CN116004369A - 一种微体积单细胞捕获装置及微体积单细胞捕获方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微体积单细胞捕获装置及微体积单细胞捕获方法。所述微体积单细胞捕获装置包括超微量液体操作系统和单细胞容器，使用时，先在每个接收区加入一个接收液滴，再由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。本发明采用超微量液体泵和毛细管探针，具有精确操纵和控制微量与超微量液体的能力，因而具备更精准的单细胞捕获与操控性能，显著提高了单细胞捕获成功率。本发明预先在单细胞容器中形成接收液滴，显著地降低了液滴生成难度与单细胞捕获难度。

Description

一种微体积单细胞捕获装置及微体积单细胞捕获方法

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，特别是涉及一种微体积单细胞捕获装置及微体积单细胞捕获方法。

背景技术

单细胞分析是指在单个细胞水平上进行的分析。传统的细胞分析通常取多个或大量细胞进行研究，只能得到众多细胞的平均化结果，从而掩盖了细胞的个体差异。单细胞分析技术作为一种更精准、更深入的实验手段，其基本特征是“一个细胞、一个反应”，而不是将众多细胞混为同一个样品进行分析，因而能够挖掘出更准确的信息与更丰富的生物学内涵。

更高分辨率的研究方法意味着更高的操作难度。为了实现单细胞分析，研究人员需要将单个细胞从大量细胞中分离出来，使每个待测细胞都处于独立的、互不干扰的反应环境。常规的做法是借助显微镜对细胞的观察，同时利用移液器，从随机分散的细胞群中吸取一个细胞，再将其转移至独立容器(如微量离心管、孔板)。但这样的手动式单细胞捕获方法耗时耗力，且受到研究人员操作技能的限制，分析通量不高。

微流控技术通过操纵和控制微米级的微通道或微结构内的微量流体(10^-9～10^{- 18}L)，而实现了流体中单个细胞的操控，能够满足单细胞分析实验需求。因其微量化、集成化等特征，微流控技术在单细胞分析领域中独具优势。一方面，微流控技术通常利用微泵、微阀、微通道或其他微型化控制元件批量化地操控细胞，能够实现更高的操作效率与分析通量。另一方面，微流控技术的操作体积通常在纳升级甚至皮升级，减少了样品消耗量，也有利于减少单细胞样品中本就含量极低的各类待测物的损失。现如今，用于单细胞分析的微流控技术以基于液滴的微流控技术为主。常见的液滴体系以水溶液为分散相，以油相为连续相，其中分散于油相的非连续水溶液即为液滴。在理想状况下，细胞被一对一地捕获于液滴中，每个液滴承载着一个独立的单细胞反应，扮演了柔性单细胞微反应器的角色。

目前，用于单细胞捕获的液滴微流控技术主要有两种技术路线。一种是高通量、大规模路线。这一类的微流控技术通常具有极快的液滴生成速度，例如含有十字交叉型微通道的微流控芯片，每小时生成液滴达数百万个，因而适用于大规模平行单细胞实验的开展。但由于其在生成液滴时随机地将细胞包裹在内，难以对单细胞捕获过程施以主动的控制，捕获准确率较低，很难避免空液滴以及多细胞液滴的产生。相反地，另一技术路线追求精准、灵活的单细胞操控，液滴生成速度和反应通量相对较低，但能够在保证较高通量的基础上，实现一对一的精准捕获。例如，发明人所在研究组自主研发的SODA仪器具有精确定量量取和操控液滴的能力，利用SODA仪器中的毛细管探针，能够精准地、自动化地捕获或挑取细胞，准确率达到90％以上([1]Zhu，Y.；Zhang，Y.X.；Cai，L.F.；Fang，Q.SequentialOperation Droplet Array：An Automated Microfluidic Platform for Picoliter-Scale Liquid Handling，Analysis，and Screening.Anal Chem 2013，85(14)，6723-6731.DOI：10.1021/ac4006414.[2]Wang，Y.；Wang，D.F.；Wang，H.F.；Wang，J.W.；Pan，J.Z.；Guo，X.G.；Fang，Q.A microfluidic robot for rare cell sorting based on machinevision identification and multi-step sorting strategy.Talanta 2021，226.DOI：10.1016/j.talanta.2021.122136.)。

在利用液滴微流控技术进行微液滴的操控时，由于液滴体积微小，其操控精准度受到微尺度效应、溶液性质和物体表面性质的影响。此外，在生成液滴的同时将单细胞捕获于液滴中，其间气、液、固界面的切换与变化可能会影响液滴中细胞的活性，从而对后续的单细胞实验造成不利影响。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种微体积单细胞捕获装置及微体积单细胞捕获方法，通过预先形成接收液滴，本发明解决了液滴生成过程中细胞易受损的问题，降低了液滴生成难度，从而提高了含有单个细胞的液滴(单细胞液滴)生成的成功率。

一种微体积单细胞捕获装置，包括：

超微量液体操作系统，包括超微量液体泵和毛细管探针，所述超微量液体泵用于驱动所述毛细管探针吸取或放出超微量液体；

单细胞容器，用于接收超微量液体操作系统分离的单细胞，所述单细胞容器具有多个接收孔，每个接收孔作为一个接收区用于接收一个细胞；或者，所述单细胞容器具有一体的接收面，接收面具有经亲水处理的亲水点，每个亲水点作为一个接收区用于接收一个细胞，

使用时，先在每个接收区加入一个接收液滴，再由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

超微量液体泵可以是注射泵、蠕动泵、压电泵、隔膜泵、启动压力泵、电渗流泵等。优选的，超微量液体泵是注射泵。

毛细管探针可以由毛细管拉制而成，也可以由其他工艺制成，如通过注塑工艺注塑而成。优选地，毛细管探针由石英毛细管拉制而成。

优选的，毛细管探针的尖端孔径为0.1μm～1mm。更优选的，毛细管探针的尖端孔径为1μm～200μm。

优选的，所述单细胞容器为以下一种：微流控芯片、标准孔板、培养皿、塑料离心管、载玻片，

当所述单细胞容器为培养皿或载玻片时，用于接收单细胞的区域称为接收面，通过亲水处理在接收面上形成亲水点。

优选的，所述微体积单细胞捕获装置，还包括用于储存、分散或铺展细胞的细胞样品池。超微量液体操作系统从细胞样品池中吸取单细胞后放入单细胞容器中形成单细胞液滴。

细胞样品池可以是培养皿、标准孔板、塑料离心管等容器。细胞样品池的底面可以是二氧化硅、氮化硅、塑料、树脂等材质的薄膜、微孔膜、片状物、块状物等平面。

优选的，所述细胞样品池的底面具有微孔膜，微孔膜上具有用于吸住细胞的微通孔，所述微通孔的孔径大小略小于待捕获单细胞的大小。

本发明通过预先在单细胞容器中形成接收液滴，并将细胞悬液添加到细胞样品池中，然后利用毛细管探针吸取从细胞样品池的底面上吸取单细胞，最后将单细胞注射到单细胞容器的接收液滴中，形成单细胞液滴，从而实现单细胞的微体积捕获。

本发明还提供了一种微体积单细胞捕获方法，使用所述微体积单细胞捕获装置，所述微体积单细胞捕获方法包括以下步骤：

(1)在单细胞容器的每个接收区加入一个接收液滴；

(2)由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

优选的，当接收液滴的体积为皮升级至纳升级、且所述单细胞容器具有一体的接收面时，在接收面上加入用于防止接收液滴及单细胞液滴蒸发的矿物油或氟油。

优选的，步骤(1)中，毛细管探针在形成接收液滴时的注射体积为1fL～100μL，注射流速为1fL/s～10mL/s，毛细管探针尖端与单细胞容器的距离为0～5mm。更优选的，注射体积为1pL～10μL，注射流速为1pL/s～1mL/s，距离为0～0.5mm。进一步优选的，注射体积为10pL～1μL，注射流速为10pL/s～0.1mL/s，距离为0～0.1mm。

优选的，毛细管探针在吸取平面上的细胞时，毛细管探针尖端与平面的距离为0～0.5mm，吸取体积为1fL～100μL，吸取流速为1fL/s～10mL/s。进一步优选的，距离为0～0.1mm，吸取体积为10pL～1μL，吸取流速为10pL/s～100μL/s。

优选的，毛细管探针将细胞转移至接收液滴时，注射体积为1～200倍于吸取体积，注射流速为10pL/s～10mL/s。进一步优选的，注射体积为1～10倍吸取体积，注射流速为10pL/s～100μL/s。

超微量液体操作系统吸取待处理的细胞前，先将细胞配置成细胞悬液。细胞悬液包含细胞和载液。细胞可以是动物细胞、植物细胞、细菌、真菌、花粉颗粒、凝胶微粒及其他形似细胞的颗粒物。细胞载液可以是磷酸盐缓冲溶液、细胞培养液或水。优选的，细胞悬液是含有哺乳动物细胞的磷酸盐缓冲溶液。

本申请微体积单细胞捕获装置在使用时，超微量液体操作系统的移动可以由手工操作，也可以由计算机控制的自动平移台自动完成。毛细管探针注射和吸取溶液的操作可以由人手动控制，也可以由计算机软件程序化、自动化地控制。

本发明的优点在于：

(1)与基于常规移液器的单细胞捕获方法相比，本发明采用超微量液体泵和毛细管探针，具有精确操纵和控制微量与超微量液体的能力，因而具备更精准的单细胞捕获与操控性能，显著提高了单细胞捕获成功率。不同于常规方法的微升至毫升级液体操控，本发明可操控的液体体积低至纳升级或皮升级，生成的单细胞液滴体积微小，有效地降低了样品消耗量。同时，在微体积液滴中，含量极低的待测分子浓度增大，更易于检测和分析。这对于单细胞分析领域具有重要意义。

(2)与直接生成单细胞液滴的方式相比，本发明预先在单细胞容器中形成接收液滴，显著地降低了液滴生成难度与单细胞捕获难度。在直接生成单细胞液滴的情况下，毛细管探针内的细胞分泌物可能使毛细管探针内壁与尖端的表面性质发生变化，从而对液滴生成结果产生不利影响。预先形成接收液滴后，毛细管探针注射的溶液及时被接收液滴接收，细胞也随之转移至接收液滴，从而使溶液及细胞吸附到毛细管探针尖端及外壁的可能性大大地降低。此外，接收液滴起到了提前定位的作用，能够预先调整和固定每个单细胞液滴的位置。

(3)本发明装置易于构建，操作方便，且易于自动化，操作效率远高于手动式单细胞捕获方法。

基于以上优点，本发明在与单细胞分析相关的研究领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是一种基于接收液滴的单细胞捕获装置示意图。

图2是实施例1的操作步骤示意图。

图3是实施例2的结构说明图。

具体实施方式

一种微体积单细胞捕获装置，包括超微量液体操作系统和单细胞容器。其中，超微量液体操作系统包括超微量液体泵和毛细管探针，所述超微量液体泵用于驱动所述毛细管探针吸取或放出超微量液体。单细胞容器用于接收超微量液体操作系统分离的单细胞，所述单细胞容器具有多个接收孔，每个接收孔作为一个接收区用于接收一个细胞；或者，所述单细胞容器具有一体的接收面，接收面具有经亲水处理的亲水点，每个亲水点作为一个接收区用于接收一个细胞。使用时，先在每个接收区加入一个接收液滴，再由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

超微量液体泵可以是注射泵、蠕动泵、压电泵、隔膜泵、启动压力泵、电渗流泵等。优选的，超微量液体泵是注射泵。

毛细管探针可以由毛细管拉制而成，也可以由其他工艺制成，如通过注塑工艺注塑而成。优选的，毛细管探针由石英毛细管拉制而成。优选的，毛细管探针的尖端孔径为0.1μm～1mm。更优选的，毛细管探针的尖端孔径为1μm～200μm。

所述单细胞容器可以为以下一种：微流控芯片、标准孔板、培养皿、塑料离心管、载玻片。当所述单细胞容器为培养皿或载玻片时，用于接收单细胞的区域称为接收面，通过亲水处理在接收面上形成亲水点。

本申请所述微体积单细胞捕获装置还可以包括用于储存、分散或铺展细胞的细胞样品池。超微量液体操作系统从细胞样品池中吸取单细胞后放入单细胞容器中形成单细胞液滴。细胞样品池可以是培养皿、标准孔板、塑料离心管等容器。细胞样品池的底面可以是二氧化硅、氮化硅、塑料、树脂等材质的薄膜、微孔膜、片状物、块状物等平面。优选的，所述细胞样品池的底面具有微孔膜，微孔膜上具有用于吸住细胞的微通孔，所述微通孔的孔径大小略小于待捕获单细胞的大小。

本发明通过预先在单细胞容器中形成接收液滴，并将细胞悬液添加到细胞样品池中，然后利用毛细管探针吸取从细胞样品池的底面上吸取单细胞，最后将单细胞注射到单细胞容器的接收液滴中，形成单细胞液滴，从而实现单细胞的微体积捕获。

本发明还提供了一种微体积单细胞捕获方法，使用所述微体积单细胞捕获装置，所述微体积单细胞捕获方法包括以下步骤：

(1)在单细胞容器的每个接收区加入一个接收液滴；

(2)由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

优选的，当接收液滴的体积为皮升级至纳升级、且所述单细胞容器具有一体的接收面时，在接收面上加入用于防止接收液滴及单细胞液滴蒸发的矿物油或氟油。当接收液滴的体积为微升级时，由于液滴体积足够大，蒸发的影响相对较小，可以不使用矿物油或氟油。

超微量液体操作系统吸取待处理的细胞前，先将细胞配置成细胞悬液。细胞悬液包含细胞和载液。细胞可以是动物细胞、植物细胞、细菌、真菌、花粉颗粒、凝胶微粒及其他形似细胞的颗粒物。细胞载液可以是磷酸盐缓冲溶液、细胞培养液或水。优选的，细胞悬液是含有哺乳动物细胞的磷酸盐缓冲溶液。

优选的，步骤(1)中，毛细管探针在形成接收液滴时的注射体积为1fL～100μL，注射流速为1fL/s～10mL/s，毛细管探针尖端与单细胞容器的距离为0～5mm。更优选的，注射体积为1pL～10μL，注射流速为1pL/s～1mL/s，距离为0～0.5mm。进一步优选的，注射体积为10pL～1μL，注射流速为10pL/s～0.1mL/s，距离为0～0.1mm。

优选的，毛细管探针在吸取平面上的细胞时，毛细管探针尖端与平面的距离为0～0.5mm，吸取体积为1fL～100μL，吸取流速为1fL/s～10mL/s。进一步优选的，距离为0～0.1mm，吸取体积为10pL～1μL，吸取流速为10pL/s～100μL/s。

优选的，毛细管探针将细胞转移至接收液滴时，注射体积为1～200倍于吸取体积，注射流速为10pL/s～10mL/s。进一步优选的，注射体积为1～10倍吸取体积，注射流速为10pL/s～100μL/s。

本申请微体积单细胞捕获装置在使用时，超微量液体操作系统的移动可以由手工操作，也可以由计算机控制的自动平移台自动完成。毛细管探针注射和吸取溶液的操作可以由人手动控制，也可以由计算机软件程序化、自动化地控制。

实施例1

如图1和2所述，一种基于接收液滴的微液滴单细胞捕获装置，包括：

(1)超微量液体操作系统，该系统包括超微量液体泵1和毛细管探针2，用于操纵和控制纳升级至皮升级液体；

(2)细胞培养皿作为细胞样品池3；

(3)玻璃材质的单细胞容器5。

在该实施例中，细胞为哺乳动物细胞，尺寸在10～25μm之间。

在该实施例中，单细胞容器5的底面预先处理有亲水点11，亲水点11的数目大于或等于所需接收液滴6的数目。亲水点11为圆形的局部亲水区域，尺寸与接收液滴6的底面尺寸相等。亲水点11的一般处理方法为：对亲水点11所在区域进行等离子体亲水处理，并对其他区域作疏水处理，从而使亲水点11的表面亲疏水性与其他区域形成显著差异，以便于接收液滴6的形成与锚定。

在该实施例中，超微量液体操作系统固定于手动三维平移台上，使得毛细管探针2能够在细胞样品池3和细胞容器5上精准定位。

在该实施例中，毛细管探针2由石英毛细管拉制而成，尖端孔径为50～60μm。

在该实施例中，细胞样品池3中装有PBS(磷酸盐缓冲溶液)作为单细胞载液7。

在该实施例中，单细胞容器5中装有矿物油或氟油10，以防止接收液滴6与单细胞液滴9的蒸发。

如图2所示，该实施例的操作步骤如下：

①利用手动三维平移台控制装置的移动，使毛细管探针2移动至装有矿物油或氟油10的单细胞容器5的亲水点11上方，通过注射溶液，在该亲水点11上形成第一个接收液滴6。

②重复前一步骤，直至生成所需数量的接收液滴6。

③控制三维平移台，使毛细管探针2的尖端移动至细胞样品池3，精准定位到单细胞8，通过吸取溶液，使单细胞8进入毛细管探针2内。

④将毛细管探针2尖端移动至单细胞容器5的某个接收液滴6上方，通过注射溶液，使单细胞8转移至接收液滴6中，形成单细胞液滴9。

⑤形成第一个单细胞液滴9后，通过重复③、④步骤，形成实际所需数目的单细胞液滴9。

在步骤①中，毛细管探针2形成接收液滴6时的注射体积为50nL，注射流速为1μL/s。

在步骤③中，毛细管探针2吸取细胞样品池中3上的单细胞8时，毛细管探针2尖端与平面4的距离为0.02～0.1mm，吸取体积为100nL，吸取流速为1μL/s

在步骤④中，毛细管探针2通过注射溶液打出单细胞8时，注射体积为200nL，注射流速为1μL/s。

本实施例中，通过手动操作96次，可成功将96个单细胞捕获至独立的液滴中，生成96个单细胞液滴，成功率达100％。

实施例2

本实施例的操作方法与实施例1类似，但实验流程由计算机软件自动控制，且装置中的细胞样品池3和单细胞容器5与实施例1不同。

如图3所示，一种基于接收液滴的微液滴单细胞捕获装置，包括：

(1)超微量液体操作系统，该系统包括超微量液体泵1和毛细管探针2；

(2)细胞样品池3；

(3)单细胞容器5。

在该实施例中，细胞样品池3中装有PBS(磷酸盐缓冲溶液)作为单细胞载液7。

本实施例中，为了使细胞分散得更均匀，使细胞定位与操控更易于自动化，细胞样品池3的底面4含有微孔膜。进一步地，微孔膜表面具有规则排列的微通孔，微通孔直径为5μm～12μm，孔深度为1μm～30μm，通孔形状为圆柱体。细胞样品池3中的细胞在液位差的作用下，被微通孔吸住，且被固定于微通孔上端。因此细胞与微通孔排列一致，且不易发生位移，从而避免了细胞移动导致的单细胞吸取失败的问题。在单细胞捕获时，只需将毛细管探针2的尖端移动至微通孔上方，即可吸取固定于该微孔上端的单细胞8。

在本实施例中，单细胞容器5为标准的1536孔板。不同的单细胞容器适用于不同体积的单细胞液滴。在实施例1中，玻璃芯片主要用于纳升级与皮升级单细胞液滴的生成。而在本实施例中，标准孔板用于微升级单细胞液滴的生成。由于液滴蒸发影响较小，本实施例中不需要使用矿物油或氟油，单细胞容器5无矿物油或氟油覆盖。标准孔板的每一个微孔内加入一滴接收液滴6，并在放入单细胞8后形成单细胞液滴9。

在本实施例中，装置的移动是由计算机控制的自动三维平移台自动完成的，毛细管探针的注射与吸取也由计算机软件程序化地控制。

本实施例中，通过预先编写实验流程，利用计算机自动化地、快速地完成96次单细胞捕获过程，可成功将95个单细胞捕获并分离至标准1536孔板的95孔，成功率达99％。

Claims (8)

1.一种微体积单细胞捕获装置，其特征在于，包括：

超微量液体操作系统，包括超微量液体泵和毛细管探针，所述超微量液体泵用于驱动所述毛细管探针吸取或放出超微量液体；

单细胞容器，用于接收超微量液体操作系统分离的单细胞，所述单细胞容器具有多个接收孔，每个接收孔作为一个接收区用于接收一个细胞；或者，所述单细胞容器具有一体的接收面，接收面具有经亲水处理的亲水点，每个亲水点作为一个接收区用于接收一个细胞，

使用时，先在每个接收区加入一个接收液滴，再由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

2.根据权利要求1所述微体积单细胞捕获装置，其特征在于，毛细管探针的尖端孔径为0.1μm～1mm。

3.根据权利要求2所述微体积单细胞捕获装置，其特征在于，毛细管探针的尖端孔径为1μm～200μm。

4.根据权利要求1所述微体积单细胞捕获装置，其特征在于，所述单细胞容器为以下一种：微流控芯片、标准孔板、培养皿、塑料离心管、载玻片，

当所述单细胞容器为培养皿或载玻片时，用于接收单细胞的区域称为接收面，通过亲水处理在接收面上形成亲水点。

5.根据权利要求1所述微体积单细胞捕获装置，其特征在于，还包括用于储存、分散或铺展细胞的细胞样品池。

6.根据权利要求5所述微体积单细胞捕获装置，其特征在于，所述细胞样品池的底面具有微孔膜，微孔膜上具有用于吸住细胞的微通孔，所述微通孔的孔径大小略小于待捕获单细胞的大小。

7.一种微体积单细胞捕获方法，其特征在于，使用权利要求1～6任一所述微体积单细胞捕获装置，所述微体积单细胞捕获方法包括以下步骤：

(1)在单细胞容器的每个接收区加入一个接收液滴；

(2)由超微量液体操作系统将分离的单细胞转移到接收区的接收液滴中，每个接收区转移一个细胞形成单细胞液滴。

8.根据权利要求7所述微体积单细胞捕获方法，其特征在于，当接收液滴的体积为皮升级至纳升级、且所述单细胞容器具有一体的接收面时，在接收面上加入用于防止接收液滴及单细胞液滴蒸发的矿物油或氟油。

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