CN116042894A - PvCKX4及miR156-SPL-CKX4分子模块在柳枝稷性状改良上的应用 - Google Patents

PvCKX4及miR156-SPL-CKX4分子模块在柳枝稷性状改良上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PvCKX4及miR156‑SPL‑CKX4分子模块在柳枝稷性状改良上的应用，属于植物基因工程技术领域，PvCKX4基因调控柳枝稷的开花时间、茎粗和茎节长度，在柳枝稷中过量表达miR156，同时干扰CKX4的表达，降低CKX4的表达量，使柳枝稷分蘖增加的同时茎秆粗度与野生型水平相当。本发明发解决目前能源植物生物量改良基因资源库不足的需求问题，解决了禾本科植物中普遍存在的分蘖和茎粗之间的竞争问题。

Description

PvCKX4及miR156-SPL-CKX4分子模块在柳枝稷性状改良上的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了分子模块在增加柳枝稷生物量方面的应用。
背景技术
地上部生物量是禾本科植物株型改良的重要方向之一，决定生物量的主要性状为植株分蘖数目、植株高度和开花时间等。此外，粗壮的茎秆除了能增加植株生物量之外，还能够提高植株的抗倒伏能力。然而，在禾本科植物中，过多的分蘖通常会引起植株株高变矮，茎秆变细等不利表型，从而限制了生物量的进一步提高。目前，关于禾本科植物分蘖数目与茎粗之间相互制约的分子机制还未见报道，对其分子机制进行解析有望打破这种制约，实现分子设计育种手段创制高生物量新品系。柳枝稷(Panicum virgatum L.)是C4多年生高大禾本科草本植物，是一类可用于生物能源生产、牧草饲料加工与生态修复的综合性经济作物。提高柳枝稷生物量能够进一步保障生物能源与牧草饲料生产领域原材料的可持续性供给，兼顾我国能源安全、粮食安全与环境安全的多重效益。
miR156与其靶标基因SPLs形成的miR156-SPL模块在植物株型调控中发挥着关键作用。由于miR156-SPL功能的多样性，利用miR156-SPL模块对植物株型进行调控通常会伴随着不可避免的负面表型从而限制了该模块的进一步应用。利用miR156在柳枝稷中提高其生物量时发现，随着miR156表达量的提高，柳枝稷分蘖数目增加的同时，损失了节间伸长和茎秆粗度两个优异性状(miR156OE)，这使得miR156-SPL模块提高柳枝稷生物量的潜力受到限制。因此，miR156-SPL能够作为解析禾本科植物分蘖数目与茎粗之间相互制约机制的关键模块，而挖掘miR156-SPL控制茎秆发育的内在关键因子并进行利用，是解决上述难题的有效途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种通过在miR156过表达植株中干扰CKX4的表达同时保持柳枝稷多分蘖和茎粗、增加植物生物量产量方面的应用，以解决目前能源植物生物量改良基因资源库不足的需求问题，为打破禾本科植物中普遍存在的分蘖和茎粗之间的竞争提供新的策略。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
PvCKX4基因在调控柳枝稷上的应用，所述的应用为调控柳枝稷开花时间、茎粗和茎节长度，所述PvCKX4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述的应用方法为过量表达PvCKX4基因。
本发明还提供miR156-SPL-CKX4分子模块在增加柳枝稷生物量方面的应用，所述应用方法为在柳枝稷中过量表达miR156，同时干扰CKX4的表达，降低CKX4的表达量，使柳枝稷分蘖增加的同时茎秆粗度与野生型水平相当。
进一步，所述应用方法为获得柳枝稷细胞分裂素氧化/脱氢酶PvCKX4基因的CDS区序列，根据Phytozome网站中已公布的柳枝稷基因组信息，在PvCKX4全长序列两侧设计引物PvCKX4-F和PvCKX4-R，通过PCR扩增获得1575bp的柳枝稷PvCKX4基因全长序列；将得到的全场序列整合至重组质粒pETMALc-H-PvCKX4中，同时，在PvCKX4基因非保守区段设计引物PvCKX4-RNAi-F和PvCKX4-RNAi-R，通过PCR扩增获得521bp的PvCKX4基因干扰表达区段，之后，将得到的全长序列和干扰表达片段，基于Gateway技术重组分别整合到过量表达载体pANIC10A和干扰表达载体pANIC8D中；采用EHA105农杆菌介导的遗传转化方法，转入柳枝稷胚性愈伤中，通过潮霉素或双丙氨膦抗性筛选，获得抗性再生植株。
进一步，RNA干扰区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明与现有技术相比的有益效果：
(1)在禾本科植物中，过多的分蘖通常会引起植株株高变矮，茎秆变细等不利表型，从而限制了生物量的进一步提高。目前，关于禾本科植物分蘖数目与茎粗之间相互制约的分子机制还未见报道，对其分子机制进行解析有望打破这种制约，实现分子设计育种手段创制高生物量新品系。本发明利用基因工程的手段，发现miR156OE植株茎秆变细与PvCKX4表达量增加导致的细胞分裂素含量降低有关，通过过表达技术调控PvCKX4的转录本水平，鉴定了PvCKX4在柳枝稷茎秆发育、开花时间以及生物量调控过程中的作用。在柳枝稷中过量表达PvCKX4，不能实现营养生长时期向生殖生长时期的转变，不会出现开花现象。同野生型相比茎秆明显变细，茎节变短；其中，在miR156过表达植株中干扰CKX4的表达所获得的基因工程植株不仅保持较多分蘖并且茎秆粗度恢复至野生型水平，生物量显著增加。
(2)本发明挖掘到柳枝稷细胞分裂素氧化/脱氢酶PvCKX4对不同细胞分裂素的底物的降解能力存在差异，功能验证表明PvCKX4通过降解细胞分裂素调控植物茎粗，为牧草和能源作物生物量遗传改良和分子育种提供了新靶标。
附图说明
图1柳枝稷中细胞分裂素氧化/脱氢酶基因PvCKX4及PvCKX4-RNAi的PCR扩增电泳图；
图2柳枝稷pETMALc-H-PvCKX4原核表达载体(A)、pANIC10A-PvCKX4过表达(B)和pANIC8D-PvCKX4-RNAi干扰表达(C)载体简图；
图3PvCKX4对iP(A)和tZ(B)类型细胞分裂素的催化活性分析；
图4PvCKX4相关转基因植株基因组PCR鉴定
图5PvCKX4过表达柳枝稷表达量(A)、表型(B)、茎粗(C)以及细胞分裂素(D)测定。对照表示野生型柳枝稷植株，PvCKX4OE-1/-6/-7分别表示三个独立的阳性过表达转基因株系；
图6miR156OE_CKX4RNAi转基因柳枝稷植株中miR156和PvCKX4基因qRT-PCR结果。对照表示野生型柳枝稷植株，miR156OE表示阳性miR156过表达株系，miR156OE_CKX4RNAi表示在miR156过表达植株中干扰PvCKX4表达的阳性株系；
图7miR156OE_CKX4RNAi转基因柳枝稷植株表型；
图8miR156OE_CKX4RNAi转基因柳枝稷植株鲜重(A)和干重(B)统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。
实施例1：PvCKX4及PvCKX4-RNAi序列的扩增
根据Phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov)中公布的柳枝稷基因组信息，分别在PvCKX4全长序列的两侧设计引物(PvCKX4-F和PvCKX4-R)，以及PvCKX4基因非保守区段设计引物(PvCKX4-RNAi-F和PvCKX4-RNAi-R)以柳枝稷各组织的混样cDNA为模板，用上述引物进行扩增。
引物序列如下：
PvCKX4-F：ATGAGGCCATCCCTGGAGC
PvCKX4-R：TCACAAGGACAACGGCAATG
PvCKX4-RNAi-F：GTCCAAGCAAGCCGTTTTCAGTCA
PvCKX4-RNAi-R：ATCCCAATATCGGCCTCTTCACAG
PCR反应体系为：1μL cDNA，4μL 10pM dNTP，25μL 2×Buffer，正/反向引物各2μL，0.5μL 5U/μL PrimerSTAR HS DNA聚合酶，加入ddH2O补齐至总体系50μL，混匀。扩增反应条件为：98℃ 4min；98℃ 5sec，55℃ 5sec；72℃ 2min(RNAi区段30sec)，34个循环；72℃10min。
1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，分别得到大小约为1575bp和521bp的片段，如图1所示。凝胶回收扩增片段(使用OMEGA凝胶回收试剂盒)，常规测序(北京六合华大基因科技有限公司)。根据测序结果，扩增获得的长片段全长为1575个碱基，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码蛋白含有525个氨基酸残基，序列如SEQ ID NO.2所示。RNAi片段长度为521个碱基，序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2：重组载体构建及玉米原生质体瞬时表达亚细胞定位
设计PvCKX4与表达载体p16318h-cGFP无缝连接引物16318-PvCKX4-F和16318-PvCKX4-R，以上述得到的全长序列片段为模板，使用高保真酶扩增该片段；用限制性内切酶BamHI酶切表达载体p16318h-cGFP。回收基因片段和线性化载体片段，利用无缝连接酶(Vazyme公司)进行同源重组。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落，进行PCR扩增以及测序验证，获得重组质粒p16318h-PvCKX4-cGFP。
引物序列如下：
16318-PvCKX4-F：
ACGATATCTCTAGAGGATCCATGAGGCCATCCCTGGAGCA
16318-PvCKX4-R：
TCCTCGCCCTTGCTCACCATCAAGGACAACGGCAATGACG
下划线为接头序列。
使用黑暗条件下生长至两叶一心的玉米叶片制作原生质体细胞，将重组质粒加入制备好的原生质体中，使用PEG化学法转化原生质体细胞，12-18h后激光共聚焦显微镜捕捉荧光信号。结果显示，PvCKX4主要分布于细胞质，这为其发挥酶功能提供了细胞水平的场所。
实施例3：重组载体构建及玉米原生质体瞬时表达亚细胞定位
根据前期研究中获得的PvCKX4基因序列，设计引物采用无缝连接的方法连接到pETMALc-H载体中。使用EcoRⅠ和BamHⅠ线性化酶切载体，使用引物pETMAL-PvCKX4-F和pETMAL-PvCKX4-R扩增目的片段。将纯化后的线性化载体和PCR目的片段进行无缝连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pETMALc-H-PvCKX4(图2)。将构建好的重组质粒转入用于原核表达的大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞中。
引物序列如下：
pETMAL-PvCKX4-F：
ACCATCACCACGCGAATTCGATGAGGCCATCCCTGGAGCA
pETMAL-PvCKX4-R：
CTTGTCGACTCGAGGGATCCTCACAAGGACAACGGCAATG
下划线为接头序列。
体外原核表达并纯化PvCKX4蛋白，酶活反应以DCPIP(二氯酚靛酚)为电子受体，以iP和tZ形式的细胞分裂素为底物，37℃反应12h，使用乙腈终止反应。反应后的溶液离心过滤后，取上清进行HPLC检测，通过底物消耗量进行酶活测定。实验结果表明，与阴性对照相比，PvCKX4能够与iP反应生成腺嘌呤。此外，PvCKX4对iP的降解能力显著高于其对tZ的降解能力(图3)。
实施例4：PvCKX4相关转基因柳枝稷植物的获得
设计引物将PvCKX4 CDS序列连接到pENTR载体上，将重组质粒pENTR-PvCKX4与pANIC10A质粒进行LR反应，构建柳枝稷过量表达载体。在PvCKX4序列非保守域选取521bp，设计引物将PvCKX4-RNAi序列连接到pENTR载体上，将重组质粒pENTR-PvCKX4-RNAi与pANIC8D质粒进行LR反应，构建柳枝稷干扰表达载体。将重组质粒pANIC10A-PvCKX4和pANIC8D-PvCKX4-RNAi分别转化农杆菌EHA105用于后续实验。所述引物序列如下：
pENTR-PvCKX4-F：caccATGAGGCCATCCCTGGAGC
pENTR-PvCKX4-R：TCACAAGGACAACGGCAATG
pENTR-PvCKX4-RNAi-F：caccGTCCAAGCAAGCCGTTTTCAGTCA
pENTR-PvCKX4-RNAi-R：ATCCCAATATCGGCCTCTTCACAG
采用农杆菌介导的柳枝稷遗传转化法将携带重组质粒pANIC10A-PvCKX4的农杆菌侵染K1受体材料，该愈伤系为实验室前期工作中筛选鉴定的具有单一基因型的高质量野生型柳枝稷愈伤系；将携带重组质粒pANIC8D-PvCKX4-RNAi的农杆菌侵染miR156OE受体材料，miR156过表达愈伤系miR156OE-30(pANIC6B-premiR156)为实验室前期产生的转基因植株诱导而成。采用农杆菌介导的柳枝稷胚性愈伤遗传转化方法(Xi et al,Agrobacterium-mediated transformation ofswitchgrass and inheritance ofthetransgenes.Bioenergy Research,2009,2:275-283)进行转化。使用过量表达载体通用引物ZmUbq-F与全长基因的下游引物PvCKX4-R检测全长基因(图4A)，使用抗潮霉素基因的上下游引物(hph3+hph4)检测潮霉素基因(图4B)确定阳性过表达植株。使用干扰表达载体通用引物Guslink-F与干扰片段的下游引物PvCKX4-RNAi-R、Guslink-R与PvCKX4-RNAi-R检测干扰片段，最终确定阳性干扰表达转基因株系(图4C和D)。
实施例5：转基因植株分子鉴定
取上述鉴定转基因阳性植株幼嫩茎秆，用TriZol试剂盒(全式金公司)提取总RNA，取1.0μg总RNA做逆转录反应(全式金公司)反转为cDNA，上述步骤具体参考使用说明。以上述cDNA为模板，使用引物PvCKX4-qRT-F和PvCKX4-qRT-R进行实时荧光定量PCR检测，内参基因为柳枝稷Ubiquitin(UBQ)基因。引物序列如下：
PvUBQ-F：TTCGTGGTGGCCAGTAAG
PvUBQ-R：AGAGACCAGAAGACCCAGGTACAG
PvCKX4-qRT-F：CTAGAGTTCTTGGACAGGGTG
PvCKX4-qRT-R：TCTTTCAGGATCTTGCCGAAG
实时荧光定量PCR检测结果表明，于野生型对照(Control)相比，过表达植株PvCKX4OE-1/-6/-7中PvCKX4的表达量均显著上升(图5A)；miR156OE_CKX4RNAi植株miR156表达水平超过野生型，PvCKX4的表达量相对于miR156过量表达植株表达量降低(图6)。
实施例6：转基因植株开花时间、茎节粗度、激素水平和生物量测定
对产生的转基因柳枝稷植株进行茎节粗度统计、激素含量测定和生物量测定。与野生型相比，PvCKX4过表达植株不能实现营养生长时期向生殖生长时期的转变，未出现开花(图5B)。此外，同野生型相比出现茎秆明显变细，茎节变短，iP类型的细胞分裂素显著降低(图5B和C)；与miR156OE植株相比，miR156OE-CKX4RNAi植株的茎秆直径和节间长度显著增加，并恢复至对照植株水平(图7，图8A)。同时，miR156OE-CKX4RNAi植株与miR156OE株系的分蘖数目无显著性差异，两者均显著高于对照植株(图7)。综上，在miR156OE背景下干扰PvCKX4的表达可以恢复柳枝稷茎秆粗度。本实施例统计生长6个月的对照、miR156OE以及miR156OE-CKX4RNAi植株地上部生物量。结果表明，与对照植株相比，miR156OE-CKX4RNAi植株鲜物质生物量平均增加了119％，干物质生物量平均增加了110％(图8)。
SEQ ID NO.1
atgaggccatccctggagcactgcttcaagctgctgctgctgctggcgcttggcggggtgaccatgcacgtgcccgacgc
cgacgtcctctcctccctcggggcgctgcgcctcgacggccatttcagcttccacgacgcctccgccatggcgcgggact
tcggcaaccgctgcagcttgctgccggccgccgtgctccaccccggctccgtgtctgacatcgccgcgaccttgaggca
cgtcttctccctgggcgagcgctcgccgctcaccgtcgccgcgcgcggccacgggcactcgctcatgggccagtccca
ggccgccggggggatcgtcgtcaggatggagtcgctccggggcagtgacaggcttcaggtagtccatggcagtggcat
gtctccgtttgtggacgccccaggaggggagctctggatcaacgtgctccacgagaccctcaagcacggcctggcgccc
aagtcatggaccgactatctccatctcacggtcggtggcaccttgtctaatgcgggggtcagcgggcaggcgttccgcca
cggaccgcaggtcagcaatgtcaatcaactggagattgtgacagggagaggagacgttgttacctgctcgccagaggag
aactctgatctcttctacgctgctctcggcgggctcggtcagttcgggatcatcaccagagcaaggattgctcttgagcctg
ctccaaagatggtgaggtggatcagagttctttactcggactttgcaagcttcaccgaggaccaggagatgctgatcatgg
cagagaacacctttgactacattgaaggttttgtcatcataaacaggacaggcatcctcaacaactggaggacgtccttcaa
gccacaggacccagtccaagcaagccgttttcagtcagatggaagggttctatactgcctcgagctaactaagaacttcaa
cagtgacgaagcagatatcatggaacaggaagttactgcactgctatctcgacttagatacatccggtctactctattccaca
ccgatgtcacgtacctagagttcttggacagggtgcacacctccgaggtgaagctgaaggcacaaggcctctgggaagtt
ccacacccttggctgaatcttctgatcccaaggagctcaatccaaagatttgctaaggaagtcttcggcaagatcctgaaag
acagcaacaatggtcccattctgctttacccagtgaacaaatcaaagtgggacaacagaacgtcagtagtcataccagatg
aggaaattttctacctggtggggttcctttcttcagcaccgtctctctcaggtcacggcagcgttgcacatgcaatgaacctg
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gtggaaagcccactttggagtgagttgggaaacatttgaacggaggaaacacacgtatgatcccctagccatcctagcac
caggacagagaatattcccaaaggcgtcattgccgttgtccttgtga
SEQ ID NO.2
MRPSLEHCFKLLLLLALGGVTMHVPDADVLSSLGALRLDGHFSFHDASAMA
RDFGNRCSLLPAAVLHPGSVSDIAATLRHVFSLGERSPLTVAARGHGHSLMGQ
SQAAGGIVVRMESLRGSDRLQVVHGSGMSPFVDAPGGELWINVLHETLKHG
LAPKSWTDYLHLTVGGTLSNAGVSGQAFRHGPQVSNVNQLEIVTGRGDVVT
CSPEENSDLFYAALGGLGQFGIITRARIALEPAPKMVRWIRVLYSDFASFTEDQ
EMLIMAENTFDYIEGFVIINRTGILNNWRTSFKPQDPVQASRFQSDGRVLYCLE
LTKNFNSDEADIMEQEVTALLSRLRYIRSTLFHTDVTYLEFLDRVHTSEVKLK
AQGLWEVPHPWLNLLIPRSSIQRFAKEVFGKILKDSNNGPILLYPVNKSKWDN
RTSVVIPDEEIFYLVGFLSSAPSLSGHGSVAHAMNLNNQIVEFCEEADIGMKQ
YLAPYTTQQQWKAHFGVSWETFERRKHTYDPLAILAPGQRIFPKASLPLSLSEQ ID NO.3
gtccaagcaagccgttttcagtcagatggaagggttctatactgcctcgagctaactaagaacttcaacagtgacgaagca
gatatcatggaacaggaagttactgcactgctatctcgacttagatacatccggtctactctattccacaccgatgtcacgtac
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tggtggggttcctttcttcagcaccgtctctctcaggtcacggcagcgttgcacatgcaatgaacctgaacaaccaaatagttgagttctgtgaagaggccgatattgggat.
本实施例中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。例如，在miR156OE材料中通过多种技术达到与本专利中降低PvCKX4的转录水平或影响其蛋白质酶活的效果，理论上均能起到恢复茎粗的作用。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.PvCKX4基因在调控柳枝稷上的应用，其特征在于，所述的应用为调控柳枝稷开花时间、茎粗和茎节长度，所述PvCKX4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ IDNO.2，所述应用的方法为过量表达PvCKX4基因。
2.miR156-SPL-CKX4分子模块在增加柳枝稷生物量方面的应用，其特征在于，所述应用的方法为在柳枝稷中过量表达miR156，同时干扰CKX4的表达，降低CKX4的表达量，使柳枝稷分蘖增加的同时茎秆粗度与野生型水平相当。
3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用方法为获得柳枝稷细胞分裂素氧化/脱氢酶PvCKX4基因的CDS区序列，根据Phytozome网站中已公布的柳枝稷基因组信息，在PvCKX4全长序列两侧设计引物PvCKX4-F和PvCKX4-R，通过PCR扩增获得1575bp的柳枝稷PvCKX4基因全长序列；将得到的全场序列整合至重组质粒pETMALc-H-PvCKX4中，同时，在PvCKX4基因非保守区段设计引物PvCKX4-RNAi-F和PvCKX4-RNAi-R，通过PCR扩增获得521bp的PvCKX4基因干扰表达区段，之后，将得到的全长序列和干扰表达片段，基于Gateway技术重组分别整合到过量表达载体pANIC10A和干扰表达载体pANIC8D中；采用EHA105农杆菌介导的遗传转化方法，转入柳枝稷胚性愈伤中，通过潮霉素或双丙氨膦抗性筛选，获得抗性再生植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，RNA干扰区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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Title
RUIJUAN YANG: "Overexpression of PvWOX3a in switchgrass promotes stem development and increases plant height", HORTICULTURE RESEARCH, vol. 8, pages 1 - 14 *

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