CN115998854A - 一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用，属于流感病毒疫苗技术领域。所述流感病毒基因的开放阅读框用绿色荧光蛋白EGFP的开放阅读框代替，与所述非编码区重新组成新基因序列，以用于mRNA疫苗的制备中；所述非编码区源于流感病毒基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的非编码区中至少一个。具体地，以新基因序列为模板设计mRNA疫苗，比较蛋白表达效率，并通过对比验证非编码区对蛋白表达效果的影响，从而增强mRNA疫苗的稳定性和保护力，提高免疫应答水平。因此，本发明对治疗性疫苗的发展和预防传染病疫苗的开发具有重要意义，对我国养殖业的发展和公共卫生健康具有巨大的社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及流感病毒疫苗技术领域，特别是涉及一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用。
背景技术
流感病毒是由甲型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的急性高度传染性的传染病。H1N1亚型流感病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是一种新型流感病毒。近几年，mRNA疫苗迅速发展，其在肿瘤、感染性疾病及其他相关疾病的防治上有着广泛的应用前景。流感病毒基因组有8个片段，编码的蛋白在细胞内表达的效率不一样，有的表达量高，有的表达量低。非编码区的功能复杂多样，不仅能调控其mRNA的稳定性、控制mRNA的亚细胞定位，而且还在特定氨基酸的编码过程中起着指导作用。而目前mRNA疫苗存在如何提高表达量的问题，因此，提高mRNA疫苗表达量对防治流感病毒非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，在绿色荧光蛋白两端分别加上流感病毒8个不同的非编码区设计mRNA疫苗，可提高绿色荧光蛋白的表达效率，进而增强mRNA疫苗的稳定性和保护力，提高免疫应答水平。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用，所述流感病毒基因的开放阅读框用绿色荧光蛋白EGFP的开放阅读框代替，保留非编码区，合成新基因序列，以用于mRNA疫苗的制备中；
所述非编码区源于流感病毒基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的非编码区中至少一个。
本发明还提供包含所述的非编码区的载体在制备mRNA疫苗中的应用。
本发明还提供一组流感病毒基因的非编码区在提高mRNA疫苗表达量中的应用，所述流感病毒基因的开放阅读框用绿色荧光蛋白EGFP的开放阅读框代替，保留非编码区，合成新基因序列，以用于提高mRNA疫苗表达量中；
所述非编码区源于流感病毒基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的非编码区中至少一个。
本发明还提供包含所述的非编码区的载体在提高mRNA疫苗表达量中的应用。
优选的是，所述流感病毒包括甲型流感病毒株A/PR/8(H1N1)。
优选的是，所述mRNA疫苗是以所述新基因序列为模板构建而成，所述新基因序列能够提高所述mRNA疫苗中所述绿色荧光蛋白的表达效率。
本发明还提供一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括所述的非编码区或者所述的载体。
本发明还提供一种mRNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
用绿色荧光蛋白代替流感病毒基因的开放阅读框，合成两端分别含有流感病毒基因的非编码区的DNA序列，以合成的DNA序列为模板构建mRNA疫苗；
其中，所述流感病毒基因的非编码区包括流感病毒基因的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因片段。
优选的是，所述流感病毒包括甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)。
优选的是，合成的DNA序列还保留了流感病毒3’端非编码区和5’端非编码区的包装信号。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过对流感病毒各基因片段的非编码区进行多序列比对，推测流感病毒特异性非编码区有其重要的生物学意义，而目前人们对流感病毒非编码区的研究相对较少；用绿色荧光蛋白EGFP代替8个流感病毒基因片段的开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)，荧光的产生不需要任何外源反应底物，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
本发明通过把不同的非编码区片段放在EGFP基因两端，合成新的基因，实验结果显示：用流感病毒非编码区片段提高目的基因(EGFP)的表达效率；再以新合成的基因为模板设计mRNA疫苗，结果显示：增强了mRNA疫苗的稳定性和保护力，提高免疫应答水平。因此，本发明对治疗性疫苗的发展和预防传染病疫苗的开发具有重要意义，对我国养殖业的发展和公共卫生健康具有巨大的社会意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施的试验流程图；
图2为PCR方法扩增的基因片段；A-H依次为pVAX-PB2-EGFP、pVAX-PB1-EGFP、pVAX-PA-EGFP、pVAX-HA-EGFP、pVAX-NP-EGFP、pVAX-NA-EGFP、pVAX-M-EGFP、pVAX-NS-EGFP；
图3为携带来源不同流感病毒非编码区的GFP的表达结果；A-I依次为pVAX-PB2-EGFP、pVAX-PB1-EGFP、pVAX-PA-EGFP、pVAX-HA-EGFP、pVAX-NP-EGFP、pVAX-NA-EGFP、pVAX-M-EGFP、pVAX-NS-EGFP、Positive；
图4为RT-PCR方法检测不同GFPmRNA(HA-pVAX-EGFP、M-pVAX-EGFP、NA-pVAX-EGFP、NP-pVAX-EGFP、NS-pVAX-EGFP、PA-pVAX-EGFP、PB1-pVAX-EGFP、PB2-pVAX-EGFP、pVAX-EGFP)的表达量；
图5为PCR方法扩增的目的基因条带；M：标准DNA分子；1-4分别为M-pVAX-EGFP+K、NS-pVAX-EGFP+K、PA-pVAX-EGFP+K、PB1-pVAX-EGFP+K；
图6为RT-PCR方法检测不同流感病毒非编区(M-pVAX-EGFP、NS-pVAX-EGFP、PA-pVAX-EGFP、PB1-pVAX-EGFP、M-pVAX-EGFP+K、NS-pVAX-EGFP+K、PA-pVAX-EGFP+K、PB1-pVAX-EGFP+K)对GFP表达的影响；
图7为PCR方法扩增的DNA片段；1：标准DNA分子；M：pVAX-M-EGFP；NS：pVAX-NS-EGFP；PA：pVAX-PA-EGFP；PB1：pVAX-PB1-EGFP；P：pVAX-EGFP；
图8为携带不同流感病毒基因片段非编码区的GFP(mRNA-M-EGFP、mRNA-NS-EGFP、mRNA-PA-EGFP、mRNA-PB1-EGFP以及mRNA-EGFP)相对表达量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明的技术路线如图1所示，下面将以具体实施例对该技术路线进行更具体的说明。
实施例1
1、克隆甲型流感病毒A/PR/8(H1N1)基因片段及构建重组质粒
合成重组甲型流感病毒A/PR/8(H1N1)基因片段序列，具体如下：
(1)扩增
通过生物信息学的方法，对从流感病毒资源数据库(NCBI)检索到的流感病毒各基因片段进行多序列比对，针对非编码区序列进行PCR引物设计，构建质粒PB2-EGFP(ORF)、PB1-EGFP(ORF)、PA-EGFP(ORF)、HA-EGFP(ORF)、NP-EGFP(ORF)、NA-EGFP(ORF)、M-EGFP(ORF)、NS-EGFP(ORF)。新合成8个DNA序列保留了甲型流感病毒A/PR/8(H1N1)片段3’端非编码区和5’端非编码区的碱基。利用PCR技术进行目的片段5’UTR-ORF(EGFP)- 3’UTR的扩增。扩增引物如表1所示。
表1 引物序列
将pVAX1-EGFP稀释为30ng/μL，取1μL为模板，利用上表所示引物，按照表2所示的反应体系，来扩增目的基因。
表2反应体系
| 组分 | 体积 |
| DNA Template | 1μL |
| 上游引物(10μM) | 2μL |
| 下游引物(10μM) | 2μL |
| 10×Ex Taq Buffer | 5μL |
| dNTP Mixture | 4μL |
| Ex Taq | 1μL |
| Water，nuclease-free | 35μL |
| 总体系 | 50μL |
PCR扩增程序如表3所示。
表3反应程序
| 步骤 | 程序 | 时间 |
| 1 | 预变性90℃ | 5min |
| 2 | 变性94℃ | 30s |
| 3 | 退火58℃ | 30s |
| 4 | 延伸72℃ | 48s |
| 5 | GOTO步骤2 | 33× |
| 6 | 72℃终延伸 | 10min |
| 7 | 12℃保存 | ∞ |
(2)酶连接
分别用EcoR I和Xho I酶切质粒pVAX和PCR产物，利用T4DNA ligase连接以上两个酶切片段。
表4连接体系
| 组分 | 体积 |
| PCR产物酶切产物 | 5μL |
| 载体pVAX1的酶切产物 | 4μL |
| T4DNA Ligase | 1μL |
| 5×Rapid Ligation Buffer | 4μL |
| Water，nuclease-free | 6μL |
| 总体系 | 20μL |
水浴锅37℃水浴，0.5h。
(3)转化
①提前打开水浴锅，预热到42℃；摇床调至37℃，190rpm；恒温培养箱调至37℃。
②将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，立即放入冰盒5min，使其融化。
③在超净工作台中，取10μL的连接产物加入到50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻吹吸混匀，冰浴30min。
④冰浴后将上述反应体系在42℃水浴锅中热激90sec，立即静置冰浴90sec。
⑤再向其加入400μL提前融化好的SOC培养基，轻轻吹吸混匀，37℃，190rpm摇床振荡45min，使细菌复苏。
⑥复苏后，将振荡物3000g，5min离心，弃去上清300μL，留下100μL。
⑦将离心后的沉淀和留存的培养液轻轻吹吸混匀，用无菌涂布器均匀的将混匀物涂布于含有Kana+的LB固体培养基上。
⑧将固体培养基正面静置0.5h，待平板内的液体干燥后，再放置于37℃恒温培养箱内培养15h。
挑取单菌落，摇菌测序，选择正确序列的单菌落进行过夜摇菌，再大量提取质粒，于-20℃保存备用。通过凝胶电泳检测构成的新质粒pVAX-PB2-EGFP、pVAX-PB1-EGFP、pVAX-PA-EGFP、pVAX-HA-EGFP、pVAX-NP-EGFP、pVAX-NA-EGFP、pVAX-M-EGFP、pVAX-NS-EGFP。
2、转染
将293T细胞培养在含有10％胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，FBS)和1％双抗(Penicillin-Streptomycin Solution，PS)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)培养液中，于37℃培养箱培养；(培养基和血清购自Biological Industries公司)。
将293T细胞铺在24孔细胞培养板中，每孔2×105个细胞，待细胞生长密度达到80％-90％进行转染。转染前将24孔细胞培养板中原有的DMEM培养液吸弃掉，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline，PBS)洗一遍，更换为400μL新鲜的Opti-MEM培养液。利用转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司)向293T细胞八个质粒pVAX-PB2-EGFP、pVAX-PB1-EGFP、pVAX-PA-EGFP、pVAX-HA-EGFP、pVAX-NP-EGFP、pVAX-NA-EGFP、pVAX-M-EGFP、pVAX-NS-EGFP转染。转染6小时后，弃掉24孔细胞培养板中培养液，更换为400μL新鲜的DMEM培养液；转染24小时后，在荧光显微镜下观察结果。
3、RT-PCR检测
收集转染后293T细胞于Eppendorf管中，加入400μL Trizol，室温放置5min充分裂解，加80μL氯仿，振荡涡旋混合后室温放置5min，12000g 4℃离心15min，转移上层水相到一新EP管中，加入等体积的异丙醇，振荡混合后静置10min，12000g 4℃离心15min，倒掉上清，加75％无水乙醇(4℃保存)，振荡混合后7500g 4℃离心5min，倒掉上清，EP管倒置在滤纸上使RNA沉淀干燥，加DEPC水至EP管中，使RNA充分溶解后测RNA浓度。
设计并合成EGFP及管家基因β-actin RT-PCR的引物(如表5所示)，采用TBGreen嵌合荧光法进行One Step RT-PCR反应。
表5RT-PCR引物
在冰上配制如表6所示反应液(一次反应用量)。
表6反应液
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer4 | 10μL | 1×(即稀释一倍) |
| PrimeScript1Step Enzyme Mix 2 | 0.8μL | |
| PCR Forward Primer(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| PCR Reverse Primer(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Total RNA | 2μL | |
| <![CDATA[RNase Free dH<sub>2</sub>O]]> | 5.6μL | |
| Total | 20μL |
三步法PCR扩增反应：
Stage1：反转录反应
42℃5min 20℃/sec,95℃10sec 20℃/sec,1Cycle。
Stage2：PCR反应
95℃5sec 20℃/sec，60℃20sec 20℃/sec,40Cycle。
Stage3：融解曲线分析系统默认反应程序。
筛选出差异性的4个质粒，在其5’UTR区域增加可调控的KOZAK序列，构建新质粒，其中克隆增加KOZAK序列的引物如表7所示。
表7引物
其他克隆条件同上述克隆甲型流感病毒A/PR/8(H1N1)基因片段。
将克隆的四个基因片段，参照上述转染过程进行转染(PB1基因作为对照)，并进行RT-PCR检测。经对比，筛选出效果好的一组质粒设计引物，PCR扩增得到用于转录的pDNA模板，用T7体外转录试剂盒，按照说明书进行后续体外转录。
4、体外转录
(1)转录前PCR
表8
| 基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| T7 | TAATACGACTCACTATAGGGA | AGGAAAGGACAGTGGGAGT |
表9
反应程序：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃50s，33Cycle；72℃10min，12℃∞。
(2)体外转录
根据以下表10所示组分配制反应液，轻轻混匀。
表10
| 组分 | 体积 |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 20μL |
| Template | 1μL |
| F(T7启动子上游引物) | 2μL |
| R(T7启动子下游引物) | 2μL |
| Taq酶 | 25μL |
| Total | 50μL |
37℃温水浴放置4h后，加入DNAase 1μL，于37℃温水浴放置15min，用手点匀，甩匀。
(3)纯化
按照下述步骤操作：
①向21μL样品中加入30μLddH2O和25μL LiCl，混匀，-20℃冷冻2h；现配75％酒精1mL，加入混匀，然后13200rpm 4℃离心15min。
③上步骤得到的体系除上清后，加1mL75％酒精，13200rpm 4℃离心3min；
③弃上清，自然干燥；
④加入40μLddH2O，测浓度。
(4)加帽
①RNA体积(上述纯化后测出的浓度，再根据换算公式计算：V(μL)＝10000/x)，加ddH2O补充到15μL；于65℃水浴处理5min；冰上处理5min。
②按照表11所示顺序加入各试剂，37℃温育30min。
表11
(5)加尾
按照表12所示顺序加入各试剂，37℃温育30min。
表12
| 组分 | 体积 |
| 加帽完成的RNA | 20μL |
| ATP (10mM) | 2μL |
| E.coli poly(A)polymerase | 1μL |
| E.coli poly(A)polymerase reaction 10×Buffer | 2μL |
| Total | 25μL |
(6)再纯化
①取25μL样品加入25μL ddH2O、25μL LiCl，于-20℃冷冻2h；之后加入现配75％酒精1mL，13200rpm 4℃离心15min。
②上步骤所得体系除去上清液，之后加入1mL 75％酒精，于13200rpm 4℃离心3min。
③弃上清液，自然干燥；
④加入40μL ddH2O，测浓度。
(7)参考上述转染步骤进行mRNA转染，结束后观察荧光结果并计算平均荧光强度。
5、结果与分析
如图2所示，成功构建绿色荧光蛋白EGFP为ORF，流感病毒8个片段的非编码区加在两端的新质粒，并将质粒进行转染细胞，而后收集细胞进行RT-PCR筛选出表达效率增高的非编码区片段M、NS和PA(如图3和图4所示)。
在已经筛选的M、NS和PA基础上构建非编码区增加KOZAK序列的新质粒，并且将基因片段PB1作为对照构建了相同的质粒(如图5所示)，转染细胞，收集起来做RT-PCR，根据RT-PCR结果可知，KOZAK序列对于非编码区增加表达效率是具有抑制作用的(如图6所示)。
根据以上结果，对pVAX-M-EGFP、pVAX-NS-EGFP、pVAX-PA-EGFP、pVAX-PB1-EGFP、pVAX-EGFP进行体外转录(如图7所示)，并将体外转录而来的mRNA转染进细胞，观察荧光表达并计算荧光表达强度，根据荧光表达强度来看，流感病毒基因片段M的非编码区可以很大的提高蛋白的表达效率(如图8所示)，这对构建mRNA疫苗，优化基因片段结构有非常重要的作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一组流感病毒基因的非编码区在制备mRNA疫苗中的应用，其特征在于，所述流感病毒基因的开放阅读框用绿色荧光蛋白EGFP的开放阅读框代替，保留非编码区，合成新基因序列，以用于mRNA疫苗的制备中；
所述非编码区源于流感病毒基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的5’末端与3’末端非编码区。
2.包含权利要求1中所述的非编码区的载体在制备mRNA疫苗中的应用。
3.一组流感病毒基因的非编码区在提高mRNA疫苗表达量中的应用，其特征在于，所述流感病毒基因的开放阅读框用绿色荧光蛋白EGFP的开放阅读框代替，保留非编码区，合成新基因序列，以用于提高mRNA疫苗表达量中；
所述非编码区源于流感病毒基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的非编码区中至少一个。
4.包含权利要求3中所述的非编码区的载体在提高mRNA疫苗表达量中的应用。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)。
6.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述mRNA疫苗是以所述新基因序列为模板构建而成，所述新基因序列能够提高所述mRNA疫苗中所述绿色荧光蛋白的表达效率。
7.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗包括权利要求1或3中所述的非编码区或者权利要求2或4中所述的载体。
8.一种mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用绿色荧光蛋白代替流感病毒基因的开放阅读框，合成两端分别含有流感病毒基因的非编码区的DNA序列，以合成的DNA序列为模板构建mRNA疫苗；
其中，所述流感病毒基因的非编码区包括流感病毒基因的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因片段。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒株A/PR/8(H1N1)。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，合成的DNA序列还保留了流感病毒3’端非编码区和5’端非编码区的包装信号。
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| CN109097341A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-28 | 青岛农业大学 | 一种同时表达ha和hef的复制缺陷型重组流感病毒 |
| CN109136199A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-04 | 青岛农业大学 | 一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒 |
| CN111560354A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-21 | 中国人民解放军总医院第五医学中心 | 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用 |
| CN113736801A (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-03 | 上海蓝鹊生物医药有限公司 | mRNA及包含其的新冠病毒mRNA疫苗 |
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2023
- 2023-01-30 CN CN202310044254.2A patent/CN115998854A/zh active Pending
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