CN116041238A - 从菌体中提取虾青素油和虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从菌体中提取虾青素油和虾青素的方法，包括以下步骤：(1)在产虾青素的微生物的湿菌渣中，加入溶壁酶，于适合酶反应的条件下进行酶解反应，得到酶解液；(2)对酶解液进行干燥，得到干菌渣；(3)将干菌渣用第一溶剂浸提，固液分离得到浸提液A和菌渣A；(4)将浸提液A减压浓缩除去溶剂得到油状物，过滤，除去固形物即得虾青素油；(5)将菌渣A用第二溶剂浸提，固液分离得到浸提液B和菌渣B；(6)将浸提液B减压浓缩后，加入第三溶剂，低温下结晶，过滤，即得虾青素晶体。本发明的方法能够将菌体中的虾青素和虾青素油分别提取出来，其中虾青素总收率达95％以上，虾青素纯度达93％以上。

Description

从菌体中提取虾青素油和虾青素的方法
技术领域
本发明属于化学工程和食品工程领域，具体涉及一种从菌体中同时提取虾青素油和虾青素两种物质的方法。
背景技术
红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous，曾用名：Phaffia rhodozyma)能代谢产生重要的生理活性物质--虾青素(astaxanthin)，其中少量虾青素以酯化形式存在。另外，红法夫酵母细胞中含有丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素，脂肪酸约占干菌丝体的30％，其中包括油酸、亚油酸等多种不饱和脂肪酸。
虾青素分子中含有11个共轭双键，赋予其超强的抗氧化能力。基于抗氧化功能，虾青素可对皮肤起到一定保护，防止皱纹的出现及色素沉着的加重。人类的衰老、炎症和癌症的发生、动脉硬化等问题都是由于细胞氧化缺失引起的，而拥有很强抗氧化功能的虾青素能够有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡，因此，虾青素可以由内而外地保护细胞健康，延缓衰老，预防癌症的发生，抵御疾病。虾青素有很强的着色功能，虾青素广泛应用于水产饲料领域，如南美白对虾、三文鱼、石斑鱼和鲑鳟鱼等鱼虾蟹类养殖业中，使人工养殖的水产品拥有野生一样的色泽和品质。
近年来，虾青素的市场需求不断增加，其中体现在水产饲料领域、化妆品领域、以及保健医药领域。目前市场虾青素主要通过人工合成、水产品废弃物中提取和天然发酵法制备，其中天然发酵法生产虾青素安全环保，更受市场青睐。天然发酵包括雨生红球藻和红法夫酵母等真菌的培养，其中红法夫酵母增殖培养速度快，培养成本较低，有较好的市场前景。
现有的虾青素提纯工艺中比较复杂，得到的虾青素纯度低，提取效率低，很少有对红法夫酵母油脂的提取方面的研究，忽略了对红法夫酵母细胞内脂肪酸提取的提取和利用，造成了资源浪费。
专利CN104030957B通过菌体洗涤，用二甲基亚砜溶剂破壁，无水乙醇提取，再加入正己烷和去离子水萃取，然后进行硅胶柱层析，最终得到纯度大于99％，回收率大于60％的虾青素，该方法用二甲基亚砜溶剂破壁，该溶剂沸点较高，容易残留，采用柱层析方法，导致收率太低，不适合工业化。专利CN111995880B通过机械法对干菌体破壁，然后氢氧化钠和乙醇进行油脂皂化反应，进一步溶剂萃取，浓缩结晶得到虾青素，该方法中皂化对虾青素油一定破坏，导致收率偏低，皂化后的产物利用程度低，造成油脂的浪费。专利CN114751848A中提到用酸法破壁红法夫酵母，然后用醇类溶剂提取虾青素粗品，再加油脂和适量水进行萃取，得到虾青素精油。由于虾青素酸碱条件极其不稳定，酸法破壁会导致一定程度的虾青素破坏，后面又额外添加大豆油、葵花籽油等，增加了工艺成本。专利CN103848769B中用二甲基亚砜对红法夫酵母菌体破壁，丙酮提取虾青素得到粗提液，用石油进行萃取醚脱脂和除杂，得到二次粗提液，加入4℃的饱和食盐水，再用乙酸乙酯萃取出去二甲基亚砜，低温蒸干得到虾青素粉末，用二氯甲烷溶解粉末，加入甲醇结晶，离心得到虾青素晶体。该方法中用到二甲基亚砜破壁，很难完全除去，另外还用到丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇五种溶剂，溶剂种类多，对后面溶剂回收带来极大困难，工艺复杂，成本较大，不适合工业化生产。
目前在虾青素提取方面主要存在提取工艺复杂，成本高、提取率低、忽略了红法夫细胞中脂肪酸的价值，造成资源浪费等问题。因此，开发能够同时将红法夫酵母细胞中的脂肪酸和虾青素的分别提取出来的新工艺具有重要经济价值。
发明内容
为了使得产虾青素的微生物(例如雨生红球藻、红法夫酵母、粘红酵母、深红酵母、海洋红酵母等)菌体中的脂肪酸(包括油酸、亚油酸、多不饱和脂肪酸等)和虾青素都能得到充分回收利用，并且减少分离提取步骤中使用的有机溶剂种类、使用量，避免昂贵试剂的使用，发明人经过反复试验，开发出从发酵菌体中同时提取虾青素油和虾青素两种物质的新工艺，实现了物尽其用。具体而言，本发明包括以下技术方案。
一种从菌体中提取虾青素油和虾青素的方法，包括以下步骤：
(1)在产虾青素的微生物发酵液经离心得到的湿菌渣中，加入溶壁酶，于适合酶反应的条件下进行酶解反应，得到酶解液；
(2)对步骤(1)中得到的酶解液进行干燥，得到含水量较低例如不高于5％的干菌渣；
(3)将步骤(2)中得到的干菌渣用第一溶剂浸提，固液分离得到浸提液A和菌渣A；
(4)将步骤(3)中得到的浸提液A减压浓缩除去溶剂得到油状物，过滤，除去固形物即得虾青素油；
(5)将步骤(3)中得到的菌渣A用第二溶剂浸提，固液分离得到浸提液B和菌渣B；
(6)将步骤(5)中得到的浸提液B减压浓缩至一定体积后，加入第三溶剂即结晶溶剂，低温下结晶，优选搅拌下结晶，过滤，即得虾青素晶体。
在一种实施方式中，所述微生物是红法夫酵母。
优选地，上述方法还包括下述步骤：
(7)在步骤(6)的结晶过滤后，滤饼用顶洗溶剂顶洗，优选顶洗两次以上，低温减压干燥，得到虾青素晶体。所用的顶洗溶剂优选与第三溶剂即结晶溶剂相同。
在一种实施方式中，步骤(7)中所述的低温减压干燥温度为30±5℃，优选大约30℃，干燥时间3-5h。
优选地，步骤(5)中菌渣A用第二溶剂浸提得到浸提液B和菌渣B后，菌渣B继续用第二溶剂浸提，固液分离后得到浸提液B，合并浸提液B用于下一步处理。
在一种实施方式中，步骤(1)中所述溶壁酶是藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)来源的酵母溶壁酶。
可选地，所述溶壁酶是含有溶壁酶的pH4.0-6.5缓冲液，例如pH4.5-6.5的磷酸缓冲溶液，酶用量10U/mL～100U/mL，湿菌渣与溶壁酶缓冲液重量体积比例为1：0.5～1.5，进一步优选大约1：1。
应理解，本文中在表述数值特征时，术语“大约”、“约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±8％、±6％、±4％或±2％的误差范围或浮动范围。
优选地，步骤(5)中所述适合酶反应的条件为pH4.5～6.5、温度为30～50℃、酶解时间为1～3h。
上述步骤(2)中的所述干燥选自喷雾干燥、沸腾床干燥、烘干、吹干，优选是喷雾干燥。
优选地，步骤(2)干燥后所得的干菌渣的含水量不高于5％。
在一种实施方式中，步骤(3)中的所述第一溶剂是烷烃与醇以体积比1～5：1的混合溶剂，其中所述烷烃选自下组：石油醚、正己烷、环己烷、它们中两种以上的混合物；所述醇选自下组：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、3-戊醇、2-戊醇、叔戊醇、2-甲基丁醇、3-甲基-3-戊醇、异戊二醇、它们中两种以上的混合物。
步骤(5)中的第二溶剂选自下组：二氯甲烷、三氯甲烷、它们的混合物。
步骤(6)中的第三溶剂即结晶溶剂为选自下组：酮类、醇类、它们中两种以上的混合物；所述酮类选自丙酮、2-丁酮、戊-2-酮、戊-3-酮、己-2-酮或者己-3-酮，优选丙酮。
优选地，步骤(7)中的顶洗溶剂与第三溶剂即结晶溶剂相同，选自下组：酮类、醇类、它们中两种以上的混合物。所述酮类选自丙酮、2-丁酮、戊-2-酮、戊-3-酮、己-2-酮或者己-3-酮，优选丙酮。
在一种实施方式中，步骤(3)中干菌渣与第一溶剂的重量体积比例为1：5～10，浸泡搅拌温度40～50℃。
上述步骤(3)和(5)中所述的浸提可以是指恒温搅拌浸提，浸提时间足以导致80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、最优选95％以上目标产物从菌渣中分离出来，例如1h左右。
上述步骤(3)和(5)中所述的固液分离可以是过滤或者离心分离。
在一种实施方式中，步骤(6)中所述的减压浓缩温度40～50℃，浓缩倍数20～30倍；低温搅拌的温度控制在-5～5℃。所述结晶溶剂为-5～5℃的冷丙酮，加入方式为边搅拌边匀速加入，更优选缓慢匀速加入冷丙酮，控制结晶溶剂加入完成时间20～30min，用量为浓缩液体积的1～3倍。
优选地，在步骤(1)中所述湿菌渣在酶反应之前可以通过下述工序处理：
微生物发酵液经离心得到的菌泥用水(例如去离子水或者纯水)或者缓冲溶液(例如pH4.5-6.5磷酸缓冲溶液)再悬浮、离心，从而去除发酵液残留杂质；或者微生物发酵液加水稀释至2倍以上体积，离心，去除发酵液残留杂质。
在一种实施方式中，步骤(4)所得虾青素油中优选进一步加入抗氧化剂例如酯化维生素C，充氮密封。该产品可以作为商品虾青素油使用或销售。
上述抗氧化剂例如酯化维生素C的加入量可以占虾青素油重量的0.5％～1.5％。
本发明的另一个方面提供了一种虾青素晶型A，其通过上述的方法制备，其使用CuKα辐射、以2θ角度表示的XRPD光谱至少在8.381°±0.2°、13.693°±0.2°、16.841°±0.2°、19.754°±0.2°、25.892°±0.2°和27.683°±0.2°处存在衍射峰。
进一步地，所述晶型A还在2θ值为10.261°±0.2°、12.325°±0.2°、21.521°±0.2°和22.863°±0.2°处存在衍射峰。
虾青素晶型A的化学稳定性明显高于现有技术的虾青素产品，体现在抗氧化性更高，当暴露于空气中7天后，现有技术的虾青素晶体的纯度已经降低为不到最初纯度的70％，而晶型A纯度仍能保持至少80％以上，而因此更有利于保存贮藏。
本发明的方法所使用的有机溶剂都是廉价易得的大宗化工原料，针对产虾青素的微生物例如红法夫酵母发酵菌体，通过特殊的工艺路线，能够将菌体中有经济价值的虾青素和虾青素油分别提取出来，其中虾青素总收率达95％以上，虾青素纯度达93％以上。提取的虾青素油可应用于饲料添加剂，直接喷涂于饲料表面，进行投喂，变废为宝，使得细胞内的油脂得到充分利用，避免了资源浪费，显著提升菌体的经济价值。本发明先将菌体细胞中的虾青素油提取出来，很大程度上降低了脂溶性杂质对虾青素提取、纯化、结晶的影响，促进了后期高纯度、高品质虾青素晶体的结晶。得到的高品质虾青素晶型A稳定性好，抗氧化性强，可用于医疗、保健、化妆品等行业。由于本发明的新工艺操作简单、安全可靠、成本低廉，并且做到了两种应用形式的虾青素(虾青素和虾青素油)的同时制备，满足不同领域的需求，适合工业化生产和推广应用。
附图说明
图1是本发明制备的虾青素晶型A的X射线粉末衍射图(XPRD图)。
具体实施方式
现有技术的从红法夫酵母中提取的虾青素纯度达不到90％，包含有脂溶性杂质比如脂肪酸(虾青素油成分)等，置于空气中很容易氧化、薅败、产生异味，严重降低虾青素的品质，进而严重降低其使用价值和经济价值，一个重要的原因在于虾青素分子结构中存在许多不饱和键。
虾青素亦称虾黄素，是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸，属于一种类胡萝卜素，化学名3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，结构式如下。
Figure BDA0004034725860000051
虾青素是一种萜烯类不饱和化合物，由4个异戊二烯单位以共轭双键形式连接，两端又有2个异戊二烯单位组成的六节环结构。虾青素分子结构中的共轭双键链、共轭双键链末端的不饱和酮基和羟基，能吸引自由基未配对电子或向自由基提供电子，从而清除自由基起抗氧化作用，使得虾青素具有极强的抗氧化能力，但本身却又容易发生氧化反应。
通过实验比较发现，去除虾青素中的杂质虾青素油成分后，使得虾青素形成特定的晶型，能够提高虾青素的氧化反应周期，使得氧化变质速度显著降低。
在一些实施方案中，术语“(变质速度)降低”、“下降”或“减少”可以表示相较于参考水平(现有技术虾青素产品)降低至少10％，例如相较于参考水平降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或最高达并包括100％的降低。
化学领域公知，某些化学物质在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间键合方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构。不同晶型往往具有不同的物理、化学性质，如熔点、硬度、稳定性、溶解速率等的差异。晶型可由X射线粉末衍射(XPRD)光谱图来表征，不同晶型的XPRD图是不同的，以2θ角度表示的衍射峰或称吸收峰的位置会有变化。
X射线粉末衍射(XPRD)也称为粉末X射线衍射(PXRD)。
本发明的特定晶型A优选至少在8.381°±0.1°、13.693°±0.1°、16.841°±0.1°、19.754°±0.1°、25.892°±0.1°和27.683°±0.1°处存在衍射峰；更优选至少在8.381°、13.693°、16.841°、19.754°、25.892°和27.683°处存在衍射峰。
X射线粉末衍射(XPRD)也称为粉末X射线衍射(PXRD)。
进一步地，晶型A优选至少还在2θ值为10.261°±0.1°、12.325°±0.1°、21.521°±0.1°和22.863°±0.1°处存在衍射峰；更优选至少还在2θ值为10.261°、12.325°、21.521°和22.863°处存在衍射峰。
基于该研究发现，我们设计出先从菌体中分离出虾青素油、后提取纯化虾青素的工艺，使得两种物质都得到回收利用，使得原来被作为杂质被丟弃掉的虾青素油作为饲料添加剂得到充分利用。
经过实验对比发现，单独使用烷烃无法将大部分脂肪酸从菌渣中提取出来，单独使用醇溶剂无法将脂肪酸(虾青素油)和虾青素区别开来进行分别提取。烷烃(比如石油醚)和醇(比如乙醇)以合适的比例组成混合溶剂后，能够将绝大部分脂肪酸(虾青素油)从菌渣中提取出来、并且将绝大部分虾青素保留在菌渣中。
如本文中所用，术语“主要”、“大部分”或者“绝大部分”是指某一成分总含量中的80％以上、优选85％以上、更优选90％以上，更优选95％以上。
在该处理工序中，虾青素油的提取很大程度上降低了脂溶性杂质对虾青素结晶的影响，提高了后期结晶得到酵母虾青素晶体的纯度，实验证明虾青素油的先行提取是后面虾青素晶体提取收获率提高的关键，而且大大提高了虾青素干粉的纯度，晶体A纯度至少在93％以上，可用于医疗、保健、化妆品等行业。
提高微生物菌体中虾青素油和虾青素回收率的一个重要步骤是对细胞的破壁处理。细胞破壁方法有多种，各有利弊。研究发现：有机溶剂破壁比如二甲基亚砜破壁速度较快，但容易残留，残留的二甲基亚砜会导致虾青素油难以分离，对虾青素品质影响较大；酸法破壁或者碱法破壁容易引起虾青素发生反应，降低虾青素收率，而且对虾青素油形成一定破坏导致无法充分回收虾青素油而浪费；机械法破壁比如匀浆会导致有机溶剂难以充分提取浆糊状匀浆液中的虾青素和虾青素油，导致两种产物收率下降；酶法破壁反应速度较慢，但产物虾青素和虾青素油总体收率高，因此作为本发明的主要选择手段。
在酶法破壁研究中，针对红法夫酵母，我们比较了溶菌酶(细菌裂解酶，比如环状芽孢杆菌细胞壁溶解酶)、溶壁酶(酵母溶壁酶、酵母裂解酶)、纤维素酶、碱性蛋白酶、纤维素酶/碱性蛋白酶的复合酶、β-葡聚糖酶、几丁质酶、β-葡聚糖酶/几丁质酶复合酶等等三十多种酶，发现藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)来源的酵母溶壁酶的催化效果最好，破壁速度相对较快，破壁率高，虾青素和虾青素油的回收率最高，故在下述实施例中皆采用该藤黄节杆菌来源的酵母溶壁酶。
本发明的工艺中，使用的有机溶剂品种较少，例如仅需使用石油醚、乙醇、丙酮、二氯甲烷或三氯甲烷即可实施本发明的技术方案。这些有机溶剂都是廉价易得的最常用大宗化学试剂。
为了避免虾青素发生不必要的氧化副反应，优选将整个工艺的温度控制在50℃以下。发明人还对各个步骤的操作条件进行了优化，比如，为了提高结晶虾青素的收率，步骤(6)的丙酮结晶中除了将丙酮预冷至-5～5℃外，还应严格控制加料速度不能过快，边搅拌边缓慢、匀速加入冷丙酮。
以下通过实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明构思对其做出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。
实施例
实施例中所用到主要仪器设备：Agilent 1200型高效液相色谱仪(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)，美国安捷伦科技有限公司。SHJ-6AB型恒温水浴锅，金坛市良友仪器有限公司。
应用高效液相分析方法测定虾青素的含量。高效液相色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，检测波长478nm，柱温30℃，流动相：100％甲醇，进样量10μL，流速1mL/min。
采用细胞内虾青素的释放情况来检测破壁率。破壁率＝乙醇浸泡后虾青素含量/二甲基亚砜法的虾青素总含量×100％。具体地：乙醇法测定破壁红发夫酵母虾青素含量：取1mL红法夫酵母破壁处理液，加入15mL乙醇，超声浸泡20min，定容，过滤，检测虾青素含量。二甲基亚砜法测定破壁红法夫酵母虾青素含量：取1mL红法夫酵母破壁处理液，加入4mL二甲基亚砜，超声浸泡20min，定容，取1mL用乙醇稀释5倍，过滤，高效液相检测虾青素含量。
Figure BDA0004034725860000081
V油：酵母虾青素油体积
β油：酵母虾青素油中虾青素浓度
m：虾青素晶体重量
W：晶体中虾青素含量
V发酵液：发酵液体积
β发酵液：发酵液中虾青素浓度。
实施例1
取红法夫酵母细胞发酵液10L，单位为475μg/ml，加入10L水，搅拌均匀，离心得到湿菌渣。加入酶活为20U/mL的酵母溶壁酶的磷酸盐缓冲液5L，pH5.0，温度45℃条件下酶解3h，检测细胞破壁率约97.6％。喷塔进风温度190℃，出风温度85℃，喷雾干燥得到含水量3.5％的干菌渣。向干菌渣中加入4L石油醚和2L乙醇，50℃搅拌浸泡1h，过滤浸泡液50℃减压浓缩，除去溶剂，得到酵母虾青素油，过滤除去杂质，添加2g酯化维生素C，充氮密封保存。
剩余滤饼加入5L二氯甲烷，50℃搅拌浸泡1h，过滤得到浸泡液，菌渣继续加入5L二氯甲烷二次浸提，合并浸泡液，减压浓缩至0.5L，用蠕动泵缓慢匀速加入0℃的丙酮1L，控制速度为3L/h，温度0℃转速100rpm条件下搅拌，结晶1h。过滤得到滤饼，用0℃的丙酮顶洗两次，每次50mL，滤饼30℃减压干燥4h，收集虾青素晶体。
应用本方案共制备得到酵母虾青素油0.32L，经过HPLC检测虾青素含量为2.1g/L，制备得到酵母虾青素晶体4.2g，经过HPLC检测含量为93.6％，虾青素总收率96.8％。
对比例1
取红法夫酵母细胞发酵液10L，单位为470μg/ml，加入10L水，搅拌均匀，离心得到湿菌渣，加入酶活为20U/mL的酵母溶壁酶的磷酸盐缓冲液5L，pH5.0，温度45℃条件下酶解3h，细胞破壁率约97％，喷塔进风温度190℃，出风温度85℃，喷雾干燥得到含水量3.4％的干菌渣，向菌渣中加入4L石油醚和2L乙醇，50℃搅拌浸泡1h，过滤浸泡液50℃减压浓缩，除去溶剂，得到酵母虾青素油，过滤除去杂质，添加2g酯化维生素C，充氮密封保存。
剩余滤饼加入5L二氯甲烷，50℃搅拌浸泡1h，过滤得到浸泡液，菌渣继续加入5L二氯甲烷二次浸提，合并浸泡液，减压浓缩至0.5L，立刻加入0℃的丙酮1L，温度0℃转速100rpm条件下搅拌，结晶1h。过滤得到滤饼，用0℃的丙酮顶洗两次，每次50mL，滤饼30℃减压干燥4h，收集虾青素晶体。
应用本方案共制备得到酵母虾青素油0.324L，经过HPLC检测虾青素含量为2.0g/L，制备得到酵母虾青素晶体4.9g，经过HPLC检测含量为78.8％，虾青素总收率96.0％。
对比例1与实施例1对比可以得到结论：若丙酮速度过快，虾青素晶体纯度较低，推测晶体中包结有其他杂质或溶剂母液。
实施例2
取红法夫酵母细胞发酵液15L，单位491μg/ml，加入15L水，搅拌均匀，离心收集湿菌渣，加入酶活为50U/mL的酵母溶壁酶的磷酸盐缓冲液5L，pH5.0，40℃条件下酶解3h，检测细胞破壁率98.1％，喷塔进风温度190℃，出风温度88℃，喷雾干燥得到含水量3.5％的干菌渣，向菌渣中加入5L石油醚和5L甲醇，40℃搅拌浸泡1h，过滤浸泡液45℃减压浓缩，除去溶剂，得到酵母虾青素油，过滤除去杂质，添加4.5g酯化维生素C，充氮密封保存。
剩余滤饼加入10L三氯甲烷，40℃搅拌浸泡1h，过滤得到浸泡液，菌渣继续加入10L三氯甲烷二次浸提，合并浸泡液，减压浓缩至1L，用蠕动泵缓慢匀速加入-5℃的丙酮3L，控制速度为6L/h，温度-5℃转速200rpm条件下搅拌，结晶1h。过滤得到滤饼，用-5℃的丙酮顶洗两次，每次50mL，滤饼30℃减压干燥5h，收集酵母虾青素晶体。
应用本方案共制备得到酵母虾青素油0.450L，经过HPLC检测虾青素含量为2.3g/L，制备得到酵母虾青素晶体6.4g，经过HPLC检测含量为94.0％，虾青素总收率95.7％。
虾青素晶体的X射线粉末衍射图(XPRD图)如图1所示，定义为虾青素晶型A。
晶型A使用CuKα辐射、以2θ角度表示的XRPD光谱在8.381°±0.2°、10.261°±0.2°、12.325°±0.2°、13.693°±0.2°、16.841°±0.2°、19.754°±0.2°、21.521°±0.2°、22.863°±0.2°、25.892°±0.2°和27.683°±0.2°处存在衍射峰。
本工艺中第一步的酵母虾青素油的提取是第二步结晶的关键，通过酵母虾青素油的提取，来降低脂溶性杂质对虾青素结晶的影响，得到纯度很高酵母虾青素晶体。
对比例2
取红法夫酵母细胞发酵液15L，单位473μg/ml，加入15L水，搅拌均匀，离心收集湿菌渣，加入酶活为50U/mL的酵母溶壁酶的磷酸盐缓冲液5L，pH5.0，40℃条件下酶解3h，检测细胞破壁率97.9％，喷塔进风温度190℃，出风温度88℃，喷雾干燥得到含水量3.2％的干菌渣，向菌渣中加入10L三氯甲烷，40℃搅拌浸泡1h，过滤得到浸泡液，菌渣继续加入10L三氯甲烷二次浸提，合并浸泡液，减压浓缩至1L，用蠕动泵缓慢匀速加入-5℃的丙酮3L，控制速度为6L/h，温度-5℃转速200rpm条件下搅拌，结晶1h。过滤得到滤饼，用-5℃的丙酮顶洗两次，每次50mL，滤饼30℃减压干燥5h，收集酵母虾青素晶体。
制备得到酵母虾青素晶体9.5g，经过HPLC检测含量为66.8％，虾青素总收率89.4％。
对比例2与实施例2对比可以得到结论：前期的酵母虾青素油提取可以很大程度上提高虾青素晶体纯度，所以第一步的酵母虾青素油的提取是第二步结晶的关键。
对比例3
重复专利CN103848769B中结晶工艺，取实施例1的晶体粉3.0g用二氯甲烷溶解，体积100mL，缓慢加入甲醇，至有晶体析出，静止16h，使二氯甲烷自然挥发，在4℃条件下离心，减压干燥。
制备得到酵母虾青素晶体2.5g，经过HPLC检测含量为88.5％，虾青素总收率78.8％。
对比例4
重复专利CN103848769B中结晶工艺，取实施例2的晶体粉3.0g用二氯甲烷溶解，体积100mL，缓慢加入甲醇，至有晶体析出，静止6h，使二氯甲烷自然挥发，在4℃条件下离心，减压干燥。
制备得到酵母虾青素晶体2.0g，经过HPLC检测含量为94.1％，虾青素总收率66.7％。
实施例3
将实施例2的晶型A与对比例3和对比例4的晶体进行暴露空气下的化学稳定性比较试验，结果见表1。
表1、实施例2晶型A与专利CN103848769B虾青素晶体的稳定性比较结果
Figure BDA0004034725860000101
Figure BDA0004034725860000111
由表1可见，当暴露于空气中7天后，现有技术的虾青素晶体的纯度已经降低为不到最初纯度的70％，但晶型A的纯度仍能保持80％以上，表明虾青素晶型A抗氧化性更高，化学稳定性明显高于现有技术的虾青素晶体。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容，均应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种从菌体中提取虾青素油和虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在产虾青素的微生物的湿菌渣中，加入溶壁酶，于适合酶反应的条件下进行酶解反应，得到酶解液；
(2)对步骤(1)中得到的酶解液进行干燥，得到干菌渣；
(3)将步骤(2)中得到的干菌渣用第一溶剂浸提，固液分离得到浸提液A和菌渣A；
(4)将步骤(3)中得到的浸提液A减压浓缩除去溶剂得到油状物，过滤，除去固形物即得虾青素油；
(5)将步骤(3)中得到的菌渣A用第二溶剂浸提，固液分离得到浸提液B和菌渣B；
(6)将步骤(5)中得到的浸提液B减压浓缩后，加入第三溶剂即结晶溶剂，在-5～5℃下结晶，过滤，即得虾青素晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：
(7)在步骤(6)的结晶过滤后，滤饼用顶洗溶剂顶洗，减压干燥，得到虾青素晶体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是红法夫酵母。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶壁酶是藤黄节杆菌来源的酵母溶壁酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的所述干燥选自喷雾干燥、沸腾床干燥、烘干、吹干。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的第一溶剂是烷烃与醇以体积比1～5：1的混合溶剂，所述烷烃选自下组：石油醚、正己烷、环己烷、它们中两种以上的混合物；所述醇选自下组：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、3-戊醇、2-戊醇、叔戊醇、2-甲基丁醇、3-甲基-3-戊醇、异戊二醇、它们中两种以上的混合物；
步骤(5)中的第二溶剂选自下组：二氯甲烷、三氯甲烷、它们的混合物；
步骤(6)中的第三溶剂选自下组：酮类、醇类、它们中两种以上的混合物；所述酮类选自丙酮、2-丁酮、戊-2-酮、戊-3-酮、己-2-酮或者己-3-酮。
步骤(7)中的顶洗溶剂与第三溶剂相同，选自下组：酮类、醇类、它们中两种以上的混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中所述的固液分离是过滤或者离心分离。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中所述的浸提是指恒温搅拌浸提。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所得虾青素油中进一步加入抗氧化剂，充氮密封。
10.一种虾青素晶型A，其通过如权利要求1-9中任一项所述的方法制备，其特征在于，使用CuKα辐射、以2θ角度表示的XRPD光谱至少在8.381°±0.2°、13.693°±0.2°、16.841°±0.2°、19.754°±0.2°、25.892°±0.2°和27.683°±0.2°处存在衍射峰。
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