CN116004800B - 一种cnv标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述的CNV标记为位于绵羊BMP2基因上游chr13：49265801‑49282000。本发明以绵羊BMP2基因上游chr13：49265801‑49282000为CNV标记，通过检测该标记在绵羊群体中的拷贝数变异情况，可以检测绵羊的不同尾型性状，用于不同尾型绵羊的早期选择，提高选种准确性，缩短培育周期，加快培育进程，为绵羊的分子标记辅助选择提供科学依据。

Description

一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用。
背景技术
肥尾羊以脂肪沉积的形式在尾部和腹部储存能量，占其胴体体重的20％。最早关于肥尾羊的资料记载是距今约5000年，认为肥尾羊是由瘦尾羊驯化演变而来。肥尾的形成是对干旱和气候变化的一种适应性反应机制。然而，脂肪过度的沉积在尾部影响绵羊的繁殖和运动能力、脂肪在动物体内的分布、饲养成本增加、消费者偏好降低等问题。目前，在集约化和半集约化生产系统中，大肥尾的优势已经大大减少。对于生产者和消费者来说，减少尾部脂肪沉积更能满足社会需求，因为脂肪沉积比瘦肉组织沉积需要更多的能量，而动物脂肪已经失去了大部分市场需求。然而，肥尾羊约占世界羊总数的25％。在中国，人们越来越关注健康，也不再想饲养肥尾羊。一些地区养肥尾羊的农民现在正在培育瘦尾羊。不同的绵羊品种在最初驯化后经过适应性进化，产生了不同的尾巴表型。而绵羊尾型的表型多样性为其遗传基础的比较分析提供了理想的材料。进化生物学家、动物遗传学家、育种工作者和生产者一直想要清楚地了解绵羊尾巴表型差异背后的潜在遗传学机制。了解这些差异背后的因果基因和突变将有助于探索进化之谜，改善动物生产性能，促进动物福利，并提供有助于理解与脂肪沉积(即肥胖)有关的人类疾病。同时，对绵羊的尾型进行早期筛选，有利于减少饲养成本，提高养殖效益。
基因组学的研究为了解绵羊尾部脂肪形成的机制提供了前所未有的机会，以确定表型差异之间潜在的因果变异。在过去的十年中，研究人员也对绵羊尾部脂肪沉积的机制进行了基因组学和转录组学的研究。多种基因被认为具有几个潜在的重要候选基因，包括与肥尾表型相关的BMP2和PDGFD基因，以及与尾椎数量和尾巴长度相关的TBXT基因。其中，PDGFD研究的较为深入，在第一外显子上发现一个SNP突变位点和一个ASE(Allele-specificexpression，等位基因的特异性表达)，第三外显子上发现1个ASE，第一内含子上发现了一段长6.8kb区域受到正向选择，在3’UTR发现5个ASE。但本领域对于BMP2基因的研究较少，因此，本发明旨在研究BMP2基因与绵羊尾型的相关性，并提供一种便于筛选绵羊尾型的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用。本发明以绵羊BMP2基因上游chr13：49265801-49282000为CNV标记，通过检测该标记在绵羊群体中的拷贝数变异情况，可以检测绵羊的不同尾型性状，用于不同尾型绵羊的早期选择，提高选种准确性，缩短培育周期，加快培育进程，为绵羊的分子标记辅助选择提供科学依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用，所述CNV标记为位于绵羊BMP2基因上游chr13：49265801-49282000。
优选的，以绵羊基因组DNA为模板，通过qPCR扩增CNV标记以及内参基因，根据2×2-ΔΔCt法进行拷贝数结果分析，2×2-ΔΔCt＝2为正常型，2×2-ΔΔCt>2为重复型，2×2-ΔΔCt<2为缺失型。
优选的，所述qPCR扩增的引物对包括目标CNV标记引物对和内参基因引物对，所述目标CNV标记引物对的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因引物对的上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述重复型的绵羊尾型为瘦尾，所述正常型和所述缺失型的绵羊尾型为肥尾。
本发明提供了一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用。本发明以绵羊BMP2基因上游chr13：49265801-49282000为CNV标记，利用特定的引物对，采用qPCR技术扩增CNV区域以及内参基因，检测该标记在绵羊群体中的拷贝数变异情况，操作简单，结果准确可靠。本发明可以检测绵羊的不同尾型性状，用于不同尾型绵羊的早期选择，提高选种准确性，缩短培育周期，加快培育进程，为绵羊的分子标记辅助选择提供科学依据。
附图说明
图1为实施例1中绵羊Vst分析的Manhattan图。
图2为实施例1中绵羊GWAS分析的Manhattan图。
图3为实施例2中不同尾型绵羊的qPCR验证结果，其中，HUS1～3为湖羊，EFS1～3代表东佛里生羊。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例确定了与绵羊肥瘦尾有关的CNV标记，具体过程如下：
1.重测序
对16只肥尾绵羊(兰州大尾羊、阿勒泰羊、大尾寒羊、广陵大尾羊和同羊)和32只瘦尾绵羊(藏羊、威宁绵羊和汉中绵羊)，通过Illumina HiSeq2000平台测序，以ARS-UI_Ramb_v2.0为比对的参考基因组，进行CNV变异检测和CNVR合并操作；利用CNVnator(参数：-call100)进行检测，通过基因组上不同的reads覆盖深度，判断潜在的deletion(缺失)和duplication(重复)。在瘦尾绵羊中，BMP2基因上游chr13：49265801-49282000发生CNV重复，而在肥尾绵羊中，这段区域发生缺失。
2.选择扫描分析
本研究利用Vst对不同尾型绵羊进行分析。Vst分析是类似于Fst的一个指标，用来衡量群体间每个CNV差异大小的统计量，计算方法为Vst＝(Vt－Vs)/Vt，其中Vt表示所有样本该区域拷贝数大小的标准差，Vs表示两个群体各自的标准差根据各自群体大小加权之后的值。Vst的值大部分介于0-1之间，值越大表示群体间该区域拷贝数变异差异越大，反之则越小。分析结果如图1所示。
从图1可以看出，在13号染色体上发现了一个CNV(49265801-49282000，Vst＝0.5608)受到强烈选择(如图1中13号染色体处圆圈标识所示)，该CNV发生了duplication。对其进行基因注释，发现这段区域位于BMP2基因的上游。
3.GWAS分析
利用CNVruler对178只绵羊(包含101只肥尾羊，77只瘦尾羊)进行GWAS分析，对CNV与肥尾和瘦尾进行关联分析。肥尾绵羊表型值设为1，瘦尾绵羊的表型值设为0，将阈值设置为FDRp值<0.05，检测与尾型相关的CNV。结果如图2所示。
从图2可以看出，在13号染色体上，同样位于BMP2基因上游的49265801-49282000的CNV与尾型相关(如图2左图中13号染色体处圆圈标识所示)，并处于峰值(peak_value＝5.8291)；该CNV与表型之间有很强的关联信号。
综上，根据1～3的分析结果，确定位于BMP2基因上游chr13：49265801-49282000这一CNV标记与绵羊肥瘦尾相关，该CNV标记在Genbank的序列号为NC_056066.1。
实施例2
本实施例利用qPCR验证了实施例1的CNV标记与绵羊肥瘦尾的关系，具体操作如下：
选择3只湖羊(肥尾羊)和3只东佛里生羊(瘦尾羊)为样本，采集基因组DNA进行qPCR验证，每个个体分别用CNV标记的引物和内参基因的引物进行扩增，并且每个个体设置3个技术重复。内参基因为DGAT1。其中，CNV标记的引物为：CNV-F：AGAACACCAGTTGAGAGCGG(SEQ ID NO.1)，CNV-R：CCACTGTGGAGATTGGACCC(SEQ ID NO.2)；内参基因的引物为DGAT1-F：TCAACGACTGGATGACTGCC(SEQ ID NO.3)，DGAT1-R：TTTCCCACTTGGGCCAGTTT(SEQ IDNO.4)。
根据TB Green预混Ex TaqTMII(Takara，中国)的说明书进行qPCR。扩增条件如下：
qPCR实验采用LightCycler/LightCycler 480系统(Roche Diagnostics)进行。
qPCR的反应体系为：1μl DNA(50ng/μl)，上下游引物(10μM)各0.5μl，10μl ddH2O，7μl TB Green Premix Ex Taq Ⅱ。
qPCR扩增的反应程序为：95℃5min，95℃10s，60℃10s，70℃15s，循环40次。
根据2×2-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(CT目的基因-CT内参基因)实验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组。2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的拷贝数相对于对照组的倍数，根据2×2-ΔΔCt将结果分成三类：2×2-ΔΔCt＝2为正常型，2×2-ΔΔCt>2为重复型，2×2-ΔΔCt<2为缺失型。将3个生物学重复，3个技术重复得到的Ct值按公式计算后，取平均值进行绘图，如图3所示。
从图3可以看出，该CNV标记发生变异与绵羊尾型相关，该CNV标记发生重复时是瘦尾绵羊，正常时和发生缺失时是肥尾绵羊。将该CNV标记检测用于开展绵羊尾型的早期选择，缩短培育周期、加快培育进程，降低育种成本，具有很高的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种CNV标记在绵羊肥瘦尾早期筛选中的应用，其特征在于，所述CNV标记为位于绵羊BMP2基因上游chr13：49265801-49282000；所述chr13：49265801-49282000对应的基因组版本为ARS-UI_Ramb_v2.0；所述CNV标记的qPCR引物对的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以绵羊基因组DNA为模板，通过qPCR扩增CNV标记以及内参基因，根据2×2-ΔΔCt法进行拷贝数结果分析，2×2-ΔΔCt＝2为正常型，2×2-ΔΔCt>2为重复型，2×2-ΔΔCt<2为缺失型。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述qPCR扩增的引物对包括目标CNV标记引物对和内参基因引物对，所述目标CNV标记引物对的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因引物对的上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重复型的绵羊尾型为瘦尾，所述正常型和所述缺失型的绵羊尾型为肥尾。
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