CN116023326B

CN116023326B - 一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116023326B
Application number: CN202310028120.1A
Authority: CN
Inventors: 樊江莉; 夏天平; 陈庚文; 夏卓然; 叶燚; 彭孝军
Original assignee: Dalian University of Technology; Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd
Current assignee: Dalian University of Technology; Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2024-06-11
Anticipated expiration: 2043-01-09
Also published as: CN116023326A

Abstract

本发明公开了一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针及其制备方法和应用。其中，一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，所述氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针可以对DNA进行标记，引起位于近红外区的荧光光谱的变化，结构通式如下所示：本发明公开的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，所述荧光探针对DNA具有优异的选择性，较大的斯托克斯位移和良好的活细胞通透性与细胞核定位能力，并且具有良好的生物应用。

Description

一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及核酸定量检测及生物染色领域，尤其涉及一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，是储存和传递遗传信息的主要物质基础，也是生命的最基本物质之一。生物体正常细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，只有当发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，才会发生异常改变。因此对DNA的特异性识别和精确测量，尤其是在活细胞内进行检测，在癌症的早期诊断中意义非常重大。

小分子有机染料能够通过与核酸的序列特异性相互作用显示荧光开启，在荧光光谱、诊断、成像和生物医学应用中发挥着不可或缺的作用。如今，小分子有机染料作为生物分子的荧光探针用于生物分析，包括细胞成像和细胞中的DNA定量检测等尤其成为关注的焦点。

然而，小分子有机染料存在着应用的局限性：其一，较大一部分染料与DNA结合后呈现荧光淬灭，导致在荧光成像等可视化应用中实用价值不高。其二，有相当一部分染料应用受限于固定细胞，需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响。其三，目前多数染料有很大的毒性和致癌性，这就更加限制在活细胞中的应用。其四，目前多数小分子有机DNA荧光探针斯托克斯位移较小，背景干扰严重。

不对称菁染料主要应用于物理结合荧光标示，与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式取决于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁类荧光染料中典型的如SYBR Green I和Pico-Green，不对称菁类荧光染料与Hoechst荧光染料不同的是，不对称菁类荧光染料除了可以染色活细胞中的核DNA，也可以染色线粒体DNA(mt-DNA)，但是，不对称菁类荧光染料大多斯托克斯位移较小(30-50nm)，相较于RNA，对DNA的特异性不高。

综上，现有采用不对称菁染料作为生物分子的荧光探针存在以下缺陷：Stokes位移较小，背景干扰严重；部分探针不能用于活细胞DNA染色；细胞核定位能力差，大多定位于线粒体；相较于RNA，对DNA的荧光响应能力差；部分探针激发波长较长，与相关仪器激光波长不匹配。

因此需要开发一种荧光DNA标记物，该荧光DNA标记物具有以下性质：激发波长短(不超过460nm)；stokes位移大；膜通透性好，可以用于活细胞染色；相较于RNA，对DNA的选择性好；具有较好的细胞核定位能力。

发明内容

针对现有技术存在的不对称菁类荧光染料大多斯托克斯位移较小，限制在活细胞中的应用的问题，本发明的第一个目的在于提供一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，所述荧光探针对DNA具有优异的选择性，较大的斯托克斯位移和良好的活细胞通透性与细胞核定位能力，并且具有良好的生物应用。

第二个目的在于提供一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，所述制备方法具有合成简单，原料易得，成本低，产率较高的优点。

本发明的第三个目的在于提供一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，所述氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针可以对DNA进行标记，引起位于近红外区的荧光光谱的变化，结构通式如下所示：

其中，R₁选自取代或未取代苯基；

R₂选自C_1-8含氮烷基、取代或未取代含氮或含氧杂环；所述含氮或含氧杂环由取代或未取代苯基取代；

X为卤素或PF6^-；

R₁和R₂的苯基各自独立的选自以下的取代基任选取代：CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、卤素或C_1-6卤代烷基。

进一步地，所述R₁选自氢、苯基或联苯基。更进一步地，所述R₁选自联苯基。

进一步地，所述R₂选自N，N-二甲基，哌嗪基或2，6-二甲基哌嗪基。更进一步地，所述R₂选自2，6-二甲基哌嗪基。

进一步地，所述氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针为：

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，包括下述步骤：

1)将1-氯-2，4-二硝基苯加入到乙醇或甲醇溶液中，滴加4-甲基吡啶，80℃下回流反应4-12小时，反应结束后冷却到室温，加入大量乙醚析出沉淀，抽滤得到式Ⅰ中间体，其中，4-甲基吡啶与1-氯-2，4-二硝基苯的摩尔比为1：(1-2)；X优选为Cl^-；

2)将步骤1)制得的式Ⅰ中间体加入到乙醇或甲醇溶液中，再加入氨基取代得芳香烃R₁-NH₂，80℃下回流反应4-12小时，反应结束后冷却到室温，加入大量乙醚析出沉淀，抽滤得到式Ⅱ中间体，式Ⅰ的化合物与氨基取代的芳香化合物的摩尔比1：1-5，X为Cl^-；

3)将步骤2)制得的式Ⅱ中间体加入到乙醇或甲醇溶液中，滴加哌啶，搅拌30min，然后加入对位取代的苯甲醛中间体，在80℃反应3-8小时，反应结束后冷却到室温得到反应液，将反应液旋蒸浓缩，加入大量乙醚析出沉淀，抽滤得到粗产品，粗产品用柱层析硅胶进行分离提纯，得到式Ⅲ的目标化合物，式Ⅱ的中间体与对位取代的苯甲醛的摩尔比1：1-2，X为Cl^-

进一步地，在步骤3)中，所用洗脱剂包括体积比为100：(10-20)的二氯甲烷与甲醇混合液。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的应用，该氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

第一、本发明设计并合成了一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，该探针结构简单，制备其的原料易得，合成产率高，易于实现产业化。

第二、所制备的探针对核酸响应速度快，可以在大约5s内对核酸响应完全；具有较大的斯托克斯位移(198nm)，可以避免背景荧光的干扰；

第三、所制备的探针的激发光为波长较小的蓝绿色光(426nm)，能够识别微小颗粒，提高了对小粒子的检测能力，对DNA具有很好的选择性响应，对DNA的荧光响应强度是RNA的13.47倍，优于商业化Hoechst染料(13.09倍)；对其他RNA、氨基酸、蛋白质、葡萄糖、多肽等几乎无响应。

第四、本发明制备的荧光探针具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况进入细胞对核酸进行染色，毒性小且致癌性低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的核酸测试图；

图2为本发明实施例2公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的核酸测试图；

图3为本发明实施例3公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的核酸测试图；

图4为本发明实施例4公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的核酸测试图；

图5为本发明实施例1、2和4中公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对HepG2活细胞进行染色对比图；

图6为本发明实施例4公开的不同浓度氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针吸收与荧光发射光谱；

图7为本发明实施例4公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在不同溶剂中紫外吸收光谱(图7a)和荧光发射光谱(7b)；

图8为本发明实施例4公开的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对不同浓度核酸的吸收与荧光光谱；

图9为本发明实施例4公开氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对DNA和RNA的选择性对比图；

图10为本发明实施例4公开氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对DNA响应时间图；

图11为本发明实施例4公开氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在不同物质中的荧光强度图；

图12为本发明实施例4公开氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针HepG2活细胞染色图；

图13为本发明实施例4公开氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对嗜碱性粒细胞和血小板分类检测特征图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-13，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-4烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本发明制备的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1

一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的合成方法如下：

合成以R₁为苯基，R₂为N，N二甲基，X为Cl^-的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针：

S1：制备1-(2，4-二硝基苯)-4甲基吡啶

将53.69mmol的4-甲基吡啶和44.74mmol的1-氯-2，4-二硝基苯加入盛放有30mL的EtOH的两口烧瓶中，回流搅拌反应6h后停止反应。将得到的混合液旋蒸浓缩，然后加入50mL乙醚结晶出大量沉淀，得褐色针状固体5.82g，即为1-(2，4-二硝基苯)-4甲基吡啶，产率约为50％。

S2：制备4-甲基-1-苯基吡啶

将7.69mmol步骤S1制得的1-(2，4-二硝基苯)-4甲基吡啶和9.22mmol的苯胺加入盛放有5mL的EtOH的两口烧瓶中，回流搅拌反应8h后停止反应，冷却至室温。将得到的混合液旋蒸浓缩得到粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后得到黑色固体0.98g，即为4-甲基-1-苯基吡啶，产率约为75％。

S3：制备目标产物A

将587.43μmol步骤S2制得的4-甲基-1-苯基吡啶和704.91μmol的N，N-二甲基苯甲醛盛放有5mL的EtOH的两口烧瓶中，加入催化剂在85℃的条件下回流搅拌反应9h后停止反应，冷却至室温。将得到的混合液旋蒸浓缩得到粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后得到红色固体0.11g，即为目标产物A，产率约为60％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.03(d,J＝6.9Hz,1H),8.18(d,J＝7.0Hz,1H),8.12(d,J＝16.0Hz,1H),7.86(d,J＝6.8Hz,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.9Hz,1H),7.31(d,J＝16.1Hz,1H),6.83(d,J＝8.9Hz,1H),3.06(s,3H)。

实施例2

一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的合成方法如下：

合成以R₁为苯基，R₂为2,3,6,7-四氢吡啶并喹啉，X为Cl^-的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针：

S1：同实施例1；

S2：同实施例1；

S3：将293.71μmol步骤S2制得的4-甲基-1-苯基吡啶和323.08μmol的9-醛基久洛尼定加入盛放有5mL的EtOH的两口烧瓶中，加入催化剂在85℃的条件下回流搅拌反应10h后停止反应。将得到的混合液旋蒸浓缩得到粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后得到红色固体67.49mg，即为目标产物B，产率约为65％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.93(d,J＝7.0Hz,1H),8.08(d,J＝7.0Hz,1H),7.99(d,J＝15.9Hz,1H),7.83(d,J＝7.0Hz,1H),7.75–7.65(m,2H),7.23(s,1H),7.17(d,J＝15.9Hz,1H),3.31(d,J＝4.7Hz,9H),2.73(t,J＝6.2Hz,2H),2.00–1.71(m,2H).

实施例3

一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的合成方法如下：

合成以R₁为苯基，R₂为哌嗪基，X为Cl^-的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针：

S1：制备4-哌嗪苯甲醛

量取9mL水和10mL乙二醇单甲醚于50mL两口烧瓶中，将24.17mmol的对氟苯甲醛和48.34mmol的哌嗪加入容器中，在130℃的反应条件下加热回流3h，反应完全后冷却到室温，将混合液滴加到50mL的水中，有黄色沉淀析出，随后干燥得黄色固体粉末4.10g，即为4-哌嗪苯甲醛，产率约为85％。

S2：同实施例1

S3：制备目标产物C

将1.17mmol步骤S2制得的4-甲基-1-苯基吡啶和1.41mmol的4-哌嗪苯甲醛加入盛放有5mL的EtOH的两口烧瓶中，加入催化剂回流搅拌反应10h后停止反应，冷却至室温。将得到的混合液旋蒸浓缩得到粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后得到红色固体281.64mg，即为目标产物C，产率约为70％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.07(d,J＝6.8Hz,1H),8.22(d,J＝6.8Hz,1H),8.11(d,J＝16.1Hz,1H),7.86(d,J＝6.8Hz,1H),7.73(d,J＝7.8Hz,1H),7.66(d,J＝8.8Hz,1H),7.36(d,J＝16.1Hz,1H),7.04(d,J＝8.9Hz,1H),5.76(s,1H),3.27(s,2H),2.83(s,2H).

实施例4

一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的合成方法如下：

合成以R₁为联苯基，R₂为2，6-二甲基哌嗪基，X为Cl^-的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针：

S1：制备4-甲基-1-联苯基吡啶

将1.92mmol的1-(2，4-二硝基苯)-4甲基吡啶和2.31mmol的联苯胺加入盛放有5mL的EtOH的容器中，回流搅拌反应9h，之后停止反应，冷却至室温，将得到的混合物溶液旋蒸浓缩得粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后得到棕褐色固体212.99mg，即为4-甲基-1-联苯基吡啶。该反应式Ⅰ的产率约为45％。

S2：制备4-(2，6-二甲基)哌嗪苯甲醛

量取5mL DMF于25mL两口烧瓶中，将8.06mmol的对氟苯甲醛、16.11mmol的2，6-二甲基哌嗪和8.06mmol的无水碳酸钾加入容器中，在150℃的反应条件下加热回流48h，反应完全后冷却到室温。反应混合液用二氯甲烷和水萃取浓缩得粗产物。将粗产物经过色谱柱纯化后，得到黄色液体1.23g，即为4-(2，6-二甲基)哌嗪苯甲醛，产率约为70％。

S3：制备目标产物D

将2.03mmol步骤S1制得的4-甲基-1-联苯基吡啶和2.44mmol步骤S2制得的4-(2，6-二甲基)哌嗪苯甲醛加入盛放有5mL得EtOH的两口烧瓶中，加入催化剂在回流搅拌反应10h后停止反应，冷却至室温。将得到的混合液旋蒸浓缩得到粗产物，经过色谱柱纯化后得到红色固体634.57mg，即为目标产物D，产率约为70％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.10(d,J＝6.6Hz,1H),8.23(d,J＝6.8Hz,1H),8.12(d,J＝15.9Hz,1H),8.03(d,J＝8.6Hz,1H),7.96(d,J＝8.7Hz,1H),7.80(s,1H),7.66(d,J＝8.8Hz,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,1H),7.48(d,J＝7.4Hz,1H),7.37(d,J＝16.0Hz,1H),7.05(d,J＝9.0Hz,1H),2.79(d,J＝6.3Hz,1H),2.68(s,1H),1.05(d,J＝6.2Hz,3H).

对比例

以商业化的DNA染料Hoechst 33342为例，虽然该染料对DNA的选择性好，且对细胞核的定位能力较好，但是该染料的合成较为复杂，不适合产业化；此外该染料的最大吸收波长(352nm)与该发明中血细胞分析仪的激发波长(460nm)不匹配。

性能检测试验

1、使用上述实施例1-4制备的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对小牛胸腺DNA及RNA进行染色，并使用紫外可见分光光度计以及荧光分光光度计分别测试吸收光(激发光)谱和荧光(发射光)光谱，并探针分子对DNA与RNA的选择性作图(图1-4分别为实施例1-4的核酸测试图)

图1-4可以看出，实施例1-4中合成的化合物的激发光波长在蓝绿色区间400-500nm，此外所有化合物对DNA均有较好的荧光响应性，对RNA的荧光响应性很差。

使用实施例1-4中合成的化合物对HepG2活细胞进行染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察观察。图5结果显示实施例1-4中合成的化合物除了实施例3以外，均能在不破坏细胞膜的情况下对HepG2细胞染色，成像清晰。

结合实施例1-4可以看出，实施例1-4中合成的化合物对DNA的选择性较好，其中实施例2对DNA的选择性最好，达到了19.80倍。但是在HepG2活细胞染色中，实施例1和实施例2对细胞核的染色效果不好，可以明显看到细胞质中有荧光信号。综上所述实施例4为最优实施例。

2、对上述实施例4制备的氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针对小牛胸腺DNA和酵母RNA核酸染色实验以及HepG2活细胞染色进行如下测试：

(1)光物理性质

将探针化合物D滴加至到PBS缓冲液(pH＝7.4)，使化合物D浓度分别为4、8、12、16和20μM，记录吸收与荧光发射光谱。测试结果显示见图6。

从图6中可以看出，化合物D的最大吸收波长为426nm，最大发射波长为624nm，具有较大的斯托克斯位移(198nm)。

将化合物D分别加入到不同的溶剂(PBS，THF，DCM，EtOH，DMSO)中测试紫外吸收光谱(图7a)和荧光发射光谱(图7b)。

从图7a和7b可以看出，化合物D在不同极性溶剂中吸收波长略有变化，发射波长基本不变。

结合实施例4和图6以及图7，可以看出，实施例4中合成的分子在浓度达到20μM时仍不会发生聚集，而且该分子在水系溶剂体系中荧光较弱，这意味着该分子在以水系体系为主的生物体中检测不会有较强的背景荧光。同时该分子的stokes位移较大，不容易受激发波长影响，更有利于成像，也可以用于超分辨成像。

(2)化合物D的核酸滴定实验

配置浓度为2μM的化合物D于装有3mL PBS缓冲溶液(pH＝7.4)的石英比色皿中，分别然后取浓度为1mg/mL的DNA或RNA 60.6μL，测定其吸收与荧光光谱。如此继续分别滴加该DNA或RNA并测定其吸收与荧光光谱。测试结果显示于图8中。

从图8中可以看出化合物D与DNA结合后吸收波长红移，最大吸收波长为460nm(图8a)，发射波长蓝移，最大发射波长为608nm(图8b)；化合物D与RNA结合后吸收波长也发生红移，最大吸收波长为444nm(图8c)，发射波长略微红移，最大发射波长为630nm(图8d)。此外化合物D对DNA具有较好的响应，对RNA几乎没有响应。

结合实施例4和图8，可以看出，化合物D对DNA的荧光响应性相较于RNA较好，且化合物D对RNA几乎没有响应，因此该化合物可以用于细胞内DNA的检测。化合物D与DNA结合后仍然有较大的stokes位移(148nm)，因此在细胞内对DNA检测时不易受背景荧光的干扰。

(3)化合物D对DNA和RNA的选择性对比实验

配置浓度为2μM的化合物D于装有3mL PBS缓冲溶液(pH＝7.4)的石英比色皿中，分别然后取浓度为1mg/mL的DNA或RNA 60.6μL，测定其荧光光谱。如此继续分别滴加该DNA或RNA并测定其荧光光谱，逐渐加入DNA和RNA的浓度分别为0-140μg/mL，，对比核酸选择性结果(图9a)。同时使用商业化细胞核DNA染料Hoechst33342作为对比，Hoechst33342染料的核酸选择性实验步骤同上，得到Hoechst33342的对比核酸选择性结果(图9b)。

从图9可以看出，化合物D对DNA具有非常优异的选择性，对RNA几乎没有响应，其中对DNA的荧光响应强度是RNA的13.47倍，而Hoechst33342染料为13.09倍。化合物D对DNA的选择性略优于商业化染料Hoechst33342。另一方面Hoechst33342的吸收与发射波长分别为350nm和460nm，斯托克斯位移为110nm，低于化合物D。

(4)化合物D的核酸响应时间实验

配置浓度为2μM的化合物D，加入浓度为20μg/mL的DNA？3ml，测定其荧光强度，记录化合物D的荧光强度变化与时间的关系(图10)。

由图10可以看出，当加入DNA后，化合物D的荧光强度急速升高，在大约10s时稳定，因此化合物D可以在极短的时间内(不超过10s)对核酸响应完全，非常适合快速的检测要求。

(5)化合物D的选择性实验

配置浓度为2μM的化合物D，分别加入15μM的DNA、100μM的RNA、100μM的蛋白质(HAS，BSA)、100μM的糖类(Glucose)、100μM的氨基酸(L-Iso，L-Glu，L-Ser)以及100μM的多肽(GSH)，分别测定并记录荧光强度，检测结果如图11。

由图11可以看出，尽管除DNA之外的各种底物浓度远远多于DNA，但是化合物D对DNA的荧光响应强度远远高于其他底物，因此化合物D对DNA具有优异的选择性，并不会受到其他底物的干扰。

(6)化合物D的HepG2活细胞染色实验

配置浓度为8μM的化合物D，分别加入到已经孵育好的HepG2细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)的培养皿中，在37℃，5％ CO₂条件下孵育染色20min，然后使用PBS震荡漂洗1min×3，再加入无血清培养基。选择代表性区域使用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜成像，化合物D的激发波长为405nm，接收波段600-650nm，测试结果显示于图12中。

从图12中可以看出，化合物D主要染色细胞核，并且细胞结构完整。化合物D能够有效穿透活细胞膜对核酸进行染色，并且不会破坏细胞结构，这样就能够在细胞存活状态下进行染色观察，更加有利于对细胞的形态、种类等进行识别。

(7)化合物D用于人外周血细胞分类检测实验

将化合物D用于Mindray公司BC-6800全自动血细胞分析仪中对人外周血细胞进行分类检测。

取人新鲜外周血细胞20mL加入Mindray公司商业化LN溶血剂1mL，再将化合物D浓度为50mg/mL加入到混合体系中，在WNB通道中对嗜碱性粒细胞进行分类检测(图13a)。

取人新鲜外周血细胞20mL加入Mindray公司商业化DR稀释液1mL，再将化合物D浓度为50mg/mL加入到混合体系中，在RET通道中对红细胞细胞和血小板进行分类检测(图13b)。

结合图13可以看出，化合物D可以在WNB通道中对嗜碱性粒细胞进行分类检测，在RET通道中对血小板和红细胞进行分类检测。

综上，可以看出，大stokes位移，超高的DNA荧光响应能力和优异的DNA选择性，超快的DNA响应时间可以用于活细胞的细胞核DNA染色，基于以上性能，以及化合物D与现有血细胞分析仪器的激光匹配度(460nm)，可以用于人外周血中部分细胞的分类检测。

本发明所提供的荧光探针与现有技术相比，具有包括以下方面的创造性：较大的stoke位移(138nm)；超高的DNA荧光响应能力，高于商业化DNA染料Hoechst33342；优异的DNA选择性，不受其他底物干扰；超快的DNA响应(～10s)；可以用于活细胞细胞核DNA染色；可同时用于人外周血嗜碱性粒细胞，网织红细胞和血小板进行分类检测。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针，其特征在于，氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的结构为：

2.权利要求1所述的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，制备流程如下所示，

其步骤如下：

1)将4-甲基吡啶与1-氯-2，4-二硝基苯按摩尔比1：(1-2)在反应溶剂中反应，制备式Ⅰ的化合物；

2)将式Ⅰ的化合物与氨基取代的芳香化合物按摩尔比1：(1-5)在反应溶剂中反应，制备式Ⅱ的化合物；

3)将式Ⅱ的化合物与对位取代的苯甲醛按摩尔比1：(1-2)在反应溶剂和碱性催化剂中反应，反应结束后冷却到室温得到反应液，将反应液旋蒸浓缩、析出沉淀、柱层析硅胶进行分离提纯，得到目标化合物；

其中，R₁为苯基；

R₂为2,3,6,7-四氢吡啶并喹啉、哌嗪基或2，6-二甲基哌嗪基；

X^-为Cl^-。

3.根据权利要求2所述的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，反应温度为70-90℃，反应时间为6-24h，反应溶剂为乙醇或甲醇。

4.根据权利要求2所述的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，反应温度为70-90℃，反应时间为3-8h，反应溶剂为乙醇或甲醇。

5.根据权利要求2所述的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所用洗脱剂是体积比为100：(10-20)的二氯甲烷与甲醇混合液。

6.权利要求1所述的一类氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针的应用，其特征在于，该氮芳基吡啶菁染料衍生物荧光探针在定量检测核酸和/或生物染色中的应用。