CN111389049B - 一种用于超微量样品的液-液微萃取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于超微量样品的液‑液微萃取方法。步骤如下：S1：利用探针取萃取溶剂；S2：将带有萃取溶剂的探针尖端逐渐靠近样品液滴，使萃取溶剂以液滴形式挂载于探针尖端，且萃取溶剂液滴与样品液滴接触形成传质交换界面，使样品液滴中的待萃取组分通过所述传质交换界面被萃取至萃取溶剂液滴中；萃取过程中保持探针尖端始终接触萃取溶剂液滴；S3：待充分传质后，利用探针回收萃取溶剂液滴；S4：对萃取溶剂液滴进行进一步清洗，去除残留样品。本发明具有装置简单、体系微量、操作快速、灵活度高等优点。本发明适用于超微量的化学和生物分析、单细胞和细胞器分析等复杂基质的样品前处理分析，以及单细胞多组学等前处理过程。

Description

一种用于超微量样品的液-液微萃取方法
技术领域
本发明涉及的领域为液相微萃取和微流控液-液萃取领域，特别涉及一种用于超微量样品的液-液微萃取方法。
背景技术
与传统的液-液萃取(LLE)技术相比，液相微萃取(LPME)技术具有一些明显的优势，包括较低的试剂消耗，较高的预浓缩能力和较短的萃取时间。目前，LPME技术已经发展了多种实施方法，具体可以分为三大类：单滴微萃取(SDME)，中空纤维液相微萃取(HF-LPME)和分散液-液微萃取(DLLME)。在SDME方法中，与水不混溶的有机液滴悬浮在微量注射器的尖端，并直接浸没在样品溶液中或暴露在样品溶液上方的空气中。萃取后，将有机液滴吸回微量注射器中进行分析。在HF-LPME方法中，聚合物中空纤维用作萃取相的载体以保护萃取剂。通过毛细作用力将有机溶剂固定并保持在多孔疏水性中空纤维的孔中，并利用微量注射器把接受相引入中空纤维的内腔中。DLLME方法通过使用与水相和有机相完全混溶的分散剂溶剂在样品中形成有机萃取溶剂的微小液滴来实现样品和萃取相的充分接触，使得目标分析物可以得到快速和有效萃取。
同时，微流控芯片技术的出现为LLE微型化提供了一个理想的工具，它可以显著减少溶剂消耗，提高萃取速度。到目前为止，已经开发出各种不同的基于微流控的LLE方法。文献报道了一系列基于微流控芯片的LLE系统，该系统在微通道中形成两相或多相层流。基于分子扩散，分析物从水相层流通过水/有机界面转移到有机相层流中。此外，研究人员开发了各种基于膜的LLE微流控芯片系统，其中多孔膜用于分离样品溶液和萃取相。
在上述微萃取方法中，试剂的体积通常在几微升至几十微升的范围内，并且样品的体积通常在微升甚至毫升的范围内。因此，这些微萃取方法可能在纳升级系统的测定中受到限制，例如液滴微流控体系。液滴微流控近年来引起了很多关注，因为其能够在不显著稀释和蒸发样品的情况下进行大量单独的微量反应和分析。到目前为止，液滴微流控已成功应用于药物开发，药物筛选，单细胞分析等方面的研究。然而，目前大多数液滴微流控的分析方法依赖于显微成像和荧光技术。这些分析技术通常需要对分析物进行荧光标记，并且难以检测具有复杂组分的液滴。与其他检测技术相比，MS对于具有复杂组分的液滴系统更具吸引力，因为它灵敏度高，可实现无标记检测和多种分析物的同时检测。在MS分析之前，样品制备是分析复杂样品的关键步骤，以便提取和浓缩复杂基质中的目标分析物。然而，迄今为止，几乎没有关于在纳升级范围内进行液滴-液滴微萃取的报道。此外，实现溶剂液滴和样品液滴之间的微萃取仍然是一个主要的挑战，因为两者均为纳升级的体积，从而在微萃取过程对液体操纵能力提出了很高的要求。
发明内容
本发明提供了一种用于超微量样品的液-液微萃取方法。该方法中，萃取溶剂液滴和样品液滴的体积均降至nL级，仅为传统液-液萃取体系的十万分之一。根据萃取溶剂的不同溶解性质，我们提出了两种微萃取模式：液滴并列式液-液微萃取和液滴包裹式液-液微萃取。本发明具有装置简单、体系微量、操作快速，灵活度高等优点。本发明适用于超微量的化学和生物分析、单细胞和细胞器分析等复杂基质的样品前处理分析，以及单细胞多组学等前处理过程。
本发明具体采用的技术方案如下：
一种用于超微量样品的液-液微萃取方法，其包括如下步骤：
S1：利用探针取萃取溶剂，所述探针上具有一个能挂载萃取溶剂液滴的探针尖端；将待萃取的样品液滴预先置于防蒸发空间中，且保持单颗液珠形态；所述萃取溶剂与所述样品液滴不易溶；
S2：将带有萃取溶剂的探针尖端逐渐靠近样品液滴，使萃取溶剂以液滴形式挂载于探针尖端，且萃取溶剂液滴与样品液滴接触形成传质交换界面，使样品液滴中的待萃取组分通过所述传质交换界面被萃取至萃取溶剂液滴中；萃取过程中保持探针尖端始终接触萃取溶剂液滴；
S3：待充分传质后，利用探针回收萃取溶剂液滴；
S4：对萃取溶剂液滴进行进一步清洗，去除残留样品。
作为优选，所述S2中，带有萃取溶剂的探针尖端逐渐靠近样品液滴的过程中，探针尖端悬停于样品液滴的外侧不进入样品液滴内，探针尖端与样品液滴外表面之间的距离应保证其尖端挂载的萃取溶剂液滴在样品液滴的表面包裹形成液膜，且液膜与探针尖端接触粘附。为了便于描述，将该方法命名为液滴并列式液-液微萃取。
作为优选，所述S2中，带有萃取溶剂的探针尖端插入样品液滴内部，使其尖端挂载的萃取溶剂液滴被样品液滴包裹。为了便于描述，将该方法命名为液滴包裹式液-液微萃取。
在上述任意一种技术方案基础上，本发明还可以进一步提供以下一种或多种优选实现形式。
进一步的，所述的探针为空心结构，所述的萃取溶剂预先被吸入探针的内腔，在探针尖端携带萃取溶剂逐渐靠近样品液滴并达到目标位置后，重新将内部萃取溶剂不完全地推出，使萃取溶剂以液滴形式挂载于探针尖端；当萃取完毕后，重新将萃取溶剂全部或过量吸入探针的内腔，然后随探针一并脱离样品液滴；优选的，在探针吸取萃取溶剂前，先吸取载液使其进入并填充探针内腔，然后再吸取与载液和萃取溶剂不互溶的第三相，用于将载液与后续吸入的萃取溶剂相隔离；优选的，探针的长度在1毫米至50厘米范围内，内径或内边长在1纳米至5毫米范围内，其管壁厚度在1纳米至5毫米范围内；优选的，所述探针尖端对样品液滴无亲和性或弱亲和性。
进一步的，所述的探针为实心结构，探针尖端加工成用于承载萃取溶剂的微结构；利用探针取萃取溶剂时，将探针尖端插入萃取溶剂中再移出，使部分萃取溶剂负载于探针尖端的微结构上，形成萃取溶剂液滴；然后由探针尖端携带萃取溶剂液滴靠近样品液滴进行萃取；萃取完毕后，缓慢收回探针，使探针尖端携带萃取溶剂液滴重新脱离样品液滴；优选的，探针的长度在1毫米至50厘米范围内，其直径或边长在1纳米至5毫米范围。
进一步的，所述S2中的萃取采用静态萃取或动态萃取；所述静态萃取的整个萃取过程中，萃取溶剂液滴与样品液滴保持不动；所述动态萃取的整个萃取过程中，萃取溶剂液滴相对于样品液滴来回移动，使萃取溶剂液滴与样品液滴之间的传质交换界面覆盖样品液滴的不同位置，但移动过程中萃取溶剂液滴不脱离样品液滴。
进一步的，所述样品液滴置于防蒸发空间中的方法为：
将样品液滴置于高饱和度蒸汽空间内；
或者将样品液滴置于高密闭度的空间内；
或者在样品液滴上覆盖一层与样品液滴和萃取溶剂不互溶的第三相。
进一步的，所述的样品液滴置于液滴阵列芯片上，一个液滴阵列芯片上具有一个或多个液滴容纳部位，每个部位容纳的样品液滴体积范围是1飞升至100微升；优选的，所述液滴阵列芯片同时容纳有多个并排且间隔的样品液滴，所述探针有多条，并排对多个样品液滴进行同步萃取。
进一步的，所述S4中，萃取溶剂液滴的清洗方法为：
S41：将清洗液滴预先置于防蒸发空间中，且保持完整的液珠形态；所述清洗液滴为与样品液滴为同一相的不含待测物和干扰物空白液滴，且待萃取组分不易溶于该清洗液滴；
S42：以清洗液滴替代样品液滴，重复步骤S2和S3，使残留的样品液滴被去除。
进一步的，当探针为空心结构时，所述S2中，首先将带有萃取溶剂的探针尖端垂直向下逐渐靠近样品液滴，且探针尖端悬停在刚好接触或即将接触样品液滴顶部的位置；然后将内部萃取溶剂不完全地推出，使萃取溶剂液滴在样品液滴顶部铺展成液膜；然后控制探针尖端以当前位置为中心水平往复移动，待样品液滴中的待萃取组分通过传质交换界面被完全萃取至萃取溶剂液滴中后，控制探针尖端回到中心处；在保证萃取溶剂液滴不脱离探针尖端的情况下，将探针尖端向上垂直提升一定距离，再开始对萃取溶剂液滴进行抽吸，完全回收萃取溶剂液滴；优选的，样品液滴体积为100nL，被推出探针尖端的萃取溶剂液滴体积为10nL时，探针尖端向上垂直提升的距离为40μm。
本发明的优点主要在于：(1)与常规LLE方法相比，该方法所用样品和溶剂体积均由mL级降至nL级，样品需求量至少降低了5个数量级。(2)与文献中报道的LPME方法相比，本系统中的样品消耗量已从微升级甚至毫升级降至纳升级。(3)与基于微流控芯片的微萃取方法相比，本系统可以实现直接定量测定单个具有复杂基质的纳升级样品液滴中的目标分析物，它为具有复杂基质的纳升液滴进行样品预处理(液-液萃取)和MS定量测定提供了一种解决方案。(4)可以分别与荧光、MS、高分辨率液相色谱或毛细管电泳结合用于检测液滴系统。(5)操作简单，快速，灵活，不需要对芯片进行复杂的设计。由于液滴具有较高的比表面积，传质时间和扩散距离更短。萃取溶剂液滴与样品液滴的体积均为纳升级，它们之间的接触面积相对较大，两相之间的传质速率更快。通过理论模型计算和实验证明，与液滴包裹式液-液微萃取模式相比，液滴并列式液-液微萃取模式中的传质速度更快，萃取时间更短。该系统在操作模式和模式切换方面非常灵活，例如液滴操作，静态和动态模式，样品液滴更换和液滴体积调节等。本发明适用于超微量的化学和生物分析、单细胞和细胞器分析等复杂基质的样品前处理分析，以及单细胞多组学等前处理过程。
附图说明
图1是液滴并列式液-液微萃取模式在静态模式下的操作过程示意图。
图2是液滴包裹式液-液微萃取模式在静态模式下的操作过程示意图。
图3是液滴包裹式液-液微萃取模式在高通量阵列下的操作过程示意图。
图4是液滴包裹式液-液微萃取(a)和液滴并列式液-液微萃取模式(b)分别在静态和动态条件下的萃取效率和萃取时间的关系。
图5是液滴并列式液-液微萃取模式下萃取效率与探针提升的高度差值dz的关系。实验条件：RGB液滴，100nL，5×10-4mol/L；正己醇液滴，10nL。
图中附图标记为：1-探针，2-油相，3-液体驱动系统，4-载流，5-萃取溶剂，6-多孔板，7-液滴阵列芯片，8-样品液滴，9-移动台，10-探针尖端，11-萃取溶剂液滴，12-探针阵列，13-样品液滴阵列。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明：
一种用于超微量样品的液-液微萃取方法，包括如下步骤：
步骤一、利用探针取萃取溶剂，探针上应当具有一个能挂载萃取溶剂液滴的探针尖端。在进行萃取之前，将待萃取的样品液滴应当预先置于防蒸发空间中，且保持完整的液珠形态。所谓的防蒸发空间是指能够防止微量的样品液滴蒸发的空间，具体形式我们将通过后文进行详述。所谓的完整的单颗液珠形态是指样品液滴以一颗类球形或半球形液滴形式存在，而不能是液膜或者分散成多颗液珠形式。
步骤二、将带有萃取溶剂的探针尖端逐渐靠近样品液滴，使萃取溶剂以液滴形式挂载于探针尖端，且萃取溶剂液滴与样品液滴接触形成传质交换界面，使样品液滴中的待萃取组分通过所述传质交换界面被萃取至萃取溶剂液滴中。萃取过程中保持探针尖端始终接触萃取溶剂液滴，由此萃取溶剂液滴可以通过表面张力与探针尖端形成粘附，进而有利于后续的移动和回收。
步骤三、待充分传质后，利用探针回收萃取溶剂液滴；
步骤四、由于步骤三回收的液滴中可能还存在残留的样品，因此需要对萃取溶剂液滴进行进一步清洗，去除残留样品。
在上述萃取过程中，萃取溶剂液滴与样品液滴都可以是超微量(如纳升级)的。为了保证萃取功能的实现，本发明中的萃取溶剂与样品液滴应当是不易溶的。在实际萃取过程中，探针需要进行移动，其移动可以通过移动台等设备实现，但由于本发明的样品都是超微量的，因此对于移动台的精度要求也相应较高。
在上述步骤二中，样品液滴可以置于液滴阵列芯片上，以便于操作。一个液滴阵列芯片上具有一个或多个液滴容纳部位。通过移动移动台，使得探针尖端和液滴阵列芯片上的样品液滴对准，下降探针尖端至特定位置。该特定位置既可以是样品液滴外部也可以是样品液滴内部，而根据位置的不同本发明可以形成两种完全不同的操作模式。第一种是在样品液滴顶部形成与样品液滴接触的萃取溶剂液滴，命名为液滴并列式液-液微萃取模式；另一种操作模式是液滴包裹式液-液微萃取模式，下降探针尖端至其插入到样品液滴内一定深度d2时，使萃取溶剂在样品液滴内部形成萃取溶剂液滴。同样的，在上述步骤三中，根据萃取过程中萃取溶剂液滴与探针尖端移动与否，可以分为两种不同模式，分别为静态模式和动态模式。在静态模式下，整个萃取过程中萃取溶剂液滴悬浮在样品液滴上部或内部；在动态模式下，通过移动移动台，使样品液滴与萃取溶剂液滴之间在保持相互接触的条件下发生相对移动。这些不同模式的具体做法，将通过后文进行详细描述。
由此可见，本发明提供了一种用于超微量样品的液-液微萃取方法。然而，想要实现在两个超微量(如纳升级)液滴之间进行液-液微萃取存在以下三个主要挑战。首先，由于样品液滴和萃取溶剂液滴均为纳升级，因此在微萃取过程中，有效避免二者的蒸发尤为关键。其次，纳升级样品液滴的生成，纳升级萃取溶剂的吸入/注射等，均对微萃取系统的流体控制能力、定位精度等提出了很高的要求。第三，萃取溶剂液滴和样品液滴需要在萃取过程中保持稳定接触，并且在萃取完毕后完全分离，这需要微萃取系统的定位精度低至微米级，同时要发展新的操作程序。因此，针对以上挑战，我们采取以下措施。首先，为了有效避免样品液滴和萃取剂液滴的蒸发，用一层与样品不混溶的油相覆盖样品液滴，并且在油相中完成微萃取过程。其次，样品液滴和萃取溶剂液滴的生成以及萃取溶剂液滴的回吸通过具有皮升级精度的注射泵来实现。最后，使用高精度x-y-z平移台用于实现液滴的微米级移动和定位。
本发明尝试在样品液滴中形成萃取溶剂液滴，并保持萃取溶剂液滴稳定的悬浮在样品液滴内。在实验中分别使用罗丹明B(RGB)溶液(5×10-4mol/L，100nL)和氯仿(10nL)作为模型样品液滴和萃取溶剂液滴。实验结果表明，利用本系统可以在毛细管尖端形成10nL的萃取溶剂液滴，该萃取溶剂液滴可以非常稳定地悬浮在100nL的样品液滴内。因此，根据两个液滴之间的位置关系，我们将这种微萃取模式命名为液滴包裹式液-液微萃取模式。由于萃取溶剂液滴在萃取过程中始终保持在样品液滴内，因此理论上，该模式可适用于所有不易溶于水的萃取溶剂。为了进一步研究该萃取模式的适用性，我们分别测试了不同的萃取溶剂，包括二甲苯，溴苯，异辛烷，正己烷和二氯甲烷等。实验结果表明，以上所有溶剂均可以稳定地悬浮在样品液滴内。
参见图2所示，在上述步骤二中，液滴包裹式液-液微萃取模式的具体做法为：带有萃取溶剂5的探针尖端10插入样品液滴8内部，推出萃取溶剂形成液滴形式，使其尖端挂载的萃取溶剂液滴11被样品液滴包裹。
对于不易溶于水相和油相的萃取溶剂，我们发明了另一种微萃取模式——液滴并列式液-液微萃取模式，即在样品液滴顶部形成萃取溶剂液滴。在实验中，RGB溶液(5×10- 4mol/L，100nL)和正己醇(10nL)分别用作模型样品液滴和萃取溶剂液滴。当毛细管尖端刚好与样品液滴的顶部边缘接触时，注射10nL的萃取溶剂。我们观察到一个新现象，当萃取溶剂液滴不脱离毛细管尖端时，由于毛细管尖端对萃取溶剂液滴的附着固定作用，可以在样品液滴的顶部边缘上形成稳定的萃取溶剂液滴，且萃取溶剂液滴不会沿样品液滴边缘滑落；如果在样品液滴区域内通过移动平移台使得毛细管尖端和样品液滴之间水平相对运动，则毛细管尖端还可以带着萃取溶剂液滴沿着样品液滴的半球形边缘往复滑动，但仍保持与样品液滴的稳定接触而不会沿样品液滴边缘滑落；后续实验证明，这种相对运动能显著加速萃取过程中的传质效应，进而缩短萃取时间；如果毛细管尖端脱离萃取溶剂液滴，则萃取溶剂液滴会在样品液滴表面上不规则地滑动至掉落，因而其与样品液滴的接触将是不稳定且不可控的。由于萃取溶剂液滴在萃取过程中始终保持在样品液滴上，因此该微萃取模式被命名为液滴并列式液-液微萃取模式。与液滴包裹式液-液微萃取模式相比，液滴并列式液-液微萃取模式中萃取溶剂液滴相当于铺在样品液滴上方，因而具有更大的萃取溶剂液滴和样品液滴接触面积，同样有利于加速萃取过程中的传质效应，进而缩短萃取时间。
参见图1所示，在上述步骤二中，液滴并列式液-液微萃取模式的具体做法为：带有萃取溶剂5的探针尖端10逐渐靠近样品液滴8的过程中，探针尖端10悬停于样品液滴8的外侧不进入样品液滴8内，探针尖端10与样品液滴8外表面之间的距离应保证其尖端挂载的萃取溶剂液滴11在样品液滴8的表面包裹形成液膜，且液膜与探针尖端10接触粘附。
由于萃取溶剂液滴的完全回收直接影响样品液滴的准确定量，因此在微萃取过程中对萃取溶剂液滴的完全回收也非常关键。在液滴包裹式液-液微萃取模式中，可以直接将萃取溶剂液滴回吸到毛细管探针中，完成萃取剂液滴的回收。并且为了确保萃取剂液滴的完全回收，回吸到毛细管中的体积比注射的体积多1nL。然后用水液滴快速清洗多回吸的1nL萃取剂液滴，以进一步除去残留的样品溶液。在液滴并列式液-液微萃取模式中，我们观察到，回吸萃取剂液滴时毛细管尖端的位置对萃取溶剂液滴的回收具有显著的影响。如果毛细管尖端的位置不合适，则会导致萃取溶剂液滴部分损失。基于此，我们优化了液滴回收过程中对应的z轴高度差dz(即探针提升的高度差值)，也就是说样品液滴中的待萃取组分被完全萃取至萃取溶剂液滴中后，需要先将探针尖端向上垂直提升一定距离dz，再开始对萃取溶剂液滴进行抽吸，完全回收萃取溶剂液滴。回收萃取溶剂液滴时，dz对萃取溶剂液滴回收的完整性有着较大的影响。如果探针提升的高度差值dz不合适，则会导致萃取溶剂液滴的部分损失。
需要注意的是，在上述步骤一中，萃取溶剂5可以通过表面张力直接挂载在探针尖端10，也可以预先被吸入探针尖端10，当需要时再被推出探针尖端10形成液滴。对应的，本发明中的探针可为空心或者实心结构，材质为无机物、或者有机物、或者高分子聚合物等材料；探针长度在1毫米至50厘米范围内，如果探针为空心结构，其内径或内边长在1纳米至5毫米范围内，其管壁厚度在1纳米至5毫米范围内；作为优选，探针可选择拉制尖端的毛细管，尖端有利于进行萃取溶剂液滴的注射与回吸等操作；如果探针为实心结构，其直径或边长在1纳米至5毫米范围内，且其底端结构可加工成微结构，用于承载萃取溶剂；根据样品液滴的性质，选择表面对样品液滴无亲和性或弱亲和性的探针，如果所述的探针对样品液滴亲和性较强，则需要对探针进行表面处理，使得探针表面对样品液滴无亲和性或弱亲和性。如采用对探针的表面进行硅烷化、或者氟烷化、或者聚合物涂层或者其他的表面处理以降低表面吸附，减小亲和性。
当探针1为空心结构时，萃取溶剂5预先被吸入探针1的内腔，在探针尖端10携带萃取溶剂5逐渐靠近样品液滴8并达到目标位置后，重新将内部萃取溶剂5不完全地推出，使萃取溶剂5以液滴形式挂载于探针尖端10；当萃取完毕后，重新将萃取溶剂5全部或过量吸入探针1的内腔，然后随探针1一并脱离样品液滴8。
当探针1为实心结构时，探针尖端10利用底部的微结构进行液滴负载。即利用探针1取萃取溶剂5时，将探针尖端10尖端插入萃取溶剂5中再移出，使部分萃取溶剂5负载于探针尖端10的微结构上，形成萃取溶剂液滴11；然后由探针尖端10携带萃取溶剂液滴11靠近样品液滴8进行萃取；萃取完毕后，缓慢收回探针1，使探针尖端10携带萃取溶剂液滴11重新脱离样品液滴8。
上述两种方式，考虑到操作的便捷性，以空心探针为佳。
因此，本发明进一步设计了用于实现该方法的一套基于探针的液滴操纵系统，该系统可包括至少一根探针、至少一套具有抽取和推出的双向液体驱动能力的驱动系统、至少一个加工有多个微孔或多个特定区域的液滴阵列芯片、多个承载样品，或萃取溶剂，或有机溶剂的多孔板和至少一套移动台组成，所述的探针的一端与驱动系统相连通，探针的另一端作为取样口，即探针抽取和推出液体的进出口，液滴阵列芯片和多孔板固定于移动台上。作为优选，所述液体驱动系统对流体驱动的精度应低至皮升至纳升级；所述移动台的定位精度应低至微米级。
本发明中，所述的样品液滴是指被分析的目标样品液滴；所述的萃取溶剂是萃取过程中用作萃取相的水或有机溶剂或酸碱溶液等其他性质的液体。在液滴并列式液-液微萃取模式和液滴包裹式液-液微萃取模式中，萃取溶剂均应不易溶于样品液滴。作为优选，在液滴并列式液-液微萃取模式中，萃取溶剂应既不易溶于样品液滴又不易溶于第三相，如正己醇、异辛醇、二甲苯和溴苯等；在液滴包裹式液-液微萃取模式中，萃取溶剂应不易溶于样品液滴，如正己醇、异辛醇、二甲苯、溴苯、异辛烷、正己烷、二氯甲烷和氯仿等。因此，液滴包裹式液-液微萃取模式的适用溶剂范围相对更广。
本发明步骤一中，探针取萃取溶剂前，先吸取载液，填充注射器和探针的空间，避免存在气泡等影响萃取溶剂体积的准确性，作为优选，载液一般选择热膨胀系数较小的流体，减小温度对体积准确性的影响。或者作为进一步优选，在吸取载液后，吸取萃取溶剂前，再吸取与萃取溶剂不互溶的第三相，以将载液与后续吸入的萃取溶剂相隔离。
本发明中，所述的液滴阵列芯片应能够使样品液滴以半球形或类球形的形式静置在其表面，即样品液滴在芯片表面应具有一定的表面张力。芯片上容纳样品液滴的体积范围是1飞升至100微升，一个芯片上承载的样品液滴的数量范围是1个至1,000,000个。所述多孔板上加工有多个孔形容器，用于承载和储存多种不同的被取液体。为了与现有的商品化高通量系统实现无缝衔接，作为优选，所述多孔板采用商品化的96孔板，或384孔板，或1536孔板，或其他类型孔板，用来装载和储存多种不同的被取液体。
本发明中，所述防蒸发空间可以有多种实现形式，例如将液滴阵列芯片置于高饱和度蒸汽空间内，或者置于高密闭度的空间内，或者所述液滴阵列芯片表面覆盖有与样品液滴不互溶的第三相。在进行萃取溶剂取样、萃取溶剂液滴的形成和液滴液滴微萃取等操作过程中，将液滴阵列芯片置于高饱和度蒸汽空间内或者高密闭度的空间内以防止微量液滴的蒸发；或者是在液滴阵列芯片上覆盖一层与样品液滴和萃取溶剂不互溶的第三相以防止微量液滴的蒸发。第三相包括矿物油、或者硅油、或者植物油、或者氟油、或者其他类型的液体，第三相的厚度范围为0.1毫米至50毫米。
本发明步骤二中，所述的下降探针尖端至其与样品液滴顶部的距离小于一定值d1时，针对萃取溶剂液滴在探针尖端呈现的不同的形态，该d1值会相应改变，如果萃取溶剂液滴在探针尖端呈球形状态，则d1值应小于等于萃取溶剂液滴的直径R，如果萃取溶剂液滴在探针尖端不呈球形状态，直接粘附在探针侧壁上，则d1值应小于等于粘附在探针侧壁上的萃取溶剂刚好能接触到样品液滴的距离；作为优选，在液滴并列式液-液微萃取模式中，可以下降探针尖端至其刚好与样品液滴顶部接触，即d1值为0，这样可以最大程度的避免萃取溶剂液滴因粘附在探针侧壁等导致的损失。所述的下降探针尖端至其插入到样品液滴内一定深度d2时，d2最小值应大于0，即探针尖端刚好穿过样品液滴顶部边界，最大值应小于样品液滴的高度与萃取溶剂液滴的直径R之间的差值。作为优选，在液滴包裹式液-液微萃取模式中，d2值约等于样品液滴直径R的三分之一为宜，这样萃取溶剂液滴可以悬浮在样品液滴的中心位置，比较稳定，既不会因为浮力作用滑到探针侧壁上，又不会因重力作用掉落在样品液滴的底部。
本发明步骤三中，在静态模式下，萃取溶剂液滴静止的悬浮在样品液滴上部或内部，是利用萃取溶剂液滴对探针的附着力，萃取溶剂液滴悬在探针尖端或侧壁上。在动态模式下，通过移动移动台，样品液滴与萃取溶剂液滴之间发生相对移动，使萃取溶剂液滴与样品液滴之间的传质交换界面覆盖样品液滴的不同位置，但移动过程中萃取溶剂液滴不脱离样品液滴。作为优选，在液滴包裹式液-液微萃取模式中，相对移动的最大移动范围不应超过样品液滴的半径，在液滴并列式液-液微萃取模式中，相对移动的最大移动范围不应超过样品液滴的三分之二直径。
本发明步骤四中，回收萃取溶剂液滴至探针，在液滴包裹式液-液微萃取模式中，操作液体驱动系统将萃取溶剂直接回吸到探针内。在液滴并列式液-液微萃取模式中，需要控制探针提升的高度，来保证萃取溶剂液滴的完全回收。作为优选，回收的体积比萃取溶剂液滴的体积大十分之一以保证萃取溶剂液滴的完全回收。
另外，当探针为空心探针，且液滴并列式液-液微萃取模式在静态模式下进行萃取时，上述步骤二优选采用以下方法进行萃取：
首先将带有萃取溶剂5的探针尖端10垂直向下逐渐靠近样品液滴8，且探针尖端10悬停在刚好接触或即将接触样品液滴8顶部的位置；然后将内部萃取溶剂5不完全地推出，使萃取溶剂液滴11在样品液滴8顶部铺展成液膜；然后控制探针尖端10以当前位置为中心水平往复移动，待样品液滴8中的待萃取组分通过传质交换界面被完全萃取至萃取溶剂液滴11中后，控制探针尖端10回到中心处；在保证萃取溶剂液滴11不脱离探针尖端10的情况下，将探针尖端10向上垂直提升一定距离，再开始对萃取溶剂液滴11进行抽吸，完全回收萃取溶剂液滴11。在我们测试的体系内，在萃取溶剂液滴为10nL和样品液滴为100nL的条件下，当dz为35μm时，萃取效率为46.3±4.0％；当dz为45μm时，萃取效率为81.8±7.2％；当dz为40μm时，萃取效率可高达89.7±4.1％(详见图5)。
本发明步骤五中，对萃取溶剂液滴进行清洗，清洗的操作步骤与形成萃取溶剂液滴类似，只是采用清洗液滴代替样品液滴进行操作；清洗液滴是指与样品液滴为同一相的不含待测物和干扰物空白液滴，且萃取待测物应不易溶于该清洗液滴。
清洗的具体步骤可参见如下：
首先，将清洗液滴预先置于防蒸发空间中，且保持完整的液珠形态；然后以清洗液滴替代样品液滴8，重复上述步骤二和三，使残留的样品液滴8被去除。但需要说明的是，在此处重复步骤二时，不一定需要将大部分萃取溶剂都推出探针尖端10，可以仅推出最下方的一小段，因为样品主要残留在最后吸入的部分萃取溶剂中。
本发明采用的液体驱动系统为具有抽取和推出能力的双向液体驱动系统，包括注射泵、蠕动泵、电渗泵、气压泵或其他泵。本发明中液滴的检测方法可以采用激光诱导荧光、化学发光、电化学、紫外可见光度、显微成像、质谱等多种方法进行检测。
本发明中，作为优选，液滴阵列芯片同时容纳有多个并排且间隔的样品液滴，可采用多根探针形成探针阵列平行对多个样品液滴进行液-液萃取操作，完成萃取溶剂取样、萃取溶剂液滴的形成、液滴液滴微萃取、回收萃取溶剂液滴、清洗萃取溶剂液滴等操作，以提高操作的通量。
为了更便于本领域技术人员理解，本发明将参照附图，详细描述根据本发明的若干优选实施例。
实施例1
图1是液滴并列式液-液微萃取模式在静态模式下的操作过程示意图。100nL的罗丹明溶液和10nL的正己醇溶剂分别作为样品液滴和萃取溶剂液滴。其具体的操作过程如下：使用探针1作为取样探针，将其尾部与液体驱动系统3相连。对探针1的取样口10进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对探针1的内壁和取样口10的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在探针1中充满低热膨胀系数的液体作为载液4，并完全去除探针1和液体驱动系统3中的气泡。在探针1的取样口10引入一段与样品/稀释液不互溶的油相2来间隔载液4和萃取溶剂5。将储存萃取溶剂5的多孔板6和液滴阵列芯片7固定在可三维移动的移动台9上。利用注射泵作为液体驱动系统3，并且在液滴阵列芯片7上覆盖一层油相2来避免微量样品的蒸发。移动移动台9，使探针1取样口10浸入萃取溶剂5的多孔板6中定量抽取一定体积的萃取溶剂5进入探针1中。再次移动移动台9，使探针1的取样口10刚好接触到样品液滴8，定量注射一定体积的萃取溶剂5。待萃取完毕，提升探针1至适当距离，利用液体驱动系统3回收萃取溶剂液滴11至探针1内。
在一个试验中，具体操作举例如下：萃取操作在显微镜的辅助观察下进行。首先，利用毛细管探针吸取11nL的萃取溶剂。然后，通过移动x-y和z平移台，将毛细管尖端定位到其尖端刚好与样品液滴的顶部边缘接触的位置(记录其对应的z轴值为z1)。在该位置，注射10nL的萃取溶剂以形成附着在毛细管尖端上并悬浮在样品液滴顶部边缘上的萃取溶剂液滴。在静态萃取模式下，样品液滴和萃取溶剂液滴在整个萃取过程中保持静止。在动态萃取模式下，通过以0.2mm/s的移动速度移动x-y平移台，样品液滴沿y轴方向循环往复运动，最大移动距离应不超过样品液滴的三分之二直径。萃取完毕后，通过移动z平移台抬高毛细管探针至其对应的z轴值为z2(z2和z1之间的高度差dz为40μm)。在该位置，操作注射泵把10nL的萃取溶剂液滴回吸到毛细管探针内。
实施例2
图2是液滴包裹式液-液微萃取模式在静态模式下的操作过程示意图。100nL的罗丹明溶液和10nL的氯仿溶剂分别作为样品液滴和萃取溶剂液滴。其具体的操作过程如下：使用探针1作为取样探针，将其尾部与液体驱动系统3相连。对探针1的取样口10进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对探针1的内壁和取样口10的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在探针1中充满低热膨胀系数的液体作为载液4，并完全去除探针1和液体驱动系统3中的气泡。在探针1的取样口10引入一段与样品/稀释液不互溶的油相2来间隔载液4和萃取溶剂5。将储存萃取溶剂5的多孔板6和液滴阵列芯片7固定在可三维移动的移动台9上。利用注射泵作为液体驱动系统3，并且在液滴阵列芯片7上覆盖一层油相2来避免微孔内微量样品的蒸发。移动台9，使探针1取样口10浸入萃取溶剂5的多孔板6中定量抽取一定体积的萃取溶剂5进入探针1中。再次移动移动台9，使探针1的取样口10插入样品液滴8的深度为200μm时，定量注射一定体积的萃取溶剂5。待萃取完毕，直接利用液体驱动系统3回吸萃取溶剂液滴11至探针1内。
在一个试验中，具体操作举例如下：首先，利用毛细管探针吸取11nL的萃取溶剂。然后，通过移动x-y平移台，将芯片上的目标样品液滴切换到毛细管尖端位置并与毛细管尖端对齐。通过移动z平移台，将毛细管尖端插入到样品液滴内，直至其尖端和样品液滴顶部边缘之间的距离约为200μm。在该位置，注射10nL的萃取溶剂，以形成附着在毛细管尖端的萃取溶剂液滴。在静态萃取模式下，萃取溶剂液滴悬浮在样品液滴内，并且样品液滴和萃取溶剂液滴在整个萃取过程中保持静止。在动态萃取模式下，通过以0.2mm/s的移动速度移动x-y平移台，样品液滴沿y轴方向循环往复运动，但需要注意的是，其最大移动距离应不超过样品液滴的半径值。萃取完毕后，操作注射泵将11nL的萃取溶剂回吸到毛细管探针内。随后，将多回吸的1nL的萃取溶剂液滴重新注射到相邻的水液滴内进行清洗，以去除残留的样品水溶液。萃取溶剂液滴清洗的具体过程如下：首先，将毛细管尖端插入到水液滴中，注射多回吸的1nL萃取溶剂到水液滴中。然后通过注射泵迅速将该1nL的萃取溶剂再回吸到毛细管探针内。
实施例3
图3是液滴并列式液-液微萃取模式在高通量阵列下的操作过程示意图。其具体的操作过程如下：使用多根相同的探针1作为取样探针，将其尾部与液体驱动系统3相连。对探针1的取样口10进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对探针1的内壁和取样口10的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在探针1中充满低热膨胀系数的液体作为载液4，并完全去除探针1和液体驱动系统3中的气泡。同时在多根探针1的取样口10引入一段与样品/稀释液不互溶的油相2来间隔载液4和萃取溶剂5。将储存萃取溶剂5的多孔板6和液滴阵列芯片7固定在可三维移动的移动台9上。利用注射泵作为液体驱动系统3，并且在液滴阵列芯片7上覆盖一层油相2来避免微孔内微量样品的蒸发。移动移动台9，使多根探针1取样口10同时浸入萃取溶剂5的多孔板6中定量抽取一定体积的萃取溶剂5进入多根探针1中。再次移动移动台9，使多根探针1的取样口10与样品液滴8的顶部边缘刚好接触时，定量注射一定体积的萃取溶剂5。待萃取完毕，同时回收萃取溶剂液滴11至多根探针1内。
实施例4
在液滴并列式液-液微萃取和液滴包裹式液-液微萃取模式中，100nL的罗丹明B溶液作为样品液滴，10nL的正己醇和氯仿溶剂分别作为萃取溶剂液滴。萃取后，将萃取溶剂液滴稀释到预先填充在384孔板中的20μL正己醇中。然后测量384孔板中正己醇的荧光强度(与罗丹明B浓度成比例)。利用公式
Figure BDA0002433278540000141
计算出萃取溶剂液滴中罗丹明B的浓度(其中Ce和Ve分别是萃取溶剂液滴的浓度和体积，Cw和Vw分别是384孔板中正己醇的浓度和体积)。实验中分别研究了两种模式下萃取时间对萃取效率的影响。如图4所示，当萃取时间为30s时，在静态和动态条件下，液滴包裹式液-液微萃取模式的萃取效率分别为32.0％和57.4％，而液滴并列式液-液微萃取模式的效率分别为86.9％和91.1％，远大于液滴包裹式液-液微萃取模式下的萃取效率。这些结果表明，在液滴并列式液-液微萃取模式下，萃取剂液滴与样品液滴之间的传质速率要快于液滴包裹式液-液微萃取模式，通过理论计算，上述两种模式中两个液滴之间的接触面积分别为6.2×10-8m2和3.6×10-8m2。因此，与液滴包裹式液-液微萃取模式相比，液滴并列式液-液微萃取模式中两个液滴之间的接触面积相对较大并且传质速率相对较快。

Claims (7)

1.一种用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：利用探针（1）取萃取溶剂（5），所述探针（1）上具有一个能挂载萃取溶剂（5）液滴的探针尖端（10）；将待萃取的样品液滴（8）预先置于防蒸发空间中，且保持单颗液珠形态；所述萃取溶剂（5）与所述样品液滴（8）不易溶；
S2：将带有萃取溶剂（5）的探针尖端（10）逐渐靠近样品液滴（8），使萃取溶剂（5）以液滴形式挂载于探针尖端（10），且萃取溶剂液滴（11）与样品液滴（8）接触形成传质交换界面，使样品液滴（8）中的待萃取组分通过所述传质交换界面被萃取至萃取溶剂液滴（11）中；萃取过程中保持探针尖端（10）始终接触萃取溶剂液滴（11）；
S3：待充分传质后，利用探针（1）回收萃取溶剂液滴（11）；
S4：对萃取溶剂液滴（11）进行进一步清洗，去除残留样品；
所述S2中，带有萃取溶剂（5）的探针尖端（10）逐渐靠近样品液滴（8）的过程中，探针尖端（10）悬停于样品液滴（8）的外侧不进入样品液滴（8）内，探针尖端（10）与样品液滴（8）外表面之间的距离应保证其尖端挂载的萃取溶剂液滴（11）在样品液滴（8）的表面包裹形成液膜，且液膜与探针尖端（10）接触粘附；
所述S2中的萃取采用动态萃取；所述动态萃取的整个萃取过程中，萃取溶剂液滴（11）相对于样品液滴（8）来回移动，使萃取溶剂液滴（11）与样品液滴（8）之间的传质交换界面覆盖样品液滴（8）的不同位置，但移动过程中萃取溶剂液滴（11）不脱离样品液滴（8）。
2.如权利要求1所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述的探针（1）为空心结构，所述的萃取溶剂（5）预先被吸入探针（1）的内腔，在探针尖端（10）携带萃取溶剂（5）逐渐靠近样品液滴（8）并达到目标位置后，重新将内部萃取溶剂（5）不完全地推出，使萃取溶剂（5）以液滴形式挂载于探针尖端（10）；当萃取完毕后，重新将萃取溶剂（5）全部或过量吸入探针（1）的内腔，然后随探针（1）一并脱离样品液滴（8）；优选的，在探针（1）吸取萃取溶剂（5）前，先吸取载液（4）使其进入并填充探针（1）内腔，然后再吸取与载液（4）和萃取溶剂（5）不互溶的第三相（2），用于将载液（4）与后续吸入的萃取溶剂（5）相隔离；优选的，探针（1）的长度在1毫米至50厘米范围内，内径或内边长在1纳米至5毫米范围内，其管壁厚度在1纳米至5毫米范围内；优选的，所述探针尖端（10）对样品液滴（8）无亲和性或弱亲和性。
3.如权利要求1所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述的探针（1）为实心结构，探针尖端（10）加工成用于承载萃取溶剂的微结构；利用探针（1）取萃取溶剂（5）时，将探针尖端（10）插入萃取溶剂（5）中再移出，使部分萃取溶剂（5）负载于探针尖端（10）的微结构上，形成萃取溶剂液滴（11）；然后由探针尖端（10）携带萃取溶剂液滴（11）靠近样品液滴（8）进行萃取；萃取完毕后，缓慢收回探针（1），使探针尖端（10）携带萃取溶剂液滴（11）重新脱离样品液滴（8）；优选的，探针（1）的长度在1毫米至50厘米范围内，其直径或边长在1纳米至5毫米范围。
4.如权利要求1所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述样品液滴（8）置于防蒸发空间中的方法为：
将样品液滴（8）置于高饱和度蒸汽空间内；
或者将样品液滴（8）置于高密闭度的空间内；
或者在样品液滴（8）上覆盖一层与样品液滴（8）和萃取溶剂（5）不互溶的第三相（2）。
5.如权利要求1所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述的样品液滴（8）置于液滴阵列芯片（7）上，一个液滴阵列芯片（7）上具有一个或多个液滴容纳部位，每个部位容纳的样品液滴（8）体积范围是1飞升至100微升；优选的，所述液滴阵列芯片（7）同时容纳有多个并排且间隔的样品液滴（8），所述探针（1）有多条，并排对多个样品液滴（8）进行同步萃取。
6.如权利要求1所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述S4中，萃取溶剂液滴（11）的清洗方法为：
S41：将清洗液滴预先置于防蒸发空间中，且保持完整的液珠形态；所述清洗液滴为与样品液滴为同一相的不含待测物和干扰物空白液滴，且待萃取组分不易溶于该清洗液滴；
S42：以清洗液滴替代样品液滴（8），重复步骤S2和S3，使残留的样品液滴（8）被去除。
7. 如权利要求2所述的用于超微量样品的液-液微萃取方法，其特征在于，所述S2中，首先将带有萃取溶剂（5）的探针尖端（10）垂直向下逐渐靠近样品液滴（8），且探针尖端（10）悬停在刚好接触或即将接触样品液滴（8）顶部的位置；然后将内部萃取溶剂（5）不完全地推出，使萃取溶剂液滴（11）在样品液滴（8）顶部铺展成液膜；然后控制探针尖端（10）以当前位置为中心水平往复移动，待样品液滴（8）中的待萃取组分通过传质交换界面被完全萃取至萃取溶剂液滴（11）中后，控制探针尖端（10）回到中心处；在保证萃取溶剂液滴（11）不脱离探针尖端（10）的情况下，将探针尖端（10）向上垂直提升一定距离，再开始对萃取溶剂液滴（11）进行抽吸，完全回收萃取溶剂液滴（11）；优选的，样品液滴（8）体积为100 nL，被推出探针尖端（10）的萃取溶剂液滴（11）体积为10 nL时，探针尖端（10）向上垂直提升的距离为40μm。
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