CN116024330A - miR-137-3p在薄型子宫内膜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，公开了miR‑137‑3p在薄型子宫内膜中的应用。通过细胞功能实验及细胞功能相关基因、蛋白表达的检测及验证得出：miR‑137‑3p或其模拟物具有促进脐带间充质干细胞(HucMSC)向子宫内膜腺上皮细胞(EEC)分化以及促进HucMSC迁移的作用，为薄型子宫内膜的诊断、预防及治疗提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-137-3p在薄型子宫内膜中的应用。
背景技术
干细胞(stem cells)及其分泌的外泌体(Exosome)在子宫内膜损伤修复中发挥重要的调控作用：一方面，干细胞本身具有自我修复和分化潜能，在受损组织部位可以分化为该组织细胞，起到组织修复作用；另一方面，研究发现干细胞分泌的外泌体对受损组织部位细胞的修复功能具有调控作用，如促进细胞增殖，抑制细胞凋亡和迁移等功能，两方面因素共同作用促进受损细胞功能的改善或恢复。
薄型子宫内膜影响胚胎种植，在导致薄型子宫内膜发生的众多因素中，子宫内膜细胞缺血或血流速度减慢导致内膜细胞缺氧而损伤是致病因素之一。已知薄型子宫内膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)和整合素β3等与细胞生长及其血管生成相关的因子表达显著降低；使用干细胞治疗后，VEGF、LIF和整合素β3等分子的表达明显上升，与正常组织水平相当。但是，干细胞如何修复薄型子宫内膜的机制研究尚不够深入，干细胞是否在薄型子宫内膜病理状态下接收到薄型子宫内膜的求救信号，引起再生迁移活性增加，并促进自身分化，以作用于受损的子宫内膜细胞的机制亦不清晰。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了miR-137-3p在薄型子宫内膜中的应用，探究薄型子宫内膜病理状态下，子宫内膜腺上皮细胞(EEC)是否分泌外泌体(Exosome)形式的求救信号，外泌体携带miRNAs核酸小分子，被脐带间充质干细胞(HucMSC)摄取后，启动干细胞的迁移及治疗作用，以期给治疗薄型子宫内膜提供科学的依据和借鉴意义。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供的miR-137-3p在薄型子宫内膜中的应用，从细胞功能和微型信使核糖核酸(micro messengerribonucleic acid，miRNA)两方面探究了缺氧损伤子宫内膜腺上皮细胞(EECD)分泌的外泌体促进脐带间充质干细胞(HucMSC)迁移和定向向EEC细胞分化的分子机理。
首先，本发明提供了检测miR-137-3p表达水平的试剂在制备诊断薄型子宫内膜的产品中的应用。
优选的，所述miR-137-3p在薄型子宫内膜患者的HucMSC中显著上调表达。
优选的，所述检测miR-137-3p表达水平的试剂包括检测miR-137-3p的特异性引物。
优选的，所述检测miR-137-3p的特异性引物为SEQ ID NO:2-6所示的序列。
进一步地，本发明还提供了一种促进HucMSC向EEC分化和/或促进HucMSC迁移的生物制剂，所述生物制剂包含过表达miR-137-3p的物质。
优选的，所述生物制剂还包含缺氧损伤子宫内膜腺上皮细胞(EECD)分泌的外泌体。
进一步地，本发明还提供了前文所述的生物制剂在预防和/或治疗薄型子宫内膜产品中的应用。
优选的，所述薄型子宫内膜的类型为由子宫内膜细胞缺氧损伤引起的薄型子宫内膜。
优选的，miR-137-3p通过促进HucMSC向EEC分化和/或促进HucMSC迁移预防和治疗薄型子宫内膜。
进一步地，本发明还提供了预防和/或治疗由子宫内膜细胞缺氧损伤引起的薄型子宫内膜的药物组合物，所述药物组合物包含过表达miR-137-3p的物质。
优选的，前文所述miR-137-3p的序列如SEQ ID NO:1所示。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明通过转录组测序技术(RNA-Sequence)筛选出miR-137-3p，经细胞功能实验和WB实验显示，miR-137-3p可通过促进HucMSC向EEC分化和/或促进HucMSC迁移治疗薄型子宫内膜，为薄型子宫内膜的诊断、预防及治疗提供了新的思路。
附图说明
图1为EEC-ex与HucMSC共培养后细胞迁移实验结果图。
图2为EECD-ex与HucMSC共培养后细胞迁移实验结果图。
图3为EEC-ex和EECD-ex对HucMSC细胞迁移能力影响的对比结果图；
图4为EEC-ex和EECD-ex对HucMSC细胞划痕实验的影响结果图；****表示p<0.01；
图5为miR-137-3p的转录表达水平趋势图；****表示p<0.01；
图6为WB检测EEC和HucMSC指标的表达情况图；
图7为EEC和HucMSC指标的表达柱状图；
图8为miR-137-3p促进HucMSC迁移的细胞迁移实验结果图；
图9为miR-137-3p促进HucMSC迁移的细胞划痕实验结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1细胞功能实验验证EECD分泌的外泌体对HucMSC的影响
1.细胞迁移实验
(1)EEC及EECD的培养：购买子宫内膜腺上皮原代细胞(武汉普诺赛生物，CM-H058)，使用普诺赛(Procell)配套的专用生长培养基及细胞培养操作方法。采用胰酶消化法进行传代培养，待EEC密度增长至80％～90％，使用胰酶消化、计数接种至六孔板，每组5×105/孔，分别在常氧(95％氧浓度)和缺氧(1％氧浓度)条件下培养，培养至细胞融合度至95％左右时，分别用胰酶消化，收集两组细胞进行后续研究。
(2)分别提取EEC和EECD上清外泌体：
①超净台操作，取细胞培养液，分装灭菌后的离心瓶或离心管，低温离心机4℃，1000×g离心10min，去除培养液中的细胞培养上清、碎片和死细胞；
②然后，超净台操作，上清通过0.2mm滤器过滤，分装灭菌后的离心瓶；
③将上清培养液在超高速离心机，4℃，100,000×g，离心3h；
④超净台内，弃掉上清，加入10ml PBS，超高速离心机，4℃，100,000×g洗涤90min；
⑤超净台内弃掉PBS，管底含外泌体的颗粒用50μl PBS重悬，转移至灭菌进口1.5ml EP管，并进行BCA定量，封口膜封口，转移至-80℃保存备用。
(3)EEC和EECD外泌体(EEC-ex和EECD-ex)与HucMSC共培养检测细胞迁移
①制备细胞悬液前将EEC和EECD外泌体按照2μg/孔加入HucMSC中，对照组不加外泌体，外泌体与HucMSC共培养48h后，消化细胞制备细胞悬液。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105cells/ml。
③取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
④24孔板下室加入600μl含20％FBS的培养基。
⑤常规培养12h-48h，观察不同时间点下不同组处理的HucMSC细胞迁移能力差异。
图1和图2分别为EEC-ex和EECD-ex与HucMSC共培养后的细胞迁移实验结果图；图3为EEC-ex和EECD-ex对HucMSC细胞迁移能力影响的对比结果图。从图1-3可以看出，EEC-ex+HucMSC组和EECD-ex+HucMSC组共培养后发现，EECD-ex+HucMSC组的HucMSC细胞迁移能力明显增强。
2.细胞划痕实验
①制备细胞悬液前将EEC和EECD外泌体按照2μg/孔加入HucMSC中，细胞铺于6孔板中，对照组不加外泌体，外泌体与HucMSC共培养48h。
②共培养后的HucMSC细胞，使用无菌消杀的黄色枪头，与移液器接触的一端，沿着孔板正中央竖向划一道，使细胞出现断裂带。
③观察细胞增殖情况，每隔24h拍取划痕部位的照片，记录每个时间点，每组别断裂带的距离，观察到细胞断裂带闭合后停止观察，并进行统计学分析。
结果如图4所示，与EEC-ex+HucMSC组相比，在培养24小时和36小时EECD-ex+HucMSC组的细胞划痕间隙明显减小，说明迁移活性增加。
通过细胞迁移实验和细胞划痕实验，表明EECD分泌的外泌体有助于增强HucMSC细胞的迁移能力。
实施例2细胞功能相关基因、蛋白表达的检测及验证
1.RNA-Sequence测序，发现miRNAs差异表达
①培养HucMSC干细胞，扩增后铺到6孔板中，每组准备三个生物学重复，备用。
②将EECD外泌体和EEC-外泌体按照2μg/孔加入HucMSC中，对照组不加外泌体，外泌体与HucMSC共培养48h。
③共培养后的HucMSC弃去上清，PBS洗2遍，加入Trizol试剂，1ml/孔，冰上裂解细胞10min后，转移上清至-80℃冰箱冻存备用。
④分别提取HucMSC组、EEC-ex+HucMSC组和EECD-ex+HucMSC组中三种不同的HucMSC的total-RNA进行RNA-Sequence测序，寻找差异表达的miRNA。
测序发现差异表达miRNAs：miR-137-3p。miR-137-3p序列：UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG(SEQ ID NO:1)。
2.RT-qPCR验证HucMSC组、EEC-ex+HucMSC组和EECD-ex+HucMSC组的差异表达miRNAs
(1)收集细胞
①分别收集各组细胞至适当离心管中，细胞数至少要1×106。
②离心，离心时间和转速大小根据实验目的设定，例如1000rpm,8min(10ml离心管)或5500rpm,1min(1.5mlEP管)。
③弃上清，弹匀管底的细胞沉淀，加入1ml PBS，转移至1.5ml RNAase-free EP管中，5500rpm离心1min。
④吸弃上清，弹匀沉淀，用1ml RNAase-free枪尖加入1ml TRIzon Reagent(加入TRIzon的量可根据细胞数目调整)，立即涡旋震荡15s使其充分混匀，室温静置10min以上或放-20℃冰箱备用。
(2)提取细胞中总RNA
注意：由于空气中到处存在RNA酶，所以全程必需带口罩操作，以避免RNA降解。
打开4℃离心机预冷，用RNAase-free枪尖加200μl氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡混匀15s,室温放置5min，(氯仿的作用—a.有机溶剂使蛋白质变性；b.抽提残留苯酚到有机相中以除去；c.除去脂溶性杂质)
4℃，12000rpm离心15min。在这过程中找新的1.5ml进口EP管，加500μl异丙醇，放4℃冰箱预冷。
离心后液体分为三层，RNA在最上层水相中，中间白膜层主要为DNA，下层有机相主要为蛋白质。用200μl移液枪小心分次取上层水相，加入到预冷的500μl异丙醇中，上下颠倒混匀，室温放置10min。(异丙醇的作用—通过-OH的疏水作用使RNA的亲水基团受到保护)
4℃，12000rpm离心10min。在这过程中配制75％乙醇(每个样品用1ml)，4℃冰箱预冷。
弃上清，每个EP管加入75％乙醇1ml，上下颠倒混匀。
4℃，12000rpm离心5min。小心吸弃上清，不要吸到沉淀，室温放置2-5min，使乙醇挥发，用10ulRNAase-free水溶解沉淀，取2μl测浓度和纯度，同时准备反转录试剂。
(3)将RNA反转录为cDNA
①反转录体系为20μl:
②用200μlPCR反应管，将上述液体全加入后，充分混匀。
③根据实验目的和所用反转录试剂盒说明书设定反转录条件，例如使用全式金牌反转录试剂盒，用Random Primer时，反转录程序为：
④所得cDNA若长期保存放-20℃冰箱，短期使用可放4℃。
(4)RT-qPCR
①将反转录为cDNA的样品稀释适当倍数(例如测得RNA浓度为1000ng/μl，可稀释15倍，即将反转录体系20μl加入到280μl灭菌注射用水中，混匀备用)。
②计算本次实验所需八连排孔数＝样品数*3(每个样品3个复孔)*n(所检测的基因数)。
③20μl体系:
a.2*Ultra SYBR mixture 10μl
b.Forward/Reverse primer各0.25μl共计0.5μl
c.cDNA样品9.5μl
④打开Q-PCR仪预热。将上述液体全部加入八连排PCR管后，用新的手套将盖子盖好，做好标记，用手指轻轻弹匀，短暂离心，注意不能产生气泡。
⑤把PCR管放入Q-PCR仪中，
e.95℃起，每个循环下降0.5℃，每次历时30s,降至60℃止，共需71cycles。
miR-137-3p引物如下：
反应结束后，用iQ5软件分析溶解曲线和扩增曲线，使用2-ΔΔCt法计算结果。
结果如图5所示，相对于HucMSC组和EEC-ex+HucMSC组，EECD-ex+HucMSC组中miR-137-3p显著高表达。
3.miR-137-3p促进HucMSC向EEC分化
合成miR-137-3p mimic慢病毒，感染HucMSC细胞，对照组感染miR-NC慢病毒，转染72h后，收取细胞总蛋白，WB检测EEC和HucMSC指标的表达。
合成miR-137-3p mimic序列如下所示：
CGAGCAGCAAGAGTTCTGGTGGCGGCGGCGGCGGCAGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGCAGCTTGGTCCTCTGACTCTCTTCGGTGACGGGTATTCTTGGGTGGATAATACGGATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGGAGAGTACCAGCGGCAGGGGGGCAGCGGCCGCCCTCCCCAGCCCACCAGCTGGCCACTAAACGCCCGTGGTTGCCAAGGTAGCACTTTCTTGTTCTTTTC(SEQ ID NO:7)
结果如图6和图7所示：HucMSC标志物指标CD13、Vimentin表达下调，EEC标志物指标CD9、CK19表达上调，说明miR-137-3p促进HucMSC向EEC的特异性分化，以达到治疗薄型子宫内膜的目的。
4.miR-137-3p促进HucMSC迁移
同样合成miR-137-3p mimic慢病毒，感染HucMSC细胞，对照组感染miR-NC慢病毒，转染48h后，分别做划痕和Transwell迁移实验。
结果如图8和图9所示，感染miR-137-3p Mimic后，细胞迁移能力显著增强，说明miR-137-3p促进HucMSC迁移。
综合以上实验可得：miR-137-3p可通过促进HucMSC向EEC分化和/或促进HucMSC迁移治疗薄型子宫内膜，为薄型子宫内膜的诊断、预防及治疗提供了新的思路。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.检测miR-137-3p表达水平的试剂在制备诊断薄型子宫内膜的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-137-3p在薄型子宫内膜患者的HucMSC中显著上调表达。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测miR-137-3p表达水平的试剂包括检测miR-137-3p的特异性引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测miR-137-3p的特异性引物为SEQID NO:2-6所示的序列。
5.一种促进HucMSC向EEC分化和/或促进HucMSC迁移的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含过表达miR-137-3p的物质。
6.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂还包含缺氧损伤子宫内膜腺上皮细胞分泌的外泌体。
7.权利要求5或6所述的生物制剂在预防和/或治疗薄型子宫内膜产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述薄型子宫内膜的类型为由子宫内膜细胞缺氧损伤引起的薄型子宫内膜。
9.预防和/或治疗由子宫内膜细胞缺氧损伤引起的薄型子宫内膜的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含过表达miR-137-3p的物质。
10.根据权利要求1所述的应用或权利要求5所述的生物制剂或权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述miR-137-3p的序列如SEQ ID NO:1所示。
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