为(70-130):(100-200):(70-130):(70-130)，OXA-COOH(IV)在盐酸溶液中的浓度为90-110mg/100mL。
5.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S4中，F127、DA、OXA-DA和Tris缓冲液的质量比为(0.3-0.4):(50-60):(5-7):(80-10)，F127在有机溶剂中的浓度为0.3-0.4g/120mL，TMB溶液与有机溶剂的体积比为0.4-0.6:120。
6.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S5中，OXA-DA NPs在有机溶剂中的浓度为1-3mg/267μL，盐酸胍溶液的浓度为38.4％，盐酸胍溶液与有机溶剂的体积比为60-70:267，siPD-L1使用前先用DEPC水处理成5nM的浓度，siPD-L1溶液与盐酸胍溶液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S6中，OXA-DA-siPD-L1 NPs在Tris缓冲液中的浓度为2mg/mL，OXA-DA-siPD-L1 NPs与多巴胺的比例为4:3。
8.根据权利要求1所述的一种pH响应电荷翻转的纳米复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤S7中，OXA-DA-siPD-L1@PDA NP在Tris缓冲液中的浓度为0.5mg/mL，OXA-DA-siPD-L1@PDA NP与PEOz-NH2的比例为5:1。
9.采用权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的pH响应电荷翻转的纳米复合制剂。
10.权利要求9所述的pH响应电荷翻转的纳米复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| US20140193489A1 (en) * | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Bar-Ilan University | Dopamine Nanocapsules and Uses Thereof |
| CN108395537A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-08-14 | 合肥工业大学 | 一种四价铂大分子前药pda、四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒及其应用 |
| CN108853512A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-23 | 上海交通大学 | 双药型顺铂/阿霉素－聚多巴胺前药纳米粒子的制备和抗肿瘤应用 |
| CN113577277A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-11-02 | 中山大学 | 一种PEOz和聚多巴胺-钆离子网络修饰的可降解介孔硅纳米给药系统及制备方法 |
-
2022
- 2022-12-26 CN CN202211673131.7A patent/CN116059357B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140193489A1 (en) * | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Bar-Ilan University | Dopamine Nanocapsules and Uses Thereof |
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| Title |
|---|
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| ZHIJUN ZHU等: "Polydopamine Nanoparticles for Combined Chemo- and Photothermal Cancer Therapy", 《NANOMATERIALS》, pages 1 - 9 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116059357B (zh) | 2023-11-03 |
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