CN116023447A

CN116023447A - 一种基于BmoR突变体的宽域生物传感器

Info

Publication number: CN116023447A
Application number: CN202111239461.0A
Authority: CN
Inventors: 霍毅欣; 陈振娅; 毋彤
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种对高级醇具有更宽检测范围(0‑200mM)的BmoR蛋白突变体，及其在高级醇检测或生物传感器中的应用。所述BmoR蛋白突变体是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上发生T12N突变获得的，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列T12N突变体对高级醇具有更宽检测范围(0‑200mM)，解决了野生型BmoR蛋白无法筛选高级醇高产菌株的问题，可用于更高产量菌株的筛选和应用。

Description

一种基于BmoR突变体的宽域生物传感器

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种对高级醇具有更宽检测范围(0-200mM) 的BmoR突变体，及其在高级醇检测或生物传感器中的应用。

背景技术：

微生物合成的高级醇是重要的运输燃料，通过代谢工程合成的高级醇在许多微生物宿主中实现，而改造宿主菌株并筛选出高产宿主是实现高级醇工业化生产的基础和关键。生物传感器能够特异性响应目标化合物从而输出便于检测的蛋白信号，因而已经被广泛应用于高通量筛选。但野生型转录因子BmoR由于其响应特异性差、检测范围窄，无法广泛应用于生物传感器及工业化生产中。而本发明通过蛋白质改造得到的BmoR蛋白实现了对高级醇的更高检测浓度上限及响应强度，最重要的是可以用于筛选高级醇的高产菌株，从而满足工业需求。

作为新一代生物燃料，高级醇被用于诸多领域中，同时已经在多个微生物宿主中实现生物合成，但对更高产量的高级醇进行筛选仍是一件繁琐的工程。野生型转录因子BmoR对底物高级醇的最高响应浓度仅为40mM，无法对更高浓度的醇分子进行检测，从而满足工业需求。因此实现对醇的更宽检测范围成为一大难题。

生物传感器由分子识别元件和信号转换器组成。当分子识别元件与被测物体结合时，所产生的信号可以通过转换器转换为光信号或电信号，可对被测物进行检测和分析。作为一种合成生物学新兴工具，可以通过设计构建生物传感器来动态的响应信号分子浓度的变化。与此同时，生物传感器的设计是为了促进微生物细胞工厂的优化和生产一系列广泛应用于工业的天然产品，如衣康酸、脂肪酸、异丁醇、正丁醇和生物碱。生物传感器主要包括RNA核酸开关、转录因子调控的生物传感器、G蛋白偶联受体以及荧光蛋白生物传感器。而荧光蛋白生物传感器的低动态范围、RNA核酸开关难以在体外进行、G蛋白偶联受体仅能在胞外进行等弊端阻碍了生物传感器在生物界的发展。

基于转录因子(TF)的生物传感器应用最为广泛。最常用的转录因子是细菌转录因子，包括配体结合结构域(LBD)或代谢结合结构域(MBD)和DNA结合结构域(DBD)。BmoR是假单胞菌正链烷烃代谢途径的转录因子，是bEBP的成员，用于调节烷烃单加氧酶的σ⁵⁴依赖型启动子P_bmo，信号分子是C2-C5的直链或支链醇。基于BmoR的生物传感器可用于筛选高产正丁醇或异丁醇菌株，但野生型BmoR生物传感器的响应特异性太差、检测范围太窄(0-40mM)，无法用于工业生产中。因此对生物传感器的改造为高效检测高级醇生产和快速筛选高产菌株提供了一种解决方案。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可以检测更高浓度高级醇的BmoR蛋白及生物传感器，利用易错PCR技术构建随机突变文库；通过外源添加正丁醇和异丁醇，使其终浓度为0-200mM，对突变库进行筛选分析。最终得到了一种能够检测0-200mM高级醇的BmoR突变体蛋白。

进一步地，所述能够检测0-200mM高级醇的BmoR突变体蛋白，是在序列表SEQ IDNO.1 所示的野生型BmoR蛋白的基础上发生T12N突变获得的，以下简称T12N突变体，所述突变体蛋白具体为：所示的氨基酸序列；或

(1)序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.3同源性75％以上的氨基酸序列；或

(3)在SEQ ID NO.3的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.3相同功能的氨基酸序列。

进一步地，本发明还提供T12N突变体的编码基因；

更进一步地，所述编码基因如序列表SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一目的是提供T12N突变体的应用，特别是在检测含高级醇的样品，或筛选高级醇生产菌株的传感器中的应用，更特别地，是在构建检测高级醇的生物传感器中的应用；

进一步地，所述生物传感器是基于T12N突变体的生物传感器，所述传感器是包含T12N 突变体编码基因及其启动子、启动子P_bmo及报告基因的表达元件；启动子启动bmoR基因表达，BmoR蛋白与醇分子结合形成六聚体，进而启动下游启动子P_bmo，从而表达报告基因，产生荧光等信号；所述生物传感器能够实现在0-200mM对高级醇的响应和筛选，进一步应用于工业生产中，实现对含高级醇的样品，及实现对高级醇的高产菌株的筛选；

进一步地，所述突变体编码基因的启动子包括但不限于P_bmoR、P_tac、P_T7、P_LlacO1等；

进一步地，所述报告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp等基因；

优选地，所述表达元件为包含T12N突变体编码基因及其启动子P_bmoR、启动子P_bmo及gfp报告基因的重组质粒；进一步地，所述重组质粒可选用的表达载体包括但不限于本领域通用的表达载体；

更优选地，所述生物传感器是将质粒pYH1上的野生型BmoR蛋白编码基因替换为T12N 突变体编码基因所得，也即，将由P_bmoR启动的T12N突变体编码基因连接至colE1复制起始位点、amp^r和P_bmo驱动的gfp基因所得；

进一步地，所述菌株包括但不限于大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等；

进一步地，所述启动子P_bmoR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；

进一步地，所述启动子P_bmo的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；

进一步地，所述gfp报告基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供上述生物传感器在高级醇检测中的应用，特别是异丁醇生产菌株筛选中的应用，通过将上述质粒导入生产菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等，用以检测高级醇的产生。

有益效果：

野生型BmoR的检测范围过窄，对高级醇的检测范围仅为0-40mM，在底物浓度达到40 mM时响应将达到饱和，因此无法用于鉴别高级醇浓度高于40mM的菌株。而本发明提供的T12N突变体对高级醇的检测范围达到0-200mM，提高了BmoR蛋白对高级醇的响应饱和度，可用于高级醇高水平生产菌株的筛选和应用。

附图说明：

图1为原理流程图；

首先通过易错PCR对野生型bmoR的N端前1000bp进行随机突变，得到BmoR的随机突变库；在bmoR基因下游加入GFP荧光蛋白，可通过检测荧光强度来反映突变体BmoR对高级醇的响应情况。通过添加不同浓度的正丁醇或异丁醇，检测突变体BmoR对于醇分子的响应。

图2为BmoR突变体及野生型对0-200mM正丁醇和异丁醇的响应情况；

图3为BmoR突变体及野生型在异丁醇生产菌株中对异丁醇的响应情况；

图4为BmoR突变体及野生型在三个不同异丁醇产量下的响应情况；

图5为T12N突变体与正丁醇和异丁醇的分子对接情况。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明提供的生物传感器是基于T12N突变体的生物传感器，所述传感器是包含T12N 突变体编码基因及其启动子、启动子P_bmo及报告基因的表达元件；启动子启动bmoR基因表达，BmoR蛋白与醇分子结合形成六聚体，进而启动下游启动子P_bmo，从而表达报告基因，产生荧光等信号。本领域工作人员可根据实际情况在现有技术中选择启动子启动BmoR突变体基因的表达，如采用P_bmoR、P_tac、P_T7、P_LlacO1等启动子。所述的报告基因也可以有多种选择，本领域常用的能够产生可视化检测信号、或可供检测的小分子物质的蛋白分子，如荧光蛋白、颜色蛋白等均可实现本发明所述生物传感器的响应，优选地，如gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp等。上述传感器中还包含复制起始位点等实现表达的必要元件，优选地，如colE1复制起始位点等。上述传感器中还可以包含抗性基因等标记，如amp^r等，便于筛选。本领域技术人员还可根据实际需求对上述传感器增加其他元件，如将上述元件构建至现有技术中的表达载体上，如pET、pUC19、pMAL等，获得可作为传感器的重组质粒。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。

以下将通过具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1BmoR突变体T12N的筛选

构建转录因子BmoR的随机突变文库

(1)以带有野生型BmoR编码基因(SEQ ID NO.2所示)的质粒pYH1(构建见DOI：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.08.015；https://doi.org/10.1186/s12934-019-1084-2)为模板，通过易错PCR扩增得到bmoR突变体基因(通过在PCR体系中添加Mn²⁺，提高PCR体系中 Mg²⁺浓度并调整dNTP的比例来引入随机突变。配制10×不均衡dNTPs混合液，其中dCTP， dTTP的浓度是dATP，dGTP的四倍。PCR程序设置如下：94℃预变性2min，30个扩增循环中包括：95℃变性1min，55-68℃退火1min，按照每分钟1kb的扩增速度确定合适延伸时间，延伸温度为72℃。保存温度设为16℃。)；通过凝胶电泳对PCR产物进行确认，并进行回收纯化；将纯化产物放置于37℃水浴锅中，DpnI(1μL/50μL纯化产物)消化1-2h。取2μL bmoR突变体片段，3μL pYH1骨架(也可采用构建有P_bmoR、P_bmo、gfp荧光蛋白基因的质粒作为骨架，与pYH1骨架效果等价)及5μL Gibson Assemble Mix，混合后放置于50℃水浴锅中连接1h。取5-10μL的连接产物转入50μL大肠杆菌XL10-Gold化转感受态细胞中， 37℃过夜培养，得到BmoR-1000bp突变库。

(2)挑取平板上的单菌落，接种到5mL LB(100μg/mL Amp)液体培养基中，37℃，220rpm培养8h作为种子液。使用96深孔板中进行初筛。每个孔先加入950μL新鲜的LB (100μg/mL Amp)培养基；向孔中分别加入正丁醇或异丁醇，使其终浓度为0-200mM；最后分别吸取50μL种子液接种到每个孔中。封好封口膜后，将深孔板放置于30℃，220rpm 摇床中培养16h。

(3)使用微孔板对荧光强度GFP和OD₆₀₀进行检测：吹打混匀菌液，吸取200μL放入酶标仪中，30℃定量检测，设置参数为：470nm激发波长，510nm发射波长，增益值为50；得到的GFP和OD₆₀₀值首先减去背景对照值，在此基础上计算每个孔的GFP/OD₆₀₀作为相对荧光强度值。

(4)分析初筛结果后，对有效突变菌的质粒进行测序。

确定其中之一含BmoR蛋白的氨基酸突变位点为S240P(氨基酸序列如序列表SEQID NO.3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4)，该突变体的GFP/OD₆₀₀初筛结果如图2所示，可知相对于野生型BmoR，T12N突变体能够响应至200mM的正丁醇和异丁醇。

实施例2摇瓶发酵实验测定野生型和突变体对异丁醇检测限的变化

基于野生型BmoR的生物传感器能实现对0-40mM高级醇的响应，并对正丁醇和异丁醇均有响应；当底物浓度高于40mM后，响应值趋于饱和，无法对更高浓度的醇分子进行响应。以下通过实验验证基于T12N突变体的BmoR生物传感器对0-200mM高级醇的响应。

通过外源梯度实验进一步验证突变体特性的基础上，对含有T12N突变的菌株进行异丁醇摇瓶发酵实验，测定异丁醇的产量及突变体对不同产量异丁醇的响应值。

将异丁醇合成途径(kivd,adhA,alsS,ilvC,ilvD)转入实验室保藏的大肠杆菌菌株JCL260 中，将其做成感受态细胞，进一步将带有野生型BmoR的质粒及突变体T12N的质粒分别转入感受态细胞中，即将野生型BmoR及突变体生物传感系统导入到异丁醇生产途径中，对异丁醇的产量进行实时的检测和响应。

分别挑取含野生型BmoR或突变体T12N的JCL260单菌落，接种到5mL LB(100μg/mLAmp，25μg/mL Cm和50μg/mL Kana)液体培养基中，37℃，220rpm培养8h作为种子液。取200μL种子液接种至200mL的M9(40％葡萄糖，4g/L酵母提取物及0.1mM IPTG) 培养基中，30℃，220rpm培养，在12，24，36，48，60，72及84小时各自取样1mL。

样品处理：使用微孔板对荧光强度GFP和OD₆₀₀进行检测。在1mL菌液中取200μL，放入酶标仪中，30℃定量检测，设置参数为：470nm激发波长和510nm发射波长，增益值为50；得到的GFP和OD₆₀₀值首先减去背景对照值，在此基础上计算每个孔的GFP/OD₆₀₀作为相对荧光强度值。

剩余的菌液12000rpm离心10min，取100μL上清液加到气相小瓶的套管里面，再加入配制好的1g/L正戊醇作为气相色谱的检测的内标，拧好气相小瓶的盖子，充分震荡均匀。

气相色谱检测程序：使用常州磐诺仪器公司的A91气相色谱仪(GC)和DB-FFAP毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm；安捷伦科技)进行异丁醇定量测定。GC炉温最初在80℃保持3分钟，随后以115℃每分钟的梯度升高至230℃，最后保持1分钟。载气为氮气，保持进样器和检测器温度分别为250℃和280℃。进样器进样量为0.2μL，分流比为30：1。使用正戊醇作为内标。发酵样品用同样的程序检测，以标品为参照，用软件批处理功能通过内标法计算每个样品的异丁醇含量。

以GFP/OD₆₀₀为左纵坐标，异丁醇产量为右纵坐标，以取样时间为横坐标，用OriginPro 8.5或GraphPad Prism 8软件作图，对数据处理分析，比较不同取样时间里异丁醇的产量，及在该产量下野生型BmoR与突变体T12N对异丁醇的响应情况(图3)。

在0-200mM底物浓度下，突变体T12N在150mM下的响应值与在200mM下的响应值呈显著差异。通过OriginPro 8.5进行做图，野生型BmoR在0-100mM底物浓度下，对正丁醇的K_m为3.78mM，对异丁醇的K_m为4.24mM；T12N突变体对正丁醇的K_m值为36.4mM，对异丁醇的K_m值62.6mM，与野生型相比，分别提高了9.63倍及14.8倍，说明T12N突变体对高级醇的检测上限提高至200mM，与野生型相比提高了5倍。

为进一步验证T12N突变体对高级醇的响应情况，将该突变体引入异丁醇合成途径中进行摇瓶发酵实验。T12N突变体在72h和84h时的荧光响应呈显著差异，并在84h达到835，此时的异丁醇产量为215mM。野生型在发酵前36h对异丁醇的响应值处于上升水平，并在第36h达到681，此时的异丁醇产量为67mM。在36-84h之间，异丁醇产量仍持续升高，但野生型BmoR的荧光响应没有明显的变化。证明在异丁醇生产菌株中，野生型BmoR对异丁醇的检测上限在70mM左右，T12N突变体对异丁醇的检测上限在200mM左右，与外源添加实验的实验结果保持一致，如图4所示。

实施例3模型分析

对T12N突变体进行测序，分析突变位点上氨基酸的变化，同时使用AUTODOCK及ChimeraX等软件对BmoR突变体进行建模，并将突变体分别与底物小分子正丁醇和异丁醇进行对接，分析突变体与这两种醇的结合位点和氢键的形成情况。

以野生型BmoR蛋白质三维结构为模板，对T12N突变体进行同源建模，同源率为99.9％。进一步将突变体结构与底物分子(正丁醇或异丁醇)进行分子对接。结果表明，在复合体中，结果表明，在复合体中，该突变体与异丁醇共2个氢键相互作用(Asn259，Glu261)，同时与正丁醇形成一个氢键(Arg211)，说明正丁醇和异丁醇都能紧密与该突变体结合，与K_m值分析结果保持一致(图5)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种基于BmoR突变体的宽域生物传感器

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> PRT

<213> Pseudomonas butanovora

<400> 1

Met Ser Lys Met Gln Glu Phe Ala Arg Leu Glu Thr Val Ala Ser Met

1 5 10 15

Arg Arg Ala Val Trp Asp Gly Asn Glu Cys Gln Pro Gly Lys Val Ala

20 25 30

Asp Val Val Leu Arg Ser Trp Thr Arg Cys Arg Ala Glu Gly Val Val

35 40 45

Pro Asn Ala Arg Gln Glu Phe Asp Pro Ile Pro Arg Thr Ala Leu Asp

50 55 60

Glu Thr Val Glu Ala Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ala Ala Glu Pro Val

65 70 75 80

Val Asp Ala Leu Met Glu Gln Met Asn Asp Ala Pro Arg Met Ile Ile

85 90 95

Leu Asn Asp Glu Arg Gly Val Val Leu Leu Asn Gln Gly Asn Asp Thr

100 105 110

Leu Leu Glu Asp Ala Arg Arg Arg Ala Val Arg Val Gly Val Cys Trp

115 120 125

Asp Glu His Ala Arg Gly Thr Asn Ala Met Gly Thr Ala Leu Ala Glu

130 135 140

Arg Arg Pro Val Ala Ile His Gly Ala Glu His Tyr Leu Glu Ser Asn

145 150 155 160

Thr Ile Phe Thr Cys Thr Ala Ala Pro Ile Tyr Asp Pro Phe Gly Glu

165 170 175

Phe Thr Gly Ile Leu Asp Ile Ser Gly Tyr Ala Gly Asp Met Gly Pro

180 185 190

Val Pro Ile Pro Phe Val Gln Met Ala Val Gln Phe Ile Glu Asn Gln

195 200 205

Leu Phe Arg Gln Thr Phe Ala Asp Cys Ile Leu Leu His Phe His Val

210 215 220

Arg Pro Asp Phe Val Gly Thr Met Arg Glu Gly Ile Ala Val Leu Ser

225 230 235 240

Arg Glu Gly Thr Ile Val Ser Met Asn Arg Ala Gly Leu Lys Ile Ala

245 250 255

Gly Leu Asn Leu Glu Ala Val Ala Asp His Arg Phe Asp Ser Val Phe

260 265 270

Asp Leu Asn Phe Gly Ala Phe Leu Asp His Val Arg Gln Ser Ala Phe

275 280 285

Gly Leu Val Arg Val Ser Leu Tyr Gly Gly Val Gln Val Tyr Ala Arg

290 295 300

Val Glu Pro Gly Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Ala Ala His Ala Arg

305 310 315 320

Pro Pro Arg Pro Ala Pro Arg Pro Leu Asp Ser Leu Asp Thr Gly Asp

325 330 335

Ala Ala Val Arg Leu Ala Ile Asp Arg Ala Arg Arg Ala Ile Gly Arg

340 345 350

Asn Leu Ser Ile Leu Ile Gln Gly Glu Thr Gly Ala Gly Lys Glu Val

355 360 365

Phe Ala Lys His Leu His Ala Glu Ser Pro Arg Ser Lys Gly Pro Phe

370 375 380

Val Ala Val Asn Cys Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Ile Glu Ser Glu

385 390 395 400

Leu Phe Gly Tyr Glu Glu Gly Ala Phe Thr Gly Gly Arg Arg Lys Gly

405 410 415

Asn Ile Gly Lys Val Ala Gln Ala His Gly Gly Thr Leu Phe Leu Asp

420 425 430

Glu Ile Gly Asp Met Ala Pro Gly Leu Gln Thr Arg Leu Leu Arg Val

435 440 445

Leu Gln Asp Arg Ala Val Met Pro Leu Gly Gly Arg Glu Pro Met Pro

450 455 460

Val Asp Ile Ala Leu Val Cys Ala Thr His Arg Asn Leu Arg Ser Leu

465 470 475 480

Ile Ala Gln Gly Gln Phe Arg Glu Asp Leu Tyr Tyr Arg Leu Asn Gly

485 490 495

Leu Ala Ile Ser Leu Pro Pro Leu Arg Gln Arg Ser Asp Leu Ala Ala

500 505 510

Leu Val Asn His Ile Leu Phe Gln Cys Cys Gly Gly Glu Pro His Tyr

515 520 525

Ser Val Ser Pro Glu Val Met Thr Leu Phe Lys Arg His Ala Trp Pro

530 535 540

Gly Asn Leu Arg Gln Leu His Asn Val Leu Asp Ala Ala Leu Ala Met

545 550 555 560

Leu Asp Asp Gly His Val Ile Glu Pro His His Leu Pro Glu Asp Phe

565 570 575

Val Met Glu Val Asp Ser Gly Leu Arg Pro Ile Glu Glu Asp Gly Ser

580 585 590

Thr Ala Ala His Arg Ala Arg Gln Pro Ala Ser Gly Ser Gly Pro Ala

595 600 605

Lys Lys Leu Gln Asp Leu Ala Leu Asp Ala Ile Glu Gln Ala Ile Glu

610 615 620

Gln Asn Glu Gly Asn Ile Ser Val Ala Ala Arg Gln Leu Gly Val Ser

625 630 635 640

Arg Thr Thr Ile Tyr Arg Lys Leu Arg Gln Leu Ser Pro Thr Gly Cys

645 650 655

His Arg Pro Ala His Trp Ser Gln Ser Arg Ile Gly Thr

660 665

<210> 2

<211> 2010

<212> DNA

<213> Pseudomonas butanovora

<400> 2

atgtctaaaa tgcaggaatt cgctcgtctg gaaaccgttg cttctatgcg tcgtgctgtt 60

tgggacggta acgaatgcca gccgggtaaa gttgctgacg ttgttctgcg ttcttggacc 120

cgttgccgtg ctgaaggtgt tgttccgaac gctcgtcagg aattcgaccc gatcccgcgt 180

accgctctgg acgaaaccgt tgaagctaaa cgtgctctga tcctggctgc tgaaccggtt 240

gttgacgctc tgatggaaca gatgaacgac gctccgcgta tgatcatcct gaacgacgaa 300

cgtggtgttg ttctgctgaa ccagggtaac gacaccctgc tggaagacgc tcgtcgtcgt 360

gctgttcgtg ttggtgtttg ctgggacgaa cacgctcgtg gtaccaacgc tatgggtacc 420

gctctggctg aacgtcgtcc ggttgctatc cacggtgctg aacactacct ggaatctaac 480

accatcttca cctgcaccgc tgctccgatc tacgacccgt tcggtgaatt caccggtatc 540

ctggacatct ctggttacgc tggtgacatg ggtccggttc cgatcccgtt cgttcagatg 600

gctgttcagt tcatcgaaaa ccagctgttc cgtcagacct tcgctgactg catcctgctg 660

cacttccacg ttcgtccgga cttcgttggt accatgcgtg aaggtatcgc tgttctgtct 720

cgtgaaggta ccatcgtttc tatgaaccgt gctggtctga aaatcgctgg tctgaacctg 780

gaagctgttg ctgaccaccg tttcgactct gttttcgacc tgaactttgg cgcgttcctg 840

gaccacgttc gtcagtctgc tttcggtctg gttcgtgttt ctctgtacgg tggtgttcag 900

gtttacgctc gtgttgaacc gggtctgcgt gttccgccgc gtccggctgc tcacgctcgt 960

ccgccgcgtc cggctccgcg tccgctggac tctctggaca ccggtgacgc tgctgttcgt 1020

ctggctatcg accgtgctcg tcgtgctatc ggtcgtaacc tgtctatcct gatccagggt 1080

gaaaccggtg ctggtaaaga agttttcgct aaacacctgc acgctgaatc tccgcgttct 1140

aaaggtccgt tcgttgctgt taactgcgct gctatcccgg aaggtctgat cgaatctgaa 1200

ctgttcggtt acgaagaagg tgctttcacc ggtggtcgtc gtaaaggtaa catcggtaaa 1260

gttgctcagg ctcacggtgg taccctgttc ctggacgaaa tcggtgacat ggctccgggt 1320

ctgcagaccc gtctgctgcg tgttctgcag gaccgtgctg ttatgccgct gggtggtcgt 1380

gaaccgatgc cggttgacat agcgctggtc tgcgcaaccc accgtaacct gcgttctctg 1440

atcgctcagg gtcagttccg tgaagacctg tactaccgtc tgaacggtct ggctatctct 1500

ctgccgccgc tgcgtcagcg ttctgacctg gctgctctgg ttaaccacat cctgttccag 1560

tgctgcggtg gtgaaccaca ttactctgta agcccggaag ttatgaccct gttcaaacgt 1620

cacgcttggc cgggtaacct gcgtcagctg cacaacgttc tggacgctgc tctggctatg 1680

ctggacgacg gtcacgttat cgaaccgcac cacctgccgg aagacttcgt tatggaagtt 1740

gactctggtc tgcgtccgat cgaagaagac ggttctaccg ctgctcaccg tgctcgtcag 1800

ccggcttctg gttctggtcc ggctaaaaaa ctgcaggacc tggctctgga cgctatcgaa 1860

caggctatcg aacagaacga aggtaacatc tctgttgctg cgcgtcagct gggtgtaagc 1920

cgtaccacca tctaccgtaa actgcgtcag ctgtctccga ccggttgcca ccgtccggct 1980

cactggtctc agtctcgtat cggtacctaa 2010

<210> 3

<211> 669

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ser Lys Met Gln Glu Phe Ala Arg Leu Glu Asn Val Ala Ser Met

1 5 10 15

Arg Arg Ala Val Trp Asp Gly Asn Glu Cys Gln Pro Gly Lys Val Ala

20 25 30

Asp Val Val Leu Arg Ser Trp Thr Arg Cys Arg Ala Glu Gly Val Val

35 40 45

Pro Asn Ala Arg Gln Glu Phe Asp Pro Ile Pro Arg Thr Ala Leu Asp

50 55 60

Glu Thr Val Glu Ala Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ala Ala Glu Pro Val

65 70 75 80

Val Asp Ala Leu Met Glu Gln Met Asn Asp Ala Pro Arg Met Ile Ile

85 90 95

Leu Asn Asp Glu Arg Gly Val Val Leu Leu Asn Gln Gly Asn Asp Thr

100 105 110

Leu Leu Glu Asp Ala Arg Arg Arg Ala Val Arg Val Gly Val Cys Trp

115 120 125

Asp Glu His Ala Arg Gly Thr Asn Ala Met Gly Thr Ala Leu Ala Glu

130 135 140

Arg Arg Pro Val Ala Ile His Gly Ala Glu His Tyr Leu Glu Ser Asn

145 150 155 160

Thr Ile Phe Thr Cys Thr Ala Ala Pro Ile Tyr Asp Pro Phe Gly Glu

165 170 175

Phe Thr Gly Ile Leu Asp Ile Ser Gly Tyr Ala Gly Asp Met Gly Pro

180 185 190

Val Pro Ile Pro Phe Val Gln Met Ala Val Gln Phe Ile Glu Asn Gln

195 200 205

Leu Phe Arg Gln Thr Phe Ala Asp Cys Ile Leu Leu His Phe His Val

210 215 220

Arg Pro Asp Phe Val Gly Thr Met Arg Glu Gly Ile Ala Val Leu Ser

225 230 235 240

Arg Glu Gly Thr Ile Val Ser Met Asn Arg Ala Gly Leu Lys Ile Ala

245 250 255

Gly Leu Asn Leu Glu Ala Val Ala Asp His Arg Phe Asp Ser Val Phe

260 265 270

Asp Leu Asn Phe Gly Ala Phe Leu Asp His Val Arg Gln Ser Ala Phe

275 280 285

Gly Leu Val Arg Val Ser Leu Tyr Gly Gly Val Gln Val Tyr Ala Arg

290 295 300

Val Glu Pro Gly Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Ala Ala His Ala Arg

305 310 315 320

Pro Pro Arg Pro Ala Pro Arg Pro Leu Asp Ser Leu Asp Thr Gly Asp

325 330 335

Ala Ala Val Arg Leu Ala Ile Asp Arg Ala Arg Arg Ala Ile Gly Arg

340 345 350

Asn Leu Ser Ile Leu Ile Gln Gly Glu Thr Gly Ala Gly Lys Glu Val

355 360 365

Phe Ala Lys His Leu His Ala Glu Ser Pro Arg Ser Lys Gly Pro Phe

370 375 380

Val Ala Val Asn Cys Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Ile Glu Ser Glu

385 390 395 400

Leu Phe Gly Tyr Glu Glu Gly Ala Phe Thr Gly Gly Arg Arg Lys Gly

405 410 415

Asn Ile Gly Lys Val Ala Gln Ala His Gly Gly Thr Leu Phe Leu Asp

420 425 430

Glu Ile Gly Asp Met Ala Pro Gly Leu Gln Thr Arg Leu Leu Arg Val

435 440 445

Leu Gln Asp Arg Ala Val Met Pro Leu Gly Gly Arg Glu Pro Met Pro

450 455 460

Val Asp Ile Ala Leu Val Cys Ala Thr His Arg Asn Leu Arg Ser Leu

465 470 475 480

Ile Ala Gln Gly Gln Phe Arg Glu Asp Leu Tyr Tyr Arg Leu Asn Gly

485 490 495

Leu Ala Ile Ser Leu Pro Pro Leu Arg Gln Arg Ser Asp Leu Ala Ala

500 505 510

Leu Val Asn His Ile Leu Phe Gln Cys Cys Gly Gly Glu Pro His Tyr

515 520 525

Ser Val Ser Pro Glu Val Met Thr Leu Phe Lys Arg His Ala Trp Pro

530 535 540

Gly Asn Leu Arg Gln Leu His Asn Val Leu Asp Ala Ala Leu Ala Met

545 550 555 560

Leu Asp Asp Gly His Val Ile Glu Pro His His Leu Pro Glu Asp Phe

565 570 575

Val Met Glu Val Asp Ser Gly Leu Arg Pro Ile Glu Glu Asp Gly Ser

580 585 590

Thr Ala Ala His Arg Ala Arg Gln Pro Ala Ser Gly Ser Gly Pro Ala

595 600 605

Lys Lys Leu Gln Asp Leu Ala Leu Asp Ala Ile Glu Gln Ala Ile Glu

610 615 620

Gln Asn Glu Gly Asn Ile Ser Val Ala Ala Arg Gln Leu Gly Val Ser

625 630 635 640

Arg Thr Thr Ile Tyr Arg Lys Leu Arg Gln Leu Ser Pro Thr Gly Cys

645 650 655

His Arg Pro Ala His Trp Ser Gln Ser Arg Ile Gly Thr

660 665

<210> 4

<211> 2010

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgtctaaaa tgcaggaatt cgctcgtctg gaaaacgttg cttctatgcg tcgtgctgtt 60

tgggacggta acgaatgcca gccgggtaaa gttgctgacg ttgttctgcg ttcttggacc 120

cgttgccgtg ctgaaggtgt tgttccgaac gctcgtcagg aattcgaccc gatcccgcgt 180

accgctctgg acgaaaccgt tgaagctaaa cgtgctctga tcctggctgc tgaaccggtt 240

gttgacgctc tgatggaaca gatgaacgac gctccgcgta tgatcatcct gaacgacgaa 300

cgtggtgttg ttctgctgaa ccagggtaac gacaccctgc tggaagacgc tcgtcgtcgt 360

gctgttcgtg ttggtgtttg ctgggacgaa cacgctcgtg gtaccaacgc tatgggtacc 420

gctctggctg aacgtcgtcc ggttgctatc cacggtgctg aacactacct ggaatctaac 480

accatcttca cctgcaccgc tgctccgatc tacgacccgt tcggtgaatt caccggtatc 540

ctggacatct ctggttacgc tggtgacatg ggtccggttc cgatcccgtt cgttcagatg 600

gctgttcagt tcatcgaaaa ccagctgttc cgtcagacct tcgctgactg catcctgctg 660

cacttccacg ttcgtccgga cttcgttggt accatgcgtg aaggtatcgc tgttctgtct 720

cgtgaaggta ccatcgtttc tatgaaccgt gctggtctga aaatcgctgg tctgaacctg 780

gaagctgttg ctgaccaccg tttcgactct gttttcgacc tgaactttgg cgcgttcctg 840

gaccacgttc gtcagtctgc tttcggtctg gttcgtgttt ctctgtacgg tggtgttcag 900

gtttacgctc gtgttgaacc gggtctgcgt gttccgccgc gtccggctgc tcacgctcgt 960

ccgccgcgtc cggctccgcg tccgctggac tctctggaca ccggtgacgc tgctgttcgt 1020

ctggctatcg accgtgctcg tcgtgctatc ggtcgtaacc tgtctatcct gatccagggt 1080

gaaaccggtg ctggtaaaga agttttcgct aaacacctgc acgctgaatc tccgcgttct 1140

aaaggtccgt tcgttgctgt taactgcgct gctatcccgg aaggtctgat cgaatctgaa 1200

ctgttcggtt acgaagaagg tgctttcacc ggtggtcgtc gtaaaggtaa catcggtaaa 1260

gttgctcagg ctcacggtgg taccctgttc ctggacgaaa tcggtgacat ggctccgggt 1320

ctgcagaccc gtctgctgcg tgttctgcag gaccgtgctg ttatgccgct gggtggtcgt 1380

gaaccgatgc cggttgacat agcgctggtc tgcgcaaccc accgtaacct gcgttctctg 1440

atcgctcagg gtcagttccg tgaagacctg tactaccgtc tgaacggtct ggctatctct 1500

ctgccgccgc tgcgtcagcg ttctgacctg gctgctctgg ttaaccacat cctgttccag 1560

tgctgcggtg gtgaaccaca ttactctgta agcccggaag ttatgaccct gttcaaacgt 1620

cacgcttggc cgggtaacct gcgtcagctg cacaacgttc tggacgctgc tctggctatg 1680

ctggacgacg gtcacgttat cgaaccgcac cacctgccgg aagacttcgt tatggaagtt 1740

gactctggtc tgcgtccgat cgaagaagac ggttctaccg ctgctcaccg tgctcgtcag 1800

ccggcttctg gttctggtcc ggctaaaaaa ctgcaggacc tggctctgga cgctatcgaa 1860

caggctatcg aacagaacga aggtaacatc tctgttgctg cgcgtcagct gggtgtaagc 1920

cgtaccacca tctaccgtaa actgcgtcag ctgtctccga ccggttgcca ccgtccggct 1980

cactggtctc agtctcgtat cggtacctaa 2010

<210> 5

<211> 138

<212> DNA

<213> Pseudomonas butanovora

<400> 5

gaccttgagg tgaccttgag cgggcagata ccaccaaaat ttcccacgtg ctattatggt 60

tttgctaaag ctctcgacag cgaggagaga ctcgcgaaga taagcaattc gcccgacaga 120

ggtgaatgag gagacggt 138

<210> 6

<211> 524

<212> DNA

<213> Pseudomonas butanovora

<400> 6

ccccccaacg acgtccgtca gagcccggtt cgagtggctt ctatatgccg atcatcggtg 60

gctctattgt ggcggtcagt gacaccggtc gccttcaccc ccacagatag taggtgctgc 120

ggctgctcat gctcctgtcg cggtagcgcg ctgttacgcg accgcccccg gacctcggcg 180

gacagcgcgg aagattggaa acagcccgag cgtgcgtgcc tcgggctgca tccttgccac 240

acccaaccgg attcgtcgga ccgctcgaca ttcgcgttcg ctcccgcggc gccgcgggtg 300

taccgttgcg ttacagatgt acccttcttt aacgtgtaac acacgcctgg agcggccaag 360

agccccgcac cttgcggcgc gtcttcccca ggggcccacc ggttgcggcc ttttgctgcg 420

accgtccatg ctggcacgac acttgctgaa agcgttagag cggaatcggt ccgatggagc 480

attcgaagcc gctaccgaca gcagaacaca caaaggagga agtg 524

<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgcgtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

Claims

1.一种BmoR突变体蛋白，其特征在于，所述突变体是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上，发生包含T12N突变获得的。

2.如权利要求1所述的BmoR突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具体为：

(1)序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.3同源性75％以上的氨基酸序列；或

3.权利要求1所述BmoR突变体在检测含有高级醇的样品，或在筛选高级醇生产菌株中的应用。

4.权利要求1所述BmoR突变体在构建检测高级醇的生物传感器中的应用。

5.权利要求1所述BmoR突变体的编码基因。

6.如权利要求5所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.4所示。

7.包含权利要求5所述编码基因的重组质粒或重组菌株。

8.一种生物传感器，其特征在于，所述的传感器是包含权利要求5所述突变体编码基因、由BmoR突变体激活的启动子P_bmo、由P_bmo驱动的报告基因和表达BmoR突变体的启动子的表达元件。

9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述报告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp基因。

10.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，表达BmoR突变体的启动子包括但不限于P_bmoR、P_tac、P_T7、P_LlacO1。

11.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述传感器是将由P_bmoR启动的突变体编码基因连接至colE1复制起始位点、amp^r和P_bmo启动的gfp基因所得。

12.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，启动子P_bmo的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

13.权利要求8所述生物传感器在检测含有高级醇的环境、食品、医学、生物类样品，及筛选生产高级醇的工业微生物菌株中的应用。