CN115980158A - 一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法。从中间进样口注入血液样本，血液中的血细胞等通过滤膜过滤，而小尺寸的外泌体则通过滤膜流入底部的检测区域，基于灵敏的SPE电化学传感器可以对不同乳腺癌外泌体做出响应。FEMC内部的微通道将液体转移到集成阵列的电化学传感器上，具有良好的防止液体泄漏的性能。本发明通过将滤膜过滤和电化学检测相结合，可以直接从临床血样中进行外泌体蛋白分析，每次检测只需要更换中间的滤膜即可再次检测，芯片的利用率高，具有诊断时间快、自动化和便携式等显著优势，在BC的早期诊断、监测BC进程、BC分类和临床应用中具有重要的应用价值。

Description

一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法

技术领域

本发明涉及外泌体检测技术领域，尤其涉及一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法。

背景技术

乳腺癌(breast cancer,BC)已超过肺癌成为全球第一大癌，是一种高度异质化的癌症。临床医生在治疗时应考虑不同亚型的病例，因此给肿瘤诊断带来了更艰巨的挑战。目前临床上一般将BC分为Luminal A型，Luminal B型，HER2阳性型以及三阴性型。这些指标的获取需要穿刺获取组织标本进行检测，这种方法侵入性强。而在肿瘤发生早期传统诊断方法(影像学和病理学等)由于其敏感性和特异性不足，所以亟待开发一种新的灵敏检测方法来满足目前不同乳腺癌亚型分类的问题。

液体活检标志物具有无创、简便快捷并且能持续监测疾病变化等优点。其中外泌体作为新型的液体活检标志物为肿瘤的诊断和监测提供了新的方向。微流控芯片的检测技术具有微型化、集成化、自动化、便携以及低试剂消耗等一系列优点，能够有机地结合各种外泌体的检测技术，使其在生物分析方面应用广阔。电化学传感器能够灵敏地检测到低浓度的外泌体，从而在分析复杂的临床样本中脱颖而出，并且电化学传感器易于微型化，容易集成到微流控芯片中，可以加速向即时检测诊断过渡。但其在乳腺癌的早期亚型分类方面还未实现应用并且传统的检测方法在测定过程中容易导致部分外泌体被遗漏。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法。

实现本发明目的的技术方案是提供一种滤膜型电化学微流控芯片，包括滤膜区域和设置于滤膜区域下方的检测区域，芯片内部的微通道将通过滤膜区域的液体转移到检测区域。

进一步的，所述的滤膜区域内置有双滤膜，滤膜可更换。

进一步的，所述的检测区域为电化学传感区域，具体为SPE电化学生物传感器，SPE电极上修饰着不同的抗体。

进一步的，所述的检测区域内还含有MB@UiO-66电化学指示剂，可以非特异性的放大电流信号。

进一步的，所述滤膜型电化学微流控芯片还包括进样口。

进一步的，所述的检测区域有4个。

进一步的，一种滤膜型电化学微流控芯片检测乳腺癌外泌体的方法，包括以下步骤：

A、进样口注入一定量的血液样本；

B、血液样本通过滤膜区域，芯片外部的大孔径的滤膜将血液中的血细胞等过滤掉；

C、小尺寸的外泌体通过芯片内部小孔径的滤膜流入底部的四个检测区域的集成阵列的电化学传感器上；

D、外泌体可以被电化学传感器所捕获，通过CHI1030C电化学工作站进行响应。

进一步的，B或C中所述滤膜可更换。

进一步的，D中所述电化学传感器为SPE电化学生物传感器，SPE电极上修饰着不同的抗体，外泌体可以被SPE电极上特异性的抗体所捕获，通入MB@UiO-66通过Zr-O-P键非特异性的识别外泌体，通过电信号值检测出肿瘤外泌体表面不同标记蛋白的含量。

进一步的，所述方法可以同时进行多重外泌体蛋白标记物的检测。

采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

(1)本发明通过将滤膜过滤和电化学检测相结合，可以直接从临床血样中进行外泌体蛋白分析。

(2)本发明每次检测只需要更换中间的滤膜即可再次检测，芯片的利用率高。

(3)本发明直接对全血中的外泌体进行检测，省去了繁琐且耗时的提取步骤使得检测更加简便。

(4)本发明可以同时进行多重外泌体蛋白标记物的检测，采用电化学方法检测迅速且灵敏度高。

(5)本发明与标准方法ELISA相比检测限降低了两个数量级，具有更高的灵敏度，并且比ELISA需要更少的外泌体样品。

(6)本发明滤膜型电化学微流控芯片内部的微通道将液体转移到集成阵列的电化学传感器上，具有良好的防止液体泄漏的性能。

(7)本发明具有诊断时间快、自动化和便携式等显著优势，在BC的早期诊断、监测BC进程、BC分类和临床应用中具有重要的应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为滤膜型电化学芯片的模型图；

图2为滤膜型电化学芯片(FEMC)检测外泌体的流程图；

图3(a)为FEMC的实物图和模型图，宽度＝60mm，长度＝80mm；(b)为过滤区域的放大图；(c)为过滤区域内部流速分布的有限元模拟；

图4(a)为100nm、200nm、400nm和800nm孔径的PC膜的SEM图；(b)200nm孔径PC膜过滤血样后的SEM图；FEMC的不同孔径滤膜的优化(c)和流速优化(d)，误差条表示测量值的标准差(n＝3)；

图5(a-b)为SPE的逐步修饰对应的电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安扫描(CV)；(a-d)曲线分别表示：裸SPE、用抗体修饰后的SPE、与外泌体孵育后的SPE和用MB@UiO-66标记的SPE；(c)为裸SPE、无外泌体和有外泌体(1×10⁸particles/mL)的DPV响应；(d-f)表示不同抗体浓度、MB@UiO-66孵育时间以及浓度的优化；(g)为用SPE分别检测BSA、白蛋白、血红蛋白、葡萄糖、β-乳球蛋白和外泌体的DPV响应；(h)为在外泌体浓度为1×10⁸particles/mL时，6个SPE电极的信号；(i)为30天内SPE电极的峰值电流变化，所有的误差条表示测量值的标准差(n＝3)；

图6(a)为FEMC检测来自MB-231的外泌体(1×10⁴-1×10⁸particles/mL)的标准曲线图。(b)为ELISA检测来自MB-231的外泌体(1×10⁶-1×10⁹particles/mL)的标准曲线图；

图7(a-c)为Western blot、免疫组化以及FEMC分析10个外泌体蛋白标记物，雷达图分别展示这三种方法分析10种外泌体蛋白标记物；

图8(a)为四种乳腺癌小鼠肿瘤生长曲线图；(b)为小鼠肿瘤切片免疫组化分析代表图；

图9(a)为FEMC对四种不同乳腺癌外泌体分类分析；(b)为ELISA对四种不同乳腺癌外泌体分类分析；(c)为第35天和第55天小鼠血清中三种标记物的检测信号；(d)为乳腺癌患者(1-4)和健康人(5-22)血清外泌体肿瘤标记物的检测。

附图中标号为：1、滤膜区域；2、检测区域；3、进样口。

具体实施方式

实施例1芯片制作与模拟

1、芯片的制作

如图2所示，滤膜型电化学微流控芯片，包括滤膜区域1、设置于滤膜区域1下方的检测区域2和进样口3，内部的微通道将通过滤膜区域1的液体转移到检测区域2；滤膜区域1内置有双滤膜，滤膜可替换。检测区域2有4个，为电化学传感区域，具体为SPE电化学生物传感器，检测区域2内还含有MB@UiO-66电化学指示剂，可以非特异性的放大电流信号，更精准的定量外泌体。使用激光在粘有压敏胶的PC板材上切割出腔体和管道的形状作为芯片的结构层，分别雕刻三层不同的通道，最后压敏胶将这三层粘起来封装成整体。具体的具体参数如下：芯片主要由三层厚度分别为1mm，1.5mm和1mm的透明PC板组成，第一层PC板长和宽25mm，下面两层的长和宽分别为80mm和60mm，通道的高度为0.1mm，中间凹槽去高度为0.5mm，芯片整体厚度为3.5mm。在第二层PC板上，激光切割机切出一个直径为25mm的圆孔，作为中间过滤膜区域，四周雕刻出四个直径为4mm的圆形检测区，检测区的高度为0.2mm。第三层PC板切割出在对应第二层四个检测区雕刻出四个电化学芯片插入区域，长23mm，宽10mm，高0.2mm。

如图1所示，一种基于滤膜型电化学芯片检测乳腺癌外泌体的方法：从中间进样口3注入血液样本，经过滤膜区域1，芯片外部的大孔径的滤膜将血液中的血细胞等过滤掉，小尺寸的外泌体通过芯片内部小孔径的滤膜流入底部的四个检测区域2的集成阵列的电化学传感器上，具有良好的防止液体泄漏的性能；四个检测区域2的SPE电极上修饰着四种不同的抗体，外泌体可以被SPE电极上特异性的抗体所捕获，最后通入MB@UiO-66通过Zr-O-P键非特异性的识别外泌体，通过电信号值检测出肿瘤外泌体表面不同标记蛋白的含量。

2、芯片的模拟

血液中主要的成分有血小板、红细胞、外泌体，选取4、10、0.2μm粒子分别代表血小板、红细胞、外泌体，模拟血液的组成成分。由于血液中血小板、红细胞以及外泌体的数量较大，为了便于计算我们按实际数量的1％设定。假设膜和颗粒之间或不同颗粒之间没有相互作用的情况下，为了模拟芯片中滤膜区域对外泌体分离的效果，使用Fluent 2020软件进行仿真模拟，分析三种不同颗粒在滤膜区域的分布。模型按照实验参数进行三维建模，滤膜直径25mm，外泌体密度设为1.15g/mL，固定样本流速为50μL/min，温度为293.15K，进行仿真，然后进行网格划分，网格单元尺寸为20μm，整个模型划分为50000个网格单元。将几何模型导入至软件中进行物理场的设置与计算，流体运动模型为层流，导入离散相模型，通过离散相粒子的运动轨迹与时间积分得到粒子的分选轨迹。阻力定律遵循斯托克斯定律。模拟时，将通道预先灌满水，再将所有混合颗粒以一定流速从进口注入芯片的通道中，模拟不同颗粒的粒子在滤膜区域的流动情况。

实施例2SPE检测条件的优化及特异性、重现性稳定性研究

1、SPE电极的修饰

购买的SPE电极用超纯水超声清洗洗5min，室温晾干。滴加4％HS-PEG₂₀₀₀-NH₂乙醇溶液10μL到电极表面工作区域，孵育5min；接着滴加1mg/mL的GMBS乙醇溶液10μL到电极表面工作区域，孵育5min；滴加10μL生物素化的抗体孵育10min，最后滴加3％BSA溶液封闭，修饰好的电极4℃保存。将制备好的SPE插入检测区域，用于外泌体的检测分析。

2、SPE检测条件的优化

以MCF-7外泌体上CD81蛋白标记物的测定为模型，进行了下面实验以提高检测的灵敏度。采用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安扫描(CV)研究了SPE修饰的过程，图5(c)显示在外泌体(1×10⁸particles/mL)存在的情况下，其电流信号比没有外泌体的电流高出约6倍，证实了SPE电化学传感器检测外泌体表面蛋白标记物的可行性。为了使SPE电化学传感器对外泌体检测的性能达到最佳，首先对抗体的浓度进行了优化，当抗体浓度为10μmol时电流响应信号最高(如图5(d))。接着对MB@UiO-66的浓度以及孵育时间进行优化，10min以前随着外泌体与MB@UiO-66探针孵育时间的增加而增加，大于10min后电流信号趋于稳定(如图5(e))，因此，选择10min作为最佳结合时间。如图5(f)所示，可以观察到电流响应首先随着MB@UiO-66探针浓度的增加而增大，饱和点探针浓度1mg/mL之后几乎保持恒定。因此，选择结合时间10min以及探针浓度为1mg/mL作为后续的测试条件。

3、SPE特异性、重现性以及稳定性的研究

为了评估SPE电化学传感器的特异性、重现性以及稳定性，在相同条件下，选择了血液中常见的小分子物BSA、白蛋白、血红蛋白、葡萄糖、β-乳球蛋白进行特异性的研究，用SPE分别检测的其电流信号，图5(g)显示在外泌体存在的情况下，电流信号最强，表明了SPE电化学传感器的优良性能，能够排除血液中干扰物的影响。接着测量了在1×10⁸particles/mL浓度下外泌体，相同条件修饰的6个SPE电极的DPV信号，相对标准偏差(RSD)为5.74％，说明该SPE电化学传感器重现性良好，如图5(h)。抗体修饰后的SPE电极保存于4℃，在第5天、10天、20天以及30天时间点测量一次用于研究SPE传感器的稳定性，该传感器在30天内电流信号仅下降了6.5％，说明SPE电化学传感器具有良好的稳定性，如图5(i)。

实施例3外泌体的检测及表面蛋白分析

1、外泌体检测

采用FEMC测定外泌体的含量，外泌体经NTA量化后稀释为7个不同浓度。并与标准方法ELISA做对比。图6(a)显示了电流信号与MCF-7外泌体浓度(1×10⁴-1×10⁸particles/mL)的对数之间存在良好的线性关系，相关方程为y＝1.24x-3.31，R₂＝0.98，LOD为1×10⁴particles/mL。与标准方法ELISA相比，如图6(b)，检测限降低了两个数量级，具有更高的灵敏度，并且FEMC方法比ELISA需要更少的外泌体样品。

2、Western blot实验

收集MCF-7、SK-BR-3、BT474、MB-231和MCF-10A细胞进行CD63、CD81、EpCAM、MUC1、PSMA、EGFR、GPC1、HER2、CEA、CA125十种蛋白表达水平的测定。具体步骤如下：

(1)制胶：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备制作下层胶。根据蛋白分子量配置参照说明书配制合适的分离胶，加入促凝剂混匀快速加入到玻璃板至2/3处。然后在胶上缓慢加一层水压平，等待5-10min凝固后，用枪头吸除上层水。按说明书配上层胶，加入促凝剂摇匀后将剩余玻璃板空间灌满，插入梳齿，等待10-15min待凝固后拔除梳齿。(2)样本处理：细胞消化离心后，加入RIPA裂解液进行裂解，通过BCA试剂盒进行蛋白定量，固定每个样本量为20μg，上样前将样品与1×SDS上样缓冲液混合后在100℃沸水中煮10min使蛋白变性，然后等体积等浓度上样。(3)跑胶：将胶和玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后，加入样品，调电压至80V，运行20min使得Marker跑开分出彩带，再调电压至120V，运行60min。(4)转膜：提前制备转膜缓冲液并用甲醇活化PVDF膜1-2min，至半透明状。打开夹子依次垫上海绵垫、滤纸、胶片、PVDF膜、滤纸和海绵垫，避免产生气泡，将夹子盖好后放入转膜槽，倒入转膜缓冲液置于冰浴中，80V下转膜60min。(5)抗体曝光：取出PVDF膜后用5％BSA进行封闭。加入一抗，4℃过夜。用1×TBST洗3次，每次10min。加入羊抗兔二抗室温孵育1h，之后再用1×TBST洗3次，每次10min。(6)显影：将PVDF膜放在曝光盒中央，滴加显影液，擦去多余的液体进行曝光拍照。使用Image J进行灰度分析，如图7。

乳腺癌由于其高度的异质性，给肿瘤诊断带来了艰巨挑战。临床上根据病理组织标记物ER，PR，HER2和Ki-67一般将乳腺癌分为Luminal A型，Luminal B型，Her2阳性型以及三阴性型，对应的代表细胞系分别是MCF-7、BT474、SK-BR-3和MB-231。目前还没有一个单一的标记物具有足够高的敏感性和特异性能对此区分，于是采用FEMC测定了四种不同乳腺癌细胞来源的外泌体中常见的蛋白标记物。我们筛选了报道过的十种外泌体常见的表面标记物蛋白：CD63、CD81、EpCAM、PSMA、EGFR、CEA、HER2、MUC1、CA125和GPC1，进行乳腺癌外泌体表面蛋白分析。在最优的实验条件下，加入NTA测量后的外泌体进行FEMC测试，图7(c)显示了四种不同类型的乳腺癌外泌体的十种蛋白标记物在FEMC上的电流信号，柱状图中可以观察到CD81、CD63、CA125、MUC1和GPC1在MCF-7外泌体中过表达，HER2在BT474外泌体中过表达，EpCAM、EGFR和CEA在SK-BR-3外泌体中过表达，而CD63和PSMA在MB-231中过表达。为了验证FEMC检测外泌体的蛋白表达谱图，首先我们通过Western blot研究了四种细胞系中这十种蛋白的表达水平，如图7(a)。接着收集不同乳腺癌小鼠模型的肿瘤切片，将组织标本染色，通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)检测这些标记物，如图7(b)，进行组织化学评分(histochemistry score，H-score)，对组织染色进行半定量。进一步验证了上述结论，即可以通过外泌体表面蛋白表达谱图实现不同乳腺癌外泌体的检测。

实施例4血液样本的检测

1、小鼠血清样本

构建人源MCF-7、BT474、SK-BR-3和MB-23原位乳腺癌模型，60只BALB/c nude根据小鼠体重随机分为6组，每组10只小鼠。测量MB-231荷瘤小鼠的肿瘤体积以及小鼠体重变化。收集小鼠瘤块进行免疫组织化学分析。收集小鼠眼球血液，用FEMC分别进行CEA、EGFR、PSMA和CD81四个标记物的检测，总结各种肿瘤标记物的DPV电流响应绘制成热图。并与ELISA做比较。为了研究四种标志物在肿瘤不同阶段血清中的表达水平的变化，我们分别在30天和50天采集了小鼠眼球血液，代表肿瘤早期样本和晚期样本。用FEMC芯片进行外泌体检测。图8(a)显示小鼠的体重保持持续的稳定增长，以上结果表明成功构建了原位乳腺癌模型小鼠。收集小鼠瘤块进行免疫组织化学分析，图8(b)展示的是MB-231小鼠瘤块的CEA、EGFR、CD81和PSMA指标代表图。为了研究四种标志物在不同乳腺癌血清中的表达水平的变化以及FEMC用于监测癌症进程的可行性。收集小鼠眼球血液，用FEMC分别进行CEA、EGFR、PSMA和CD81四个标记物的检测。我们总结了各种肿瘤标记物的DPV电流响应绘制成热图，如图9(a)，显示来源于不同类型的乳腺癌外泌体上这四种标记物的表达水平显著不同，进一步验证了这四种肿瘤标记物能够成功区分乳腺癌亚型的能力，而ELISA在这四种标记物检测上是失败的，如图9(b)。为了研究四种标志物在肿瘤不同阶段血清中的表达水平的变化，我们分别在30天和50天采集了小鼠眼球血液，代表肿瘤早期样本和晚期样本。用FEMC芯片进行外泌体检测。图9(c)显示不同类型的四个标记物的表达水平呈现递增趋势，即Ctrl<Early<Adv，说明FEMC能成功用于乳腺癌疾病进程的监测。同时，FEMC比ELISA所需的样品量更少且灵敏度更高。该传感器可用于对不同亚型乳腺癌进行分类，并且联合多重标志物可实现对乳腺癌非侵入性的早期诊断。

2、人血清样本

对18名BC患者和4名健康人的血清外泌体进行四种标记物分析。分析健康个体(1-4)乳腺癌患者(5-22)的电流信号变化。比较电流信号(表1乳腺癌癌病人与健康人的病理信息)可以发现来源于乳腺癌患者的外泌体其CEA、EGFR、PSMA和CD81蛋白的平均表达水平高于来源于健康个体的外泌体。

表1乳腺癌癌病人与健康人的病理信息

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：包括滤膜区域(1)和设置于滤膜区域(1)下方的检测区域(2)，芯片内部的微通道将通过滤膜区域(1)的液体转移到检测区域(2)。

2.根据权利要求1所述的滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：所述的滤膜区域(1)内置有双滤膜，滤膜可更换。

3.根据权利要求1所述的滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：所述的检测区域(2)为电化学传感区域，具体为SPE电化学生物传感器，SPE电极上修饰着不同的抗体。

4.根据权利要求3所述的滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：所述的检测区域(2)内还含有MB@UiO-66电化学指示剂，可以非特异性的放大电流信号。

5.根据权利要求1所述的滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：还包括进样口(3)。

6.根据权利要求1所述的滤膜型电化学微流控芯片，其特征在于：所述的检测区域(2)有4个。

7.一种基于权利要求1所述滤膜型电化学微流控芯片检测乳腺癌外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、进样口(3)注入一定量的血液样本；

B、血液样本通过滤膜区域(1)，芯片外部的大孔径的滤膜将血液中的血细胞等过滤掉；

C、小尺寸的外泌体通过芯片内部小孔径的滤膜流入底部的四个检测区域(2)的集成阵列的电化学传感器上；

D、外泌体可以被电化学传感器所捕获，通过CHI1030C电化学工作站进行响应。

8.根据权利要求7所述滤膜型电化学微流控芯片检测乳腺癌外泌体的方法，其特征在于，B或C中所述滤膜可更换。

9.根据权利要求7所述滤膜型电化学微流控芯片检测乳腺癌外泌体的方法，其特征在于，D中所述电化学传感器为SPE电化学生物传感器，SPE电极上修饰着不同的抗体，外泌体可以被SPE电极上特异性的抗体所捕获，通入MB@UiO-66通过Zr-O-P键非特异性的识别外泌体，通过电信号值检测出肿瘤外泌体表面不同标记蛋白的含量。

10.根据权利要求7所述滤膜型电化学微流控芯片检测乳腺癌外泌体的方法，其特征在于，所述方法可以同时进行多重外泌体蛋白标记物的检测。

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