CN116019811B - Gsk-j4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了GSK‑J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用，所述GSK‑J4，CAS编号为1373423‑53‑0。本发明的技术方案公开了GSK‑J4的医药新用途，GSK‑J4对多种革兰阳性菌较佳的抗菌活性，可以抑制如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌等革兰氏阳性菌的生长，特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更为明显，比万古霉素表现出更显著的杀菌活性，而且能够显著抑制生物被膜的形成。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌等革兰氏阳性菌是常见的临床分离病原菌，近年随着抗菌药物的广泛使用，临床革兰氏阳性菌的耐药问题日益突出。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA)的检出率长期处于较高水平，在世卫组织抗生素耐药“重点病原体”清单中处于高度优先地位，给临床治疗带来巨大挑战。MRSA感染的死亡率极高，据CDC报告显示，2018年美国因MRSA感染导致约2万例死亡此外，临床分离的革兰氏阳性菌易形成生物被膜也是临床治疗革兰氏阳性菌感染效果不佳的重要原因之一。生物被膜的形成可降低对抗菌药物的敏感性，并逃避宿主免疫细胞的攻击和吞噬，当抗生素浓度下降时，细菌会增殖重新填充生物膜，并脱落到周围组织和血液中，导致复发，造成慢性感染和迁延不愈。因此，开发既能抑制细菌生长又能抑制生物被膜形成的新型抗感染药物已经成为当前的研究热点方向之一。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用，这是GSK-J4的一种新用途，GSK-J4对革兰氏阳性菌表现出抗菌活性和杀菌活性，并能抑制革兰氏阳性菌生物被膜的形成，同时可灭杀成熟生物被膜中的细菌，为基于以GSK-J4为先导结构的抗菌药物的开发提供参考依据。
对此，本发明采用的技术方案为：
GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用，所述GSK-J4，CAS编号为1373423-53-0。
其中，所述GSK-J4的结构式如式(1)所示：
GSK-J4是一种特异性的H3K27去甲基化酶抑制剂，主要通过抑制组蛋白去甲基化酶(UTX和JMJD3)的酶活性，从而提高H3K27甲基化水平、抑制目的基因的表达。作为组蛋白去甲基化酶UTX的抑制剂，GSK-J4用于治疗T细胞急性淋巴细胞白血病[12]。但是在大多数情况下，GSK-J4主要作为JMJD3的抑制剂，在JMJD3相关的免疫疾病和肿瘤中发挥作用。研究证实，GSK-J4在多种肿瘤中表现出了显著的抗肿瘤作用，其中包括儿童神经胶质瘤和卵巢癌等。但是目前，GSK-J4的抗菌活性未见报道。
而本发明人通过大量实验发现，GSK-J4对革兰氏阳性菌表现出较佳的抗菌活性，能够显著抑制部分金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。而且GSK-J4比万古霉素表现出更显著的杀菌活性。此外，金黄色葡萄球菌生物被膜的形成是导致慢性感染的重要毒力因素，传统抗生素中只有少数几个对生物被膜有效。GSK-J4对部分临床金黄色葡萄球菌菌生物膜的形成有显著的抑制作用，并且对细胞的毒性较小，对人肾上皮细胞系293T增殖的半抑制浓度(IC50)显著高于对革兰氏阳性菌的MIC，亚抑菌浓度下还能抑制金黄色葡萄球菌的溶血作用。这些结果表明GSK-J4在临床革兰氏阳性菌抗感染治疗中具有潜在应用价值。
作为本发明的进一步改进，所述GSK-J4在处理体系中的浓度为不小于0.65μg/ml。进一步的，所述GSK-J4在处理体系中的浓度为不小于1.30μg/ml。进一步的，所述GSK-J4在处理体系中的浓度为0.65～5.22μg/ml。
作为本发明的进一步改进，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。
本发明公开了GSK-J4用于制备抑制革兰氏阳性菌的涂料中的应用，所述涂料用于医疗器械的表面，所述GSK-J4的CAS编号为1373423-53-0，所述GSK-J4具有抑制革兰氏阳性菌的生长和生物被膜形成的作用。
作为本发明的进一步改进，所述GSK-J4的浓度为不小于0.65μg/ml。进一步的，所述GSK-J4的浓度为不小于1.30μg/ml。进一步的，所述GSK-J4的浓度为0.65～5.22μg/ml。本发明还公开了GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌消毒剂的应用，所述GSK-J4的CAS编号为1373423-53-0，所述GSK-J4具有抑制革兰氏阳性菌的生长和生物被膜形成的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的技术方案公开了GSK-J4的医药新用途，GSK-J4对多种革兰氏阳性菌较佳的抗菌活性，特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更为明显，比万古霉素表现出更显著的杀菌活性，而且能够显著抑制生物被膜的形成。此外，GSK-J4对金黄色葡萄球菌有杀菌效果，在24小时内细菌计数降低到检测下限。MIC剂量下GSK-J4对细胞的毒性较小，亚抑菌浓度下还能抑制金黄色葡萄球菌的溶血作用。这些结果提示GSK-J4具备治疗革兰氏阳性菌感染的可能性。并且，GSK-J4的MIC与临床常用抗生素相当，适宜临床使用。可见GSK-J4在临床革兰氏阳性菌抗感染治疗中具有潜在应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例添加GSK-J4后不同金黄色葡萄球菌临床株和粪肠球菌临床株的生长曲线，其中(a)～(h)分别为金黄色葡萄球菌YuSA145、YuSA139、SA113、CHS101，粪肠球菌EF16C51、EF16C30、EF16C152、EF16C396。
图2是本发明实施例GSK-J4金黄色葡萄球菌MRSA株(YUSA145)和粪肠球菌株(EF16C51)杀菌曲线分析，图中，(a)为YUSA145，(b)为EF16C51。
图3是本发明实施例的不同亚抑浓度的GSK-J4对部分金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用结果。
图4是本发明实施例的GSK-J4对金黄色葡萄球菌的YUSA145的细胞膜通透性的影响曲线，图中N11代表GSK-J4。
图5是本发明实施例的GSK-J4对293T细胞毒性检测结果，图中N11代表GSK-J4。
图6是本发明实施例的不同亚抑菌浓度下GSK-J4对金黄色葡萄球菌溶血的抑制作用检测结果，图中N11代表GSK-J4。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
1.1菌株来源
本实施例中使用的革兰氏阳性菌，包括20株MRSA，20株MSSA，22株表皮葡萄球菌，19株屎肠球菌和21株粪肠球菌临床株收集于医院不同住院患者。所有临床菌株都通过Phoenix 100自动微生物鉴定系统鉴定，继代培养后采用基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对所有菌株进行重新鉴定。质量控制菌株金黄色葡萄球菌SA113和ATCC29213购自ATCC菌株库。
1.2主要仪器和试剂
微量移液器(德国eppendorf公司)，Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统(美国BD公司)，全自动生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper(德国布鲁克公司)，全自动生长曲线分析仪(芬兰Bioscreen公司)，Q Exactive Plus液质联用仪(LC-MS/MS，
美国Thermofisher Scientific公司)，激光扫描共聚焦显微镜FV3000(日本OLYMPUS公司)。舍吲哚(美国MedChemExpress公司)，结晶紫(北京索莱宝科技有限公司)，葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司)，RIPA裂解液(上海翌圣生物科技股份有限公司)，MicroBCA蛋白定量试剂盒(美国Thermofisher Scientific公司)，cOmplete proteaseinhibitor cocktail蛋白酶抑制剂(瑞士Roche公司)，DTT(大连美仑生物有限公司)。
本实施例中，采用96孔板高通量测定GSK-J4对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的生长的抑制活性。具体步骤为：
取过夜培养菌液(金黄色葡萄球菌ATCC29213和粪肠球菌OG1RF)用比浊杯调整浊度至0.5麦氏(菌量约为1.0-1.5×108cfu/mL)。取菌液同CAMHB培养基1:200稀释后加入96孔板，每行12孔，每孔200uL。添加定制化合物库的化合物稀释至50uM，第12孔加入200uLCAMHB培养基设为阴性对照。定制化合物库含CNX-1351,Futibatinib，BAY 2416964，Afizagabar，OTS186935(hydrochloride)，EGFR-IN-12，(S)-TXNIP-IN-1，I3MT-3，Nampt-IN-5，CGP 25454A，SB-616234-A，TML-6，TPC2-A1-P，HBX 19818，CCT369260，RETF-4NA(TFA)，SAR-260301，Difamilast，EGFR-IN-8，Broflanilide，A3334，CTPI-2，Elimusertib(hydrochloride)，BI-2545，NCGC00092410，BAZ2-ICR，EG01377(dihydrochloride)，GSK-J4，TH1338，N-Deshydroxyethyl Dasatinib。37℃培养24小时后观察结果，以肉眼不能看见细菌生长的孔中添加的化合物被认为具有潜在的抑菌活性。
本实施例中，添加50uM GSK-J4的金黄色葡萄球菌ATCC29213和粪肠球菌OG1RF在24小时后培养基都表现为澄清，未观察到细菌有生长，OD600都小于0.1。可见GSK-J4对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌具有潜在的抑菌活性。
其次，本实施例中，采用微量肉汤稀释法检测GSK-J4对多种革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌)的最低抑菌浓度(MIC)。具体步骤为：
取过夜培养菌液用比浊杯调整浊度至0.5麦氏(菌量约为1.0-1.5×108cfu/mL)。取菌液同CAMHB培养基1:100稀释后加入96孔板，每行12孔，药物设置10个梯度孔(200,100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56,0.78,0.39μM)，第11孔加入200uL上述菌液设为阳性对照，第12孔加入200uL CAMHB培养基设为阴性对照。各抗菌药物的MIC值测定培养条件和时间按照CLSI指南进行，37℃培养18小时后观察结果，以肉眼不能看见菌液沉淀的药物浓度孔计算为MIC值。
本实施例中，GSK-J4对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的MIC值结果如表1所示，可见GSK-J4对多种革兰阳性菌具有较佳的抑菌活性，MIC值主要分布在3.13μM(≈1.76μg/mL)到12.5μM(≈7.0μg/mL)之间，其中对表皮葡萄球菌的抑制效果最佳，MIC50为3.13μM。
表1革兰氏阳性菌对GSK-J4的药物敏感性
注：S.aureus：金黄色葡萄球菌；E.faecalis：粪肠球菌；S.epidermidis：表皮葡萄球菌；E.faecium：屎肠球菌；n为所测菌株数量。
实施例2
GSK-J4对革兰阳性菌的生长影响实验。
为了验证GSK-J4是否能够抑制革兰阳性菌的生长，我们使用不同浓度的GSK-J4分别处理金黄色葡萄球菌MRSA株(YUSA145)和粪肠球菌株(EF16C51)，在不同时间点检测其OD值，具体步骤为：取过夜培养菌液(金黄色葡萄球菌YuSA145、YuSA139、SA113、CHS101，粪肠球菌EF16C51、EF16C30、EF16C152、EF16C396)用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基稀释1000倍后加入96孔板，添加不同浓度(1/16×，1/8×，1/4×，1/2×和1×)GSK-J4后置于全自动生长曲线分析仪中，每间隔1小时测定600nm波长吸光度(OD600)吸光值，以检测培养上清液中浮游菌含量，孵育温度为37℃，绘制生长曲线。
生长曲线分析如图1所示，可见在1/2×MIC浓度下，GKS-J4会抑制金黄色葡萄球菌浮游菌的生长，但不影响最大生长水平，而浓度达到1×MIC时，YUSA145(MRSA)的生长完全被抑制，CHS101(MSSA)的生长也被显著抑制，且无法到达最大生长水平，这些结果初步表明GSK-J4具有作为抗革兰阳性菌感染药物的潜力。
实施例3
GSK-J4对革兰阳性菌抗菌活性的时间和剂量的影响实验。
本实施例中研究GSK-J4对革兰阳性菌抗菌活性的时间和剂量依赖效应，并与抗生素达托霉素和万古霉素的活性进行比较，具体步骤包括：
将对数期(OD600＝0.5)的MRSA临床株YUSA145菌液、粪肠球菌临床株EF16C51菌液分别稀释100倍，分别与(1×，2×，4×，8×)GSK-J4、(8×)达托霉素、(8×)万古霉素后置于摇床200rpm孵育。随后，分别在0、3、6、24小时采集样品利用无菌生理盐水进行连续梯度稀释，并涂布在TSB平板上37℃孵育，24小时后菌落计数。菌落计数以CFU/mL表示。
得到的杀菌曲线分析如图2所示，可见GSK-J4在4×MIC在观察到对金黄色葡萄球菌有杀菌效果，在24小时内细菌计数降低到检测下限，杀菌效果强于8×MIC万古霉素。
实施例4
本实施例采用结晶紫法，研究GSK-J4对金黄色葡萄球菌株的抗生物被膜活性，具体步骤为：
采用结晶紫染色法检测生物被膜量的变化，重复3次，每次设3个复孔,取平均值为最终检测结果。操作步骤简述如下，取过夜菌液用含2％葡萄糖的TSBG培养基稀释1000倍于96孔板中，每组3个复孔，添加不同亚抑菌浓度GSK-J4，以不添加菌液的空白培养基作为阴性对照，溶剂DMSO为阳性对照。于37℃培养箱中孵育24小时后。轻柔吸弃培养液，用无菌PBS冲洗3次，室温下晾干。甲醇固定15分钟，1％结晶紫染液染色15分钟，无菌水冲洗3次至对照孔为无色，室温下晾干。每孔加入200μL无水乙醇溶解，震荡1分钟于酶标仪测定570nm吸光值。
用结晶紫染色对生物被膜半定量分析，结果如图3所示，可见当GSK-J4为1/4×MIC时，部分金黄色葡萄球菌株形成的生物被膜生物量有所减少。当GSK-J4浓度在1/2×MIC时，大部分的生物被膜形成被抑制50％以上，其中，对MSSA的抑制效果明显强于MRSA，表明GSK-J4能抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，且对MSSA有较佳的抗生物被膜活性。
实施例5
本实施例为GSK-J4对金黄色葡萄球菌的YUSA145的细胞膜通透性的研究实验，具体步骤为：
将对数期的革兰阳性菌YUSA145细胞调整到OD600＝0.05，与2μM SYTOX Green在5mM HEPES缓冲液(PH＝7.2)黑暗中孵育。对悬浮液用不同浓度GSK-J4处理(最终浓度为1×，2×和4×MIC)，以0.1％ DMSO和0.1％ Triton作为对照，持续监测荧光强度(激发波长为504nm，发射波长为523nm)。
SYTOX Green是一种用于检测膜渗透性的荧光染料，当其通过被破坏的细胞膜进入细菌与核酸结合时，荧光强度会增加。
荧光强度的监测结果如图4所示，发现GSK-J4处理后的金黄色葡萄球菌YUSA145的SYTOX Green并没有显著的改变，表明GSK-J4对YUSA145的细胞膜通透性没有显著影响，说明GSK-J4对金黄色葡萄球菌细胞膜可能没有损伤作用。
实施例6
本实施例为GSK-J4对293T细胞的细胞毒性的影响实验，具体步骤为：
在96孔板中配制100μL的293T细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％ CO2)。向培养板加入10μL不同浓度的GSK-J4，设置5个梯度孔(25,12.5,6.25,3.125,1.56,0.78μM)。将培养板在培养箱孵育24小时，向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。然后通过吸光度计算细胞活力。
CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。GSK-J4对293T细胞的细胞毒性的结果如图5所示，可见，0.78μM的GSK-J4对293T细胞没有细胞毒性，6.25，12.5μM对293T细胞增殖表现出较低的抑制活性，25μM的GSK-J4对293T细胞毒性达到了约50％。总体而言，GSK-J4对293T细胞增殖的IC50为23.92μM，高于其对所有检测的革兰氏阳性菌临床株的MIC值，具有潜在的临床抗革兰氏阳性菌感染应用潜力。
实施例7
本实施例为GSK-J4对金黄色葡萄球菌YUSA145溶血的抑制作用的实验，具体步骤为：
取YUSA145菌株1:200接种于4mL TSB培养基，于37℃以220rpm培养12小时进行活化。活化后，将细菌1:200接种至2ml含GSK-J4(1/4×，1/2×)的TSB培养基中，于37℃培养12h。然后于离心机4000rpm，4℃离心5分钟，移除菌体。将菌株上清与1％的兔红细胞各500μl混合于1.5EP管中*3，0.01％ TritonX-100做为阳性对照(100％溶血)，1×PBS做为阴性对照，于37℃，220rpm摇床孵育30分钟后，以4000rpm离心5分钟，将200μl上清液轻轻地移至新的96孔板中，并在550nm处读取吸光度。
结果如图6所示，可见，1/4×MIC的GSK-J4对金黄色葡萄球菌YUSA145的溶血作用有约10％的抑制效果，1/2×MIC的GSK-J4则对YUSA145的溶血作用起到约30％的抑制效果。
上述所有的实验均使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理及绘制图像。P<0.05被认为具有统计学差异。
对比例
在上述实施例的基础上，本对比例选择GSK-J4结构类似物GSK-J1(CAS编号为1373422-53-7)和GSK-J2(CAS编号为1394854-52-4)为研究对象，按照上述实施例1的方法进行实验。
首先，本对比例采用微量肉汤稀释法检测GSK-J4结构类似物GSK-J1(CAS编号为1373422-53-7)和GSK-J2(CAS编号为1394854-52-4)对多种革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌)的最低抑菌浓度(MIC)。具体步骤为：
取过夜培养菌液用比浊杯调整浊度至0.5麦氏(菌量约为1.0-1.5×108cfu/mL)。取菌液同CAMHB培养基1:100稀释后加入96孔板，每行12孔，药物设置10个梯度孔(100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56,0.78,0.39,0.20μM)，第11孔加入200uL上述菌液设为阳性对照，第12孔加入200uL CAMHB培养基设为阴性对照。37℃培养18小时后观察结果，以肉眼不能看见菌液沉淀的药物浓度孔计算为MIC值。
本对比例中，GSK-J1和GSK-J2对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的MIC值都大于100μM，可见GSK-J1和GSK-J2对革兰氏阳性菌无抑菌活性，GSK-J4对多种革兰阳性菌的抑菌活性是结构特异性的。
通过上述结果可见，GSK-J4对革兰氏阳性菌表现出较佳的抗菌活性，能够显著抑制部分金黄色葡萄球菌临床株生物被膜的形成。此外，GSK-J4对金黄色葡萄球菌有杀菌效果，在24小时内细菌计数降低到检测下限，对粪肠球菌则没有表现出明显的杀菌作用。MIC剂量GSK-J4对293T细胞毒性约为30％，GSK-J4对金黄色葡萄球菌的溶血作用有抑制效果。这些结果提示GSK-J4具备治疗金黄色葡萄球菌感染的可能性。并且，GSK-J4的MIC与临床常用抗生素相当，适宜临床使用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1. GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用，其特征在于：所述GSK-J4的CAS编号为1373423-53-0，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用，其特征在于：所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。
3. GSK-J4用于制备抑制革兰氏阳性菌的涂料中的应用，其特征在于：所述涂料用于医疗器械的表面，所述GSK-J4的CAS编号为1373423-53-0，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌中的至少一种。
4. GSK-J4用于制备抗革兰氏阳性菌消毒剂的应用，其特征在于：所述GSK-J4的CAS编号为1373423-53-0，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌中的至少一种。
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