CN115997842A - 类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用。本发明提供的类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62429。本发明的发酵剂用于制备宠物食品，得到的宠物食品的结构稳定，成粒率高，在干燥过程中可以保持食品颗粒的完整性，且表面有光泽，能促进宠物消化增强免疫能力、有助于提高宠物的摄食率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用。
背景技术
近年来，饲养宠物的热潮在我国蓬勃兴起，宠物数量也日益增多，宠物食品也成为国内发展比较迅速的行业之一。在宠物食品的选择上，人们更偏向适口性好、风味丰富、营养健康的产品。益生菌因其对宿主动物有多方面的积极作用，包括改善免疫系统、降低应激水平、防止感染、提高生长性能，甚至预防代谢性疾病，而被应用于宠物食品。
乳酸菌作为最常见的益生菌之一，不仅能起到抑制宠物肠道潜在有害微生物生长，改善肠道菌群结构和提高机体免疫力的作用，还能将食品中的糖类、蛋白质、维生素和脂肪降解为肽和氨基酸等易吸收营养物质。现如今，植物乳杆菌、干酪乳杆菌等乳酸菌在宠物食品行业得到较广泛的应用，但是宠物食品的生产多采用膨化、焙烤、烘干等加工方式，极易损伤营养物质及益生菌的活性，而达不到预料的效果，真空冷冻干燥作为一种保障益生菌活性的有效方法常用于益生菌宠物食品的制备，但却存在成粒率低、松散、抗氧化能力差及细菌滋生等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决背景技术中的问题，本发明提供了一种类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用。本发明提供的宠物食品结构致密、适口性强、促进宠物肠道健康、增强宠物免疫力、风味更佳。
为实现以上目的，本发明采用的第一个技术方案为：
类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用，所述的类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为GDMCC No:62429。
优选的，所述类肠膜魏斯氏菌SL7的发酵菌液浓度为107～108CFU/mL。
本发明以类肠膜魏斯氏菌（GDMCC No:62429）SL7作为发酵剂应用于宠物食品中，使得制备得到的宠物食品在硬度、弹性以及咀嚼性等方面均优于目前市售冻干宠物食品，且成品结构稳定、成粒率高，在干燥过程中可以保持食品颗粒的完整性。该菌株具有强耐高温、有一定的耐高压能力，对大肠杆菌的生长有强抑制作用，使得类肠膜魏斯氏菌在加工过程中以及成品中均能保持高活性状态，提升宠物饲料产品品质。
优选的，所述宠物食品的制备方法包含以下步骤：
向经过预处理的原料肉中加入类肠膜魏斯氏菌（GDMCC No:62429）SL7发酵剂，添加量为原料肉质量的3.5～8%，混合均匀后在密封条件下，于35～40℃条件下发酵12～18h，得到发酵肉；
向发酵肉中加入经过预处理的其余原料，混合均匀后在-5～0℃条件下静置3～6h预冷定形为成形产品；以及
将成形产品置于-80～50℃条件下速冻12～24h后，进行真空冷冻干燥。
优选的，所述预处理的原料肉为将鲜肉研磨得到的肉泥。
优选的，所述经过预处理的其余原料包含：经过热烫的蔬菜、白乌鱼酶解物、熟化的红薯粉溶液。
优选的，所述熟化的红薯粉溶液是按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比配制红薯粉溶液，在70～80℃水浴锅中糊化30～60min，置于-80～50℃的冰箱中速冻12～18h后，进行真空冷冻，完成后粉碎过筛。
优选的，所述白乌鱼酶解物的制备方法包含以下步骤：
向经过预处理的白乌鱼中按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比加入纯水，混匀后加入复合蛋白酶，复合蛋白酶质量为白乌鱼原料的1～1.5%，于50～60℃条件下酶解8～12h得到酶解物；以及
对酶解物进行灭酶处理。
优选的，所述复合蛋白酶包含木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，质量比为（0.2～0.4）∶（0.5～0.8）∶（0.3～0.8）。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以类肠膜魏斯氏菌（GDMCC No:62429）SL7作为发酵剂应用于宠物食品中，使得本发明的宠物食品在硬度、弹性以及咀嚼性等方面均优于目前市售冻干宠物食品，且成品结构稳定、成粒率高，在干燥过程中可以保持食品颗粒的完整性。
本发明的菌株其具有强耐高温、有一定的耐高压能力，对大肠杆菌的生长有强抑制作用，使得类肠膜魏斯氏菌在加工过程中以及成品中均能保持高活性状态，提升宠物饲料产品品质。本发明的类肠膜魏斯氏菌，能抑制宠物肠道致病菌的生长，能够促进肠道益生菌增值、改善肠道环境、提高宠物食欲。
本发明提供的宠物饲料成品具有极佳的鱼肉香味和发酵风味，可减少宠物的掉毛量，能维持柔顺光滑、富有光泽的健康毛发状态。
说明书附图
图1 为类肠膜魏斯氏菌SL7的系统发育树图；
图2为类肠膜魏斯氏菌SL7、菌株BS、菌株WP在高压下耐受性；
图3为类肠膜魏斯氏菌SL7、菌株BS、菌株WP在高温下耐受性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施方式提供了类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用，该类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（
Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62429。
作为一些优选实施方式，所述类肠膜魏斯氏菌SL7的菌液浓度为107～108CFU/mL。
该发酵剂的制备方法优选为以下步骤：
（1）活化：采用划线的方法将斜面保存的类肠膜魏斯氏菌接种于MRS固体培养基，37℃倒置培养，从培养基中挑选出生长情况良好的菌落，接种到新的培养基中培养，重复2～3次；
（2）液体培养：将活化后的类肠膜魏斯氏菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下振荡培养24h，取出置于4℃冰箱保存；
（3）平板计数：摇匀后取菌液进行稀释涂布和活菌计数，确定菌液浓度；
（4）菌剂制备：4℃、5000r/min条件下离心5min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬，调整菌液浓度约为107～108CFU/mL，备用。
所述宠物食品的制备方法包含以下步骤：
向经过预处理的原料肉中加入类肠膜魏斯氏菌SL7发酵剂，添加量为原料肉质量的3.5～8%，混合均匀后在密封条件下，于35～40℃条件下发酵12～18h，得到发酵肉；
向发酵肉中加入经过预处理的其余原料，混合均匀后在-5～0℃条件下静置3～6h预冷定形为成形产品；以及
将成形产品置于-80～50℃条件下速冻12～24h后，进行真空冷冻干燥。
需要说明的是，所述预处理的原料肉为将鲜肉研磨得到的肉泥；所述经过预处理的其余原料包含：经过热烫的蔬菜、白乌鱼酶解物、熟化的红薯粉溶液。
其中，所述熟化的红薯粉溶液是按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比配制红薯粉溶液，在70～80℃水浴锅中糊化30～60min，置于-80～50℃的冰箱中速冻12～18h后，进行真空冷冻，完成后粉碎过筛。
所述白乌鱼酶解物的制备方法包含以下步骤：
向经过预处理的白乌鱼中按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比加入纯水，混匀后加入复合蛋白酶，复合蛋白酶质量为白乌鱼原料的1～1.5%，于50～60℃条件下酶解8～12h得到酶解物；以及
对酶解物进行灭酶处理。
作为一些优选实施方式，所述复合蛋白酶包含木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，质量比为（0.2～0.4）∶（0.5～0.8）∶（0.3～0.8）。
为了使得宠物食品的营养更加丰富均衡，该宠物食品的原料除了上述指出的鲜肉、蔬菜、白乌鱼酶解物、红薯淀粉外，还可以包含多种营养物质。作为一些优选实施方式，本发明实施例中宠物食品的原料按照重量份计包含：鲜肉50-55份、果蔬10-15份、红薯粉10份、白乌鱼酶解物5-10份、牛油3-5份、发酵剂3-4份、维生素2-3份、酵母提取物2份、卵磷脂1-2份、氨基酸螯合物1份、低聚果糖0.5-1份、低聚甘露糖0.5-1份、纤维素0.5-1份、L-抗坏血酸0.5份、茶多酚0.5份、牛磺酸0.5份、亚油酸0.5份、氯化钠0.5份。
进一步优选为，鲜肉50份、果蔬10份、红薯粉10份、白乌鱼酶解物10份、牛油4份、发酵剂4份、维生素3份、酵母提取物2份、卵磷脂1.5份、氨基酸螯合物1份、低聚果糖0.5、低聚甘露糖0.5份、纤维素1份、L-抗坏血酸0.5份、茶多酚0.5份、牛磺酸0.5份、亚油酸0.5份、氯化钠0.5份。
其中，所述鲜肉组分可以是新鲜鸡肉、新鲜牛肉、新鲜三文鱼中的一种或多种。
所述果蔬组分包括胡萝卜、西兰花、南瓜、芦笋、甘蓝、蓝莓、苹果、哈密瓜、柚子中的一种或多种。
所述维生素包括维生素A、维生素C、维生素E、维生素K、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、泛酸、烟酸、叶酸中的一种或多种。
所述氨基酸螯合物包括谷氨酸钙、谷氨酸镁、甘氨酸锌、甘氨酸亚铁、赖氨酸铜、硒代蛋氨酸中的一种或多种。
所述白乌鱼酶解物的具制备方法优选为以下：
去除白乌鱼的头部、尾部、鱼鳞及内脏组织，冲洗干净后切割成块状，加水经组织粉碎机搅碎备用；
按照（0.5～1）∶（1.5～2）料液比加入纯水，经均质机调制均匀后加入复合蛋白酶，复合蛋白酶质量为白乌鱼原料的1～1.5%，于50～60℃条件下酶解12～18h；
酶解后完成后，将温度升高至95～100℃灭酶处理20～25min，冷却后备用；
所述的发酵风味冻干宠物食品，其特征在于，所述复合蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，重量比为（0.2～0.4）∶（0.5～0.8）∶（0.3～0.8）。
以下用多个具体实施例对类肠膜魏斯氏菌SL7的应用及性能进行详细说明。
实施例1 菌株的分离、纯化和鉴定
1.1 菌株的分离、筛选
本发明所需菌种从四川腊肉中分离所得，在无菌条件下，取腊肉内部组分25g，剪碎，放入无菌均质袋中，加入225ml无菌生理盐水，于拍打式均质器中拍打3min；作10倍梯度稀释，共有10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个浓度，取200微升样品涂布于含有1.5%碳酸钙的MRS培养基上，每个浓度做3个重复，静置30min后于37℃条件下倒置培养48h。
将具有明显溶钙圈的菌落接种于MRS培养基，划线纯化直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，然后测定菌株的生理生化指标；挑取革兰氏阳性、不产H2S、发酵葡萄糖不产气、不产黏液和肌红蛋白阳性菌株，筛选得到的菌株于-4℃条件下进行斜面保存备用。
2）对亚硝酸盐具有降解作用的菌株筛选
将上述分离到的菌株按1%接种于含150ug/mL NaNO2，pH6.0的MRS肉汤培养基中，35 ℃培养24 h后，检测培养基中的NaNO2含量，用亚硝酸盐降解率来表示菌株降解亚硝酸盐的能力。
含碳酸钙的MRS培养基上乳酸菌的形态特征：乳白色菌落，大小、形状各异，温润，有溶钙圈，有透明圈。从MRS碳酸钙培养基的菌株中挑选出12株菌透明圈较大的形态不同的典型菌落，并纯化菌株，直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，再把所有菌株转接斜面-4℃保存，同时用甘油保存法封存备用，。依据GB5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定。结果表明其中降解亚硝酸盐效果最好的是菌株SL7，降解率达到98%，显著高于其他菌株，所以，筛选出菌株SL7作为优良菌株。
1.2 菌株的分子学鉴定
细菌基因组DNA提取：用 TSINGKE 植物 DNA 提取试剂盒（通用型）提取细菌DNA；
提取产物经过PCR扩增，扩增体系：1×TSE101 金牌 mix 45ul，27 F 2uL，1492 R2 L，Template 1ul；
PCR扩增反应条件：98℃ 4min预变性；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，38个循环；72℃修复延伸10min，4℃终止。
PCR产物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序，测序结果与GenBank基因数据库中16Sr DNA序列进行同源性比较分析，鉴定微生物种类。由此鉴定出菌株SL7为
Weissella paramesenteroides，该菌株的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该菌株的系统发育树如图1所示。
将菌株类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62429。
1.3 菌株压力耐受试验
将菌株SL7活化按1%接种于MRS液体培养基中，35℃°、120r/min振荡培养18h。取菌液于离心（5000r/min、8min），弃上清液，以无菌生理盐水将菌悬液浓度调整至108CFU/ml，分装于的50ml无菌蒸煮袋巾，封口。将样品置于超高压加压釜中，将样品置于超高压加压签中，分别100~500MPa做加压处理15min。同时，将使用中国专利CN103087964A实施例中的枯草芽孢杆菌（
Bacillus subtilis）CGMCCNo.3532（购于中国微生物菌种保藏中心）按1%接种MRS液体培养基中，与菌株SL7做相同处；将使用中国专利CN114456979A实施例中的类肠膜魏斯氏菌（
Weissella paramesenteroides）CGMCC NO .22238（购于中国微生物菌种保藏中心）按1%接种MRS液体培养基中，与菌株SL7做相同处理比较三者压力耐受差异，重复3次取平均值，结果如图2。其中，枯草芽孢杆菌（
Bacillus subtilis）CGMCCNo.3532在结果中简写为BS CGMCCNo.3532，类肠膜魏斯氏菌（
Weissella paramesenteroides）在结果中简写为WPCGMCC NO .22238。
由结果分析可知，枯草芽孢杆菌（BS CGMCCNo.3532）在经100MPa、150MPa、200MPa、250MPa高压处理后存活率分别降至60.25%、31.45%、7.46%、0.32%，经300MPa及以上处理后存活率为0，说明该枯草芽孢杆菌的所能耐受最高压力约为250MPa；类肠膜魏斯氏菌（WPCGMCC NO .22238）在经100MPa、150MPa、200MPa高压处理后存活率分别降至58.61%、26.74%、0.087%，经250MPa及以上高压处理后存活率为0；而菌株SL7在经100MPa、150MPa、200MPa、250MPa、300MPa高压处理后存活率分别降至74.68%、66.81%、57.53%、25.63%、8.13%，经350MPa及以上处理后存活率为0.00049%，显著高于枯草芽孢杆菌（BSCGMCCNo.3532）和类肠膜魏斯氏菌（WP CGMCC NO .22238），说明了SL7菌株对超高压有更强的耐受性。
1.4 菌株高温耐受试验
将菌株SL7活化按1%接种于MRS液体培养基中，35℃°、120r/min振荡培养18h。取菌液于离心（5000r/min、8min），弃上清液，以无菌生理盐水将菌悬液浓度调整至108CFU/ml，分装于的50ml无菌蒸煮袋巾，封口，分别于70℃、90℃恒温水浴处理30min。同时，将使用中国专利CN103087964A实施例中的枯草芽孢杆菌（
Bacillus subtilis）CGMCCNo.3532（购于中国菌种保藏中心）按1%接种MRS液体培养基中，与菌株SL7做相同处理；将使用中国专利CN114456979A实施例中的类肠膜魏斯氏菌（
Weissella paramesenteroides）CGMCC NO.22238（购于中国微生物菌种保藏中心）按1%接种MRS液体培养基中，与菌株SL7做相同处理，比较三者温度耐受差异，重复3次取平均值，结果如图3。其中，枯草芽孢杆菌（
Bacillus
subtilis）CGMCCNo.3532在结果中简写为BS CGMCCNo.3532，类肠膜魏斯氏菌（
Weissella
paramesenteroides）在结果中简写为WP CGMCC NO .22238。
由结果分析可知，菌株SL7在70℃、90℃恒温水浴处理后存活率分别为86.46%、80.53%，显著高于枯草芽孢杆菌（BS CGMCCNo.3532）经70℃、90℃恒温水浴处理后存活率73.81%、69.86%；而类肠膜魏斯氏菌（WP CGMCC NO .22238）在经过70℃处理后存活率为0.88%，已几乎为0；因此，说明了SL7菌株对高温有更强的耐受性，更有利于在食品加工过程中保持菌株的活性。
实施例2 类肠膜魏斯氏菌SL7在宠物食品中的应用
宠物食品，包括以下重量份数的原料：鲜肉50份、果蔬10份、红薯粉10份、白乌鱼酶解物10份、牛油4份、发酵剂2份、维生素3份、酵母提取物2份、卵磷脂1.5份、氨基酸螯合物1份、低聚果糖0.5、低聚甘露糖0.5份、纤维素1份、L-抗坏血酸0.5份、茶多酚0.5份、牛磺酸0.5份、亚油酸0.5份、氯化钠0.5份。
其中，鲜肉组分包括鸡肉、牛肉、三文鱼，重量比为3:1:1；果蔬组分包括等比例的胡萝卜、西兰花、南瓜、芦笋、甘蓝、蓝莓、苹果、哈密瓜、柚子。维生素包括维生素A、维生素C、维生素E、维生素K、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、泛酸、烟酸、叶酸。所述氨基酸螯合物包括谷氨酸钙、谷氨酸镁、甘氨酸锌、甘氨酸亚铁、赖氨酸铜、硒代蛋氨酸。
发酵剂的制备方法为：
A.活化：采用划线的方法将斜面保存的类肠膜魏斯氏菌SL7接种于MRS固体培养基，37℃倒置培养，从培养基中挑选出生长情况良好的菌落，接种到新的培养基中培养，重复2次；
B.液体培养：将活化后的类肠膜魏斯氏菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下振荡培养24h，取出置于4℃冰箱保存；
C.平板计数：摇匀后取菌液进行稀释涂布和活菌计数，确定菌液浓度；
D.发酵菌剂制备：4℃、5000r/min条件下离心5min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬，调整菌液浓度约为107CFU/mL，备用。
宠物食品的制作方法，具体步骤如下：
（1）原料处理
A.将上述原料中的鲜肉组分按配方份数称取，分别经研磨机研磨成肉泥，于4℃条件下保存备用；
B.将上述原料中的蔬菜组分按配方份数称取，于沸水中热烫处理1min，冷却后切成颗粒状，4℃条件下保存备用；
C.按照0.5∶2的料液比配制红薯粉溶液，在80℃水浴锅中糊化30min，置于-50℃的冰箱中速冻18h，再于真空冷冻干燥机中干燥，完成后粉碎过筛备用；
（2）发酵：将发酵剂加入到处理后的鲜肉原料中，搅拌均匀后密封，于37℃条件下发酵12h；
（3）混合：将步骤（1）所述蔬菜组分、白乌鱼酶解物、红薯粉及其他原料加入到完成发酵的产品中，经搅拌机混合均匀；
（4）冻干：将步骤（3）混合物倒入模具中，在-5℃条件下静置3h预冷定形，将成形产品置于-50℃条件下速冻24h，最后进行真空冷冻干燥；
（5）包装：冻干后装入包装袋，通氮气密封。
其中，所述白乌鱼酶解物的制备方法为：
A.去除白乌鱼的头部、尾部、鱼鳞及内脏组织，冲洗干净后切割成块状，加水经组织粉碎机搅碎备用；
B.按照1∶2料液比加入纯水，经均质机调制均匀后加入复合蛋白酶，添加量为原料肉质量的4.5%，于50℃条件下酶解12h；
C.酶解后完成后，将温度升高至100℃灭酶处理20min，冷却后备用。
所述复合蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，并按照0.2∶0.8∶0.5的重量比例配制。
实施例3 类肠膜魏斯氏菌SL7在宠物食品中的应用
宠物食品，包括以下重量份数的原料：鲜肉55份、果蔬10份、红薯粉10份、白乌鱼酶解物5份、牛油5份、发酵剂2份、维生素3份、酵母提取物2份、卵磷脂2份、氨基酸螯合物1份、低聚果糖0.5、低聚甘露糖0.5份、纤维素0.5份、L-抗坏血酸0.5份、茶多酚0.5份、牛磺酸0.5份、亚油酸0.5份、氯化钠0.5份。
其中，鲜肉组分包括鸡肉、牛肉、三文鱼，重量比为7:2:2。果蔬组分包括胡萝卜、西兰花、南瓜、芦笋、甘蓝、蓝莓、苹果、哈密瓜、柚子。维生素包括维生素A、维生素C、维生素E、维生素K、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、泛酸、烟酸、叶酸。氨基酸螯合物包括谷氨酸钙、谷氨酸镁、甘氨酸锌、甘氨酸亚铁、赖氨酸铜、硒代蛋氨酸。
发酵剂的制备方法为：
A. 活化：采用划线的方法将斜面保存的类肠膜魏斯氏菌SL7接种于MRS固体培养基，37℃倒置培养，从培养基中挑选出生长情况良好的菌落，接种到新的培养基中培养，重复2次；
B. 液体培养：将活化后的类肠膜魏斯氏菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下振荡培养24h，取出置于4℃冰箱保存；
C. 平板计数：摇匀后取菌液进行稀释涂布和活菌计数，确定菌液浓度；
D. 发酵菌剂制备：4℃、5000r/min条件下离心5min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬，调整菌液浓度约为108CFU/mL，备用。
宠物食品的制作方法，具体步骤如下：
(1) 原料处理
A. 将上述原料中的鲜肉组分按配方份数称取，分别经研磨机研磨成肉泥，于4℃条件下保存备用；
B. 将上述原料中的蔬菜组分按配方份数称取，于沸水中热烫处理1min，冷却后切成颗粒状，4℃条件下保存备用；
C. 按照0.5∶1.5的料液比配制红薯粉溶液，在75℃水浴锅中糊化45min，置于-80℃的冰箱中速冻12h，再于真空冷冻干燥机中干燥，完成后粉碎过筛备用；
(2) 发酵：将发酵剂加入到处理后的鲜肉原料中，搅拌均匀后密封，于35℃条件下发酵18h；
(3) 混合：将步骤（1）所述蔬菜组分、白乌鱼酶解物、红薯粉及其他原料加入到完成发酵的产品中，经搅拌机混合均匀；
(4) 冻干：将步骤（3）混合物倒入模具中，在0℃条件下静置6h预冷定形，将成形产品置于-80℃条件下速冻12h，最后进行真空冷冻干燥；
(5) 包装：冻干后装入包装袋，通氮气密封。
其中，白乌鱼酶解物的制备方法为：
A. 去除白乌鱼的头部、尾部、鱼鳞及内脏组织，冲洗干净后切割成块状，加水经组织粉碎机搅碎备用；
B. 按照0.5∶1.5料液比加入纯水，经均质机调制均匀后加入复合蛋白酶，添加量为原料肉质量的8%，于60℃条件下酶解8h；
C. 酶解后完成后，将温度升高至95℃灭酶处理25min，冷却后备用。
所述复合蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，并按照0.4∶0.4∶0.7的重量比例配制。
对比例1
与实施例2相比，取消添加类肠膜魏斯氏菌作为发酵剂，发酵剂由同比例的生理盐水代替，其余步骤等同于实施例2。
对比例2
与实施例2相比，将类肠膜魏斯氏菌替换为等量的中国专利CN103087964A实施例中的枯草芽孢杆菌（CGMCCNo.3532）（购于中国菌种保藏中心），枯草芽孢杆菌活菌数为1×108CFU/g，其余步骤同实施例2。
对比例3
与实施例2相比，将类肠膜魏斯氏菌SL7替换为等量的中国专利CN114456979A实施例中的类肠膜魏斯氏菌CGMCC NO .22238（购于中国微生物菌种保藏中心），类肠膜魏斯氏菌（CGMCC NO .22238）活菌数为1×108CFU/g，其余步骤等同于实施例2。
对比例4
与实施例2相比，不同之处仅在于发酵剂类肠膜魏斯氏菌替换为等量的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（购于北京万佳标准物质研发中心，编号CICC21827），其余步骤同实施例2。
试验设置：
以实施例2制得宠物食品作为实验组
以对比例1制得宠物食品作为对比例1组
以对比例2制得宠物食品作为对比例2组
以对比例3制得宠物食品作为对比例3组
以对比例4制得宠物食品作为对比例4组
以市售某冻干宠物食品作为对比例组5组。
试验例1 宠物食品物性测定
测试方法：采用TAXT Plus质构仪测定各组宠物食品的硬度、弹性、内聚性以及咀嚼性；采用P/36R型圆柱形探头，预测试速度2.00 mm/s，测试速度1.00 mm/s，测试后速度4mm/s；样品变形量50%。结果取平均值，测试结果如下表1所示：
表1 各试验组宠物食品的物性测定结果
。
由上述表格数据可知，实施例2的实验组制备的冻干宠物食品在硬度、弹性、内聚性以及咀嚼性方面都要优于对比例1-5组；从内聚性可看出宠物食品内部各机能凝聚的状态或程度，而实验组所得宠物食品的内聚性显著高于其他组，原因可能为类肠膜魏斯氏菌在发酵过程中使得白乌鱼鱼肉蛋白质变性和凝固使宠物食品各部分水分含量降低，使宠物食品的结构越来越紧密且更有弹性。
因此本发明提供的类肠膜魏斯氏菌作为发酵剂在改善冻干宠物食品结构和质地方面有较显著的作用，提升了产品品质，使其适口性更佳。
试验例2 感官评价
评价方法：采用10分制对颗粒外形、色泽、口味及气味进行打分评价。冻干宠物食品的感官评分标准如表2所示，结果取平均值。
表2 冻干宠物食品感官评分标准
。
测试结果如下表3所示：
表3 各试验组宠物食品的外观评价结果
。
由表3结果可以看出，本发明宠物食品即实验组与对比例1-5组相比，质地紧实、颗粒完整、表面细腻且香味浓郁，本发明冻干宠物食品成粒率高，克服了冻干宠物食品松散的问题，同时赋予浓郁的发酵风味，有助于提升宠物食欲。
试验例3 肠道改善效果验证
（1）选择有轻微腹泻的成年犬50只，按实施例2、对比例1组、对比例2组和对比例3组、对比例4组和对比例5组分为6组，每组10只，进行喂养试验；将犬粮放入投喂盒后让犬自由采食；日常管理为：每天分别在9:30、12:00、17:00左右投喂饲料，由犬自由采食，食后30min饮水，每天室外活动1-2h；持续30d时间；记录5d、10d、15d、20d、25和30d有腹泻症状宠物犬的数量。测试结果如下表4所示。
表4 犬类饲养期间的腹泻情况
。
根据表4结果数据可以看出，本发明实施例2提供的宠物食品相较于对照组和对比例1-5组，显著降低了宠物犬的腹泻率，有效改善了宠物肠道环境。
（2）随机从实验组、对比例1-5组中挑选3只宠物狗，在试验第0d和第30d时采取宠物新鲜狗粪便，放入无菌容器内用于肠道菌群培养计数，结果取平均值，结果见表5。
表5 各试验组宠物狗肠内菌情况
。
由表5可知，在试验前实验组和对比例1-5组之间无显著差异；而在试验结束后，实验组的大肠杆菌数量显著低于对比例1-5组，乳酸杆菌数量显著高于对照组。可以看出本发明提供的以类肠膜魏斯氏菌为发酵剂制备的宠物饲料对宠物的肠道菌群有明显调节作用，抑制了有害微生物的生长。
试验例4 毛发改善效果
选择健康状况、体重等各方面情况均类似的犬龄8个月左右的宠物狗50只，按实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5分为6组，每组10只，进行喂养试验；将犬粮放入投喂盒后让犬自由采食；日常管理为：每天分别在9:30、12:00、17:00左右投喂饲料，由犬自由采食，食后30min饮水，每天室外活动1-2h；持续30d时间；30d时间后，观察宠物犬的进食情况及毛发状态。测试结果如下表6所示。
表6 宠物犬进食情况及毛发状态
。
由表6可知，相比于对比例1-5组，实验组由本发明提供的以类肠膜魏斯氏菌为发酵剂制备的宠物食品，具有显著改善毛发的效果，显著减少宠物的掉毛量，有助于维持柔顺光滑、富有光泽的健康被毛状态，且具有更好的适口性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.类肠膜魏斯氏菌在宠物食品中的应用，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62429。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌SL7的菌液浓度为107～108CFU/ml。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述宠物食品的制备方法包含以下步骤： 向经过预处理的原料肉中加入类肠膜魏斯氏菌SL7发酵剂，混合均匀后在密封条件下，于35～40℃条件下发酵12～18h，得到发酵肉；
向发酵肉中加入经过预处理的其余原料，混合均匀后在-5～0℃条件下静置3～6h预冷定形为成形产品；以及
将成形产品置于-80～50℃条件下速冻12～24h后，进行真空冷冻干燥。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述类肠膜魏斯氏菌SL7发酵剂的添加量为原料肉质量的3.5～8%。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预处理的原料肉为将鲜肉研磨得到的肉泥。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经过预处理的其余原料包含：经过热烫的蔬菜、白乌鱼酶解物、熟化的红薯粉溶液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述熟化的红薯粉溶液是按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比配制红薯粉溶液，在70～80℃水浴锅中糊化30～60min，置于-80～50℃的冰箱中速冻12～18h后，进行真空冷冻，完成后粉碎过筛。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述白乌鱼酶解物的制备方法包含以下步骤： 向经过预处理的白乌鱼中按照（0.5～1）∶（1.5～2）的料液比加入纯水，混匀后加入复合蛋白酶，复合蛋白酶质量为白乌鱼原料的1～1.5%，于50～60℃条件下酶解8～12h得到酶解物；以及对酶解物进行灭酶处理。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述复合蛋白酶包含木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，质量比为（0.2～0.4）∶（0.5～0.8）∶（0.3～0.8）。
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| KR20090083234A (ko) * | 2008-01-29 | 2009-08-03 | 단양군 | 가축용 사료 첨가제 및 이를 포함하는 가축용 사료 |
| CN107897506A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-04-13 | 西北农林科技大学 | 杏鲍菇菌糠发酵饲料的制作方法与应用 |
| CN112779179A (zh) * | 2020-06-29 | 2021-05-11 | 云南省畜牧兽医科学院 | 一株类肠膜魏斯氏菌及其应用 |
| CN114456979A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-10 | 江南大学 | 一种在发酵食品中促进风味物质产生的类肠膜魏斯氏菌及其应用 |
-
2022
- 2022-09-15 CN CN202211120429.5A patent/CN115997842B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090083234A (ko) * | 2008-01-29 | 2009-08-03 | 단양군 | 가축용 사료 첨가제 및 이를 포함하는 가축용 사료 |
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| CN114456979A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-10 | 江南大学 | 一种在发酵食品中促进风味物质产生的类肠膜魏斯氏菌及其应用 |
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