CN116005445A - 一种促进细胞贴壁的聚合物材料表面处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法，先使用氩气和氢气的混合气体对聚合物材料进行低压等离子体预处理，之后进一步使用DMAEMA和氮气的混合物，进行二次低压等离子体处理，得到促进细胞贴壁的聚合物材料。本发明一些实例的表面处理方法，处理工艺简单，在表面处理时，不需要转移材料，得到的聚合物材料具有良好且持久的亲水性，加速实验显示其亲水性至少可以保持一年以上。可以很好地促进细胞贴壁，具有意料之处的效果。本发明一些实例的表面处理方法，表面处理的均一度高，特别适合多孔材料的表面改性处理。
Description
技术领域
本发明属于新材料领域，具体涉及一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法。
背景技术
经过长时间的研究与实践，细胞培养技术已经得到了充分的发展和完善。离体的细胞培养技术具有很多优点，比如可以人为地控制培养参数，而且方便观察，从而被广泛地应用于生物制药领域，并对该领域产生了巨大又深远的影响。按不同的细胞类型，细胞培养可以分为悬浮细胞培养和贴壁细胞培养。贴壁细胞培养是指细胞必须贴附于一定固相表面才能进行培养。为了更好的实现贴壁细胞培养，需要对固相表面进行表面改性处理，表面改性处理以亲水处理为主。
常见的表面处理方法有两种，一种是低压等离子体表面处理技术，另一种是化学表面接枝改性技术。低压等离子体表面处理技术操作简单，但是亲水效果的持久性比较差，通常只有半年左右，细胞贴附率较低，如CN111171360A、CN113171692A等。而化学接枝改性需要对固相表面进行功能单体涂敷、紫外照射等处理，将亲水的活性反应基团，如-OH、-NH2等连接到固相表面，如CN102533632A、CN115010697A等所公开的。化学接枝改性的操作复杂、涂敷量难以控制，表面改性的均匀性差，同时会残留溶剂、未反应的单体，这些残留的溶剂、未反应的单体对于细胞培养存在不利影响，需要进一步处理。整体的改性流程复杂，处理效率低下，成本居高不下，难以产业化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法，包括如下步骤：
S1) 将聚合物材料置于低压等离子体处理设备中，通入氩气和氢气的混合气体，对材料表面进行低压等离子体预处理；
S2) 预处理完毕后，通入雾化的液态甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）和氮气的混合物，进行二次低压等离子体处理，得到促进细胞贴壁的聚合物材料。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理和二次低压等离子体处理的真空度独立为5～50 Pa。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理时，氩气和氢气的体积混合比为(9：1)～(7：3)。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理的时间为2～15 min。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理混合气体的总流量为10～500sccm。
在一些表面处理方法的实例中，二次低压等离子体处理时，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的流量为20～300 μL/min，氮气的流量为10～50 sccm。
在一些表面处理方法的实例中，二次低压等离子体处理的时间为3～8 min。
在一些表面处理方法的实例中，所述聚合物材料选自聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯、尼龙、聚氨酯、三聚氰胺中的至少一种。
在一些表面处理方法的实例中，所述聚合物材料的多孔材料，其开孔率不低于90%。
在一些表面处理方法的实例中，所述多孔材料中，至少90%的开孔的孔径介于20 μm～150 μm；和/或所述多孔材料的厚度为200 μm～1000 μm。
以上技术特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的表面处理方法，处理工艺简单，在表面处理时，不需要转移材料，得到的聚合物材料具有良好且持久的亲水性，加速实验显示其亲水性至少可以保持一年以上。可以很好地促进细胞贴壁。
本发明一些实例的表面处理方法，表面处理的均一度高，特别适合多孔材料的表面改性处理。
本发明一些实例的表面处理方法，通过使用N2结合雾化DMAEMA低温等离子体处理，可以显著提高细胞的贴壁率，具有意料之外的效果。
附图说明
图1～5是实施例1～5表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况。
图6是未经表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况。
图7是对比例1表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况。
图8是对比例2表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况。
图9是对比例3表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况。
具体实施方式
一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法，包括如下步骤：
将聚合物材料置于低压等离子体处理设备中，通入氩气和氢气的混合气体，对材料表面进行低压等离子体预处理；
预处理完毕后，通入雾化的液态甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）和氮气的混合物，进行二次低压等离子体处理，得到促进细胞贴壁的聚合物材料。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理和二次低压等离子体处理的真空度独立为5～50 Pa。优选5-15Pa，真空度太高<5Pa设备一般达不到；太低>50Pa会导致抽真空不彻底，里面残留少许空气，影响表面处理效果。
一般而言，等离子处理的功率越大，越有利于提高处理速度，但是功率过大，可能会导致材料被烧焦，功率过低，处理效率低下。等离子处理的功率可以根据具体的情况进行调整，可以参考低压等离子体的使用说明进行相应的调整。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理时，氩气和氢气的体积混合比为(9：1)～(7：3) ，优选9：1至8：2，不在这个范围内的混合比都会导致持久亲水性不佳。
低压等离子体预处理的时间越长，越有利于实现更为充分的改性，但是过长时间的处理，会超出材料的极限，甚至导致材料降解。在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理的时间为2～15 min。具体的可以根据改性材料的具体需要进行相应的调整。
在一些表面处理方法的实例中，低压等离子体预处理混合气体的总流量为10～500sccm。流量越大，越有利于提高低压等离子体预处理的效果，当流量达到阈值后，进一步提高流量并不会进一步提高材料的性能。流量过高时，也会超出设备的极限。总流量可以根据具体的需要进行相应的调整。
在一些表面处理方法的实例中，二次低压等离子体处理时，DMAEMA的流量为20～300 μL/min，优选50-150μL/min，太低<20μL/min会导致处理效果不佳，材料表面接枝量不足，导致细胞培养性能不好；太高>300μL/min会导致部分DMAEMA单体没有经过反应直接涂敷在材料表面，进而会影响到材料表面性质。氮气的流量为10～50 sccm，优选20-40sccm，太低<10sccm会降低材料的亲水持久性；太高>50sccm会降低DMAEMA的接枝效率。
在一些表面处理方法的实例中，二次低压等离子体处理的时间为3～8 min，优选3-5min，太短<3min会导致处理效果不佳，材料表面接枝量不足，导致细胞培养性能不好；太长>8min不会对性能带来进一步的提升，还可能造成未反应单体过多残留。
在一些表面处理方法的实例中，所述聚合物材料选自聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯、尼龙、聚氨酯、三聚氰胺中的至少一种。这些材料也是常用的细胞培养用材料，也可以根据需要进行改性处理，得到相应的促进细胞贴壁的聚合物材料。
在一些表面处理方法的实例中，所述聚合物材料的多孔材料，其开孔率不低于90%。开孔率大，则具有更大的比表面积，更有利于获得更多贴壁生长的细胞，实现更大密度的细胞培养。
在一些表面处理方法的实例中，所述多孔材料中，至少90%的开孔的孔径介于20 μm～150 μm；和/或所述多孔材料的厚度为200 μm～1000 μm。
以上技术特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
方便比较起见，所有实例中待处理的材料均为厚度为200μm的聚酯无纺布多孔材料。考虑到所使用的低压等离子体处理设备的具体情况，真空度设置为可以稳定实现的10Pa。
实施例1：
首次低压等离子体处理：将聚酯无纺布多孔材料置于低压等离子体处理设备中，控制功率为100 W，通入氩气和氢气的混合气体(氩气和氢气的体积为9：1)，混合气体的流量为100 sccm，对材料表面进行低压等离子体预处理3 min；
二次低压等离子体处理：控制低压等离子体处理设备功率为100 W，通入雾化的液态DMAEMA和N2的混合物，其中，DMAEMA的流量为200 μL/min，，N2的流量为20 sccm，处理时间为5 min，得到表面处理的聚合物材料。
实施例2：
首次低压等离子体处理：将聚酯无纺布多孔材料置于低压等离子体处理设备中，控制功率为50 W，通入氩气和氢气的混合气体(氩气和氢气的体积为8：2)，混合气体的流量为500 sccm，对材料表面进行低压等离子体预处理5 min；
二次低压等离子体处理：控制低压等离子体处理设备功率为50 W，通入雾化的液态DMAEMA和N2的混合物，其中，DMAEMA的流量为150 μL/min，，N2的流量为30 sccm，处理时间为6 min，得到表面处理的聚合物材料。
实施例3：
首次低压等离子体处理：将聚酯无纺布多孔材料置于低压等离子体处理设备中，控制功率为200 W，通入氩气和氢气的混合气体(氩气和氢气的体积为9：1)，混合气体的流量为300 sccm，对材料表面进行低压等离子体预处理10 min；
二次低压等离子体处理：控制低压等离子体处理设备功率为200 W，通入雾化的液态DMAEMA和N2的混合物，其中，DMAEMA的流量为20 μL/min，，N2的流量为10 sccm，处理时间为3 min，得到表面处理的聚合物材料。
实施例4：
首次低压等离子体处理：将聚酯无纺布多孔材料置于低压等离子体处理设备中，控制功率为30 W，通入氩气和氢气的混合气体(氩气和氢气的体积为7：3)，混合气体的流量为50 sccm，对材料表面进行低压等离子体预处理7 min；
二次低压等离子体处理：控制低压等离子体处理设备功率为30 W，通入雾化的液态DMAEMA和N2的混合物，其中，DMAEMA的流量为300 μL/min，，N2的流量为50 sccm，处理时间为8 min，得到表面处理的聚合物材料。
实施例5：
首次低压等离子体处理：将聚酯无纺布多孔材料置于低压等离子体处理设备中，控制功率为150 W，通入氩气和氢气的混合气体(氩气和氢气的体积为8：2)，混合气体的流量为200 sccm，对材料表面进行低压等离子体预处理15 min；
二次低压等离子体处理：控制低压等离子体处理设备功率为150 W，通入雾化的液态DMAEMA和N2的混合物，其中，DMAEMA的流量为80 μL/min，，N2的流量为30 sccm，处理时间为5 min，得到表面处理的聚合物材料。
对比例1：
同实施例1，不同之处在于未进行二次低压等离子体处理。
对比例2：
同实施例1，不同之处在于未进行首次低压等离子体预处理。
对比例3：
同实施例1，不同之处在于二次低压等离子体处理时未通入DMAEMA。
不同处理对聚合物材料性能的影响：
聚合物多孔材料由于水滴能渗透入材料内部，所以无法用传统的测试方法来测试其亲水性好坏。对于细胞培养应用而言，用于细胞贴壁的多孔材料应在短时间内完全被培养基或缓冲液浸润，故本发明中定义亲水性为：将水滴滴入200um厚的多孔材料表面，水滴能在10秒内完全渗透材料，则认为亲水性合格。
亲水性的持久性，通过对材料进行加速老化后，再测试不同老化时间后材料的亲水性，加速老化温度为60℃。
亲水性的测试结果如表1所示。
表1
| 水滴浸润时间 | 加速老化0年 | 加速老化0.5年 | 加速老化1年 | 加速老化2年 |
| 实施例1 | <1s | <1s | 5s | 6s |
| 实施例2 | <1s | <1s | 6s | 7s |
| 实施例3 | <1s | <1s | 6s | 8s |
| 实施例4 | <1s | <1s | 5s | 9s |
| 实施例5 | <1s | <1s | 5s | 7s |
| 不处理 | >5min | >5min | >5min | >5min |
| 对比例1 | <1s | 7s | 3min | >5min |
| 对比例2 | <1s | 10s | 4min | >5min |
| 对比例3 | <1s | 7s | 2min | >5min |
由表1可知，实施例1～5的材料，加速老化后依然具有良好的亲水性。而对比例1～3的亲水性只能维持约0.5年左右。
细胞贴壁性能的检测：
细胞培养方式采用摇瓶，培养体积200 mL，37℃摇床内孵育，转速50-75rpm；细胞采用Vero细胞，接种密度2.6x105cells/mL,培养基采用DMEM；聚合物多孔材料用量6g。经过24h培养后，将材料取出，固定长在表面的细胞，用DAPI对细胞进行染色，置于荧光显微镜下观察，白色的点为细胞核。
结果如图1～图9所示。
图1～5是实施例1～5表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况，从图中可以看出，贴壁生长的细胞多，均匀地分布在多孔材料的骨架上，说明多孔材料具有优秀的细胞贴壁功能和良好的均一性。
图6是未经表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况，从图6中可以看出，几乎没有细胞贴壁生长，少数的几个细胞贴壁可能是物理吸附的作用。
图7是对比例1表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况，从图7中可以看出，由于未进行第二步等离子体处理，贴壁生长的细胞显著少于实施例。
图8是对比例2表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况，从图中可以看出，Vero细胞的贴壁情况与实施例接近，但对比例2的持久亲水性较差。
图9是对比例3表面处理多孔材料的Vero细胞贴附情况，从图中可以看出，由于没有接枝DMAEMA，贴壁生长的细胞显著少于实施例。
初步的实验数据显示，聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚氨酯、三聚氰胺等材料也可以采用与实施例相近的方法进行表面处理，使这些聚合物材料具有促进细胞贴壁生长的特性。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种促进细胞贴壁聚合物材料的表面处理方法，包括如下步骤：
将聚合物材料置于低压等离子体处理设备中，通入氩气和氢气的混合气体，对材料表面进行低压等离子体预处理；
预处理完毕后，通入雾化的液态甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和氮气的混合物，进行二次低压等离子体处理，得到促进细胞贴壁的聚合物材料。
2.根据权利要求1所述的表面处理方法，其特征在于，低压等离子体预处理和二次低压等离子体处理的真空度独立为5～50 Pa。
3.根据权利要求1所述的表面处理方法，其特征在于，低压等离子体预处理时，氩气和氢气的体积混合比为(9：1)～(7：3)。
4.根据权利要求1所述的表面处理方法，其特征在于，低压等离子体预处理的时间为2～15 min。
5.根据权利要求1所述的表面处理方法，其特征在于，低压等离子体预处理混合气体的总流量为10～500sccm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的表面处理方法，其特征在于，二次低压等离子体处理时，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的流量为20～300 μL/min，氮气的流量为10～50 sccm。
7.根据权利要求1～5任一项所述的表面处理方法，其特征在于，二次低压等离子体处理的时间为3～8 min。
8.根据权利要求1～5任一项所述的表面处理方法，其特征在于，所述聚合物材料选自聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯、尼龙、聚氨酯、三聚氰胺中的至少一种。
9.根据权利要求1～5任一项所述的表面处理方法，其特征在于，所述聚合物材料的多孔材料，其开孔率不低于90%。
10.根据权利要求9所述的表面处理方法，其特征在于，所述多孔材料中，至少90%的开孔的孔径介于20 μm～150 μm；和/或所述多孔材料的厚度为200 μm～1000 μm。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张晓龙等: "等离子体制备亲水性聚乙烯薄膜及其性能研究", 浙江理工大学学报, no. 6, pages 795 - 798 * |
| 谷笑雨;戚涵姝;李昊原;辛世刚;张洪波;于湛;: "低温等离子体处理对高分子材料表面改性的研究进展", 化学工程与装备, no. 12, pages 4 * |
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