CN115975878A - 一株特基拉芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌的新菌株Bacillus tequilensis XD63Y，其保藏号为GDMCC No:62521，具备增加养殖水体溶解氧的能力。本发明还公开了所述特基拉芽孢杆菌XD63Y及其制备的生物制剂的应用。本发明提供的特基拉芽孢杆菌XD63Y能够提高水体溶解氧，可大大节省水产养殖过程增氧成本，减少碳排放，对节能减排有非常重要的意义；更重要的是，本发明的特基拉芽孢杆菌制备的生物制剂在水产养殖技术领域有十分广阔的应用前景和市场空间。
Description
技术领域
本发明涉及了一株特基拉芽孢杆菌。本发明同时还涉及了使用该特基拉芽孢杆菌新菌株制备的生物制剂，以及其在水产养殖中的应用。
背景技术
水体溶解氧是水产养殖最为重要的技术指标，是水产养殖动物赖以生存的必备条件，传统池塘或滩涂养殖中由于养殖密度很低，靠空气流动自然溶解到水体中的氧气就足以维持养殖动物的生长需要，但随着人工养殖的快速发展，养殖密度不断的增加，自然溶解的溶解氧远远不能满足水产养殖动物的需求，人们需要用增氧机、水车等来增加养殖池塘的溶解氧，这就需要大量的电能，就以南美白对虾的养殖为例，每年用于增氧的电费成本已经占到养殖总成本的20％甚至更高，这样浪费了大量能源，还增加了碳排放。
由于放养密度过大，投料造成的残饵积累和粪便排泄物的积累增多，有机物分解耗氧严重，且饲料含有大量的蛋白质，投料过多，残饵不断积累在底部，经过微生物参与的一系列的生化反应，使得养殖水体中溶解氧出现分层现象，中下层溶解氧明显低于中上层，而水体溶解氧的分层造成底部积累的有毒有害物质无法快速被分解，在天气突变时容易反底，危害养殖动物。另一方面，养殖中投料造成的残饵积累和粪便排泄物的积累增多，使得养殖水体的粘度增大，通透性降低，与氧气交换能力降低，也是造成中下层溶解氧含量降低的重要原因，容易造成水产动物缺氧死亡，造成重大的经济损失。为了解决养殖过程中出现的上述问题，养殖场通常增加各类增氧机以增加水体中溶氧量，但是这又大大提高了养殖成本，并且增加了能耗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株特基拉芽孢杆菌的新菌株(Bacillustequilensis)XD63Y，其保藏号为GDMCC No:62521，该菌株具备增加养殖水体溶解氧的能力。将其应用在水产养殖中，能够改善养殖水体质量。在本发明人的试验过程中，发现在养殖水体中添加该菌，可提高养殖水体内部的通透性，改善水体氧气交换性能，从而提高养殖水体中的溶解氧含量，特别是中下层水体的溶解氧含量。
本发明提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)XD63Y，已经于2022年6月7日送广东省微生物保藏中心进行菌种DNA测序、鉴定和保藏，并收到保藏登记号GDMCC No:62521，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供一种用上述特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的生物制剂。
本发明第二个目的通过以下技术措施来实现：特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的养殖水体增氧生物制剂，由特基拉芽孢杆菌XD63Y经发酵而得，含有特基拉芽孢杆菌XD63Y。
具体地，特基拉芽孢杆菌XD63Y接种至培养基中，恒温水浴摇床，用40-50℃，10-30转/分钟慢速摇瓶，摇瓶24-96小时即可制成目标养殖水体增氧生物制剂。其中，培养基包含：蒸馏水500ml，葡萄糖5-40％，酵母膏0.3-3％，N 0.5-5％，P2O5 0.3-3％，K2O 0.1-2％，微量元素0.05-1％，pH为5.5-8.5。
本发明的第三个目的涉及上述特基拉芽孢杆菌XD63Y及其制备的生物制剂的应用。具体地，涉及上述特基拉芽孢杆菌XD63Y在改善养殖水体溶氧能力的应用。涉及上述特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的生物制剂在改善养殖水体溶氧能力的应用。
具体地，在养殖水体中按每666立方米添加0.5-4升特基拉芽孢杆菌XD63Y生物制剂，即可达到增加养殖水体溶解氧3-10mg/L的目的。
本发明提供的特基拉芽孢杆菌XD63Y能够提高水体溶解氧，可大大节省水产养殖过程增氧成本，减少碳排放，对节能减排有非常重要的意义；更重要的是，本发明的特基拉芽孢杆菌制备的生物制剂在水产养殖技术领域有十分广阔的应用前景和市场空间。
附图说明
图1是本发明的DNA测序图。
具体实施方式
实施例一
1.菌种的驯化和筛选
从菌种保藏中心和淘宝上购买6株特基拉芽孢杆菌，编号为XD51Y-XD56Y，再从广东江门鹤山市桃源镇中心村周边的土壤和臭水沟中筛选菌体和菌落形态接近特基拉芽孢杆菌的菌株15株菌株，编号为XD57Y-XD71Y，将它们分别经20代厌氧环境的诱变培养，最后筛选出在厌氧环境中产氧能力最强的菌株。
2.上述用于诱变培养的厌氧环境及专用培养基的制备
用1000ml的玻璃烧杯，装入900ml蒸馏水并加入驯化培养基2-20g，每12小时滴入5ml亚硫酸钠50倍稀释液以脱掉水体中的溶解氧。
上述驯化培养基配方为：葡萄糖5-40％，酵母膏0.3-3％，硝酸钾0.5-6％，磷酸氢二铵0.3-5％，氯化钠0.2-2％，硝酸锌0.02-0.1％，硝酸锰0.02-0.1％，硼酸0.01-0.1％，硝酸铁0.02-0.15％，用蒸馏水定容至100ml，调整pH为6.5-7.5。
3.培养方法：取上述装好培养液的烧杯66个，将上述21株菌种分别接种到其中，每个菌株接种3瓶，剩下3瓶作为空白对照，将这66个培养瓶放入30-45度培养箱培养48-96小时后测定培养液的溶解氧。
表一第1代驯化过程各试验组3瓶溶解氧平均值前7个菌株
表二第10代驯化过程各试验组3瓶溶解氧平均值前7个菌株
| 菌株号 | 0小时 | 24小时 | 48小时 | 72小时 | 96小时 |
| XD58Y | 7.80mg/L | 9.86mg/L | 10.45mg/L | 11.01mg/L | 11.32mg/L |
| XD63Y | 7.80mg/L | 9.86mg/L | 10.46mg/L | 11.00mg/L | 11.31mg/L |
| XD70Y | 7.80mg/L | 9.81mg/L | 10.40mg/L | 10.95mg/L | 11.28mg/L |
| XD53Y | 7.80mg/L | 9.82mg/L | 10.41mg/L | 10.93mg/L | 11.26mg/L |
| XD56Y | 7.80mg/L | 9.79mg/L | 10.38mg/L | 10.92mg/L | 11.23mg/L |
| XD61Y | 7.80mg/L | 9.77mg/L | 10.37mg/L | 10.84mg/L | 11.21mg/L |
| XD66Y | 7.80mg/L | 9.75mg/L | 10.35mg/L | 10.82mg/L | 11.18mg/L |
表三第20代驯化过程各试验组3瓶溶解氧平均值前7个菌株
| 菌株号 | 0小时 | 24小时 | 48小时 | 72小时 | 96小时 |
| XD63Y | 7.80mg/L | 12.15mg/L | 12.56mg/L | 13.05mg/L | 13.38mg/L |
| XD53Y | 7.80mg/L | 12.13mg/L | 12.55mg/L | 13.03mg/L | 13.36mg/L |
| XD56Y | 7.80mg/L | 12.13mg/L | 12.53mg/L | 13.00mg/L | 13.33mg/L |
| XD61Y | 7.80mg/L | 12.11mg/L | 12.52mg/L | 13.01mg/L | 13.30mg/L |
| XD70Y | 7.80mg/L | 12.08mg/L | 12.48mg/L | 12.97mg/L | 13.26mg/L |
| XD58Y | 7.80mg/L | 12.09mg/L | 12.49mg/L | 12.95mg/L | 13.23mg/L |
| XD66Y | 7.80mg/L | 12.07mg/L | 12.40mg/L | 12.91mg/L | 13.18mg/L |
4.筛选方法
筛选目标是筛选出培养液中溶氧氧最高的菌株，首先是在所有培养瓶中挑选出溶解氧最高的前7个菌株，分别分离出其中的菌种进行纯化培养，培养后每个培养皿筛选1个菌体形态和菌斑形态最接近特基拉芽孢杆菌的菌斑进入下一轮驯化培养，以此类推共进行20代驯化诱变培养和筛选，最终筛选出提高水体溶解氧能力最强的菌株位。
表四XD63Y驯化过程第1、第10、第20代72小时培养液的溶解氧情况
5.筛选结果
最终筛选出的菌株命名为XD63Y，将其进行纯化并提纯培养后，2022年6月7日送广东省科学院微生物研究所进行DNA测序，测序结果将附图1，结果证明该菌株是一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)的菌株，并已经由广东省微生物保藏中心保藏，并收到保藏登记号为GDMCC No：62521。
实施例二
2021年6月22日至8月18日，在广东省江门鹤山市共和镇胡成杰养殖场进行夏季养殖试验，研制周期56天，设一个试验塘和一个对照塘，均为5亩，养殖动物均为南美白对虾，养殖密度均为每40万尾。
1.试验方案
试验塘一施用XD63Y生物制剂，并开启水车式增氧机。
对照塘只开启水车式增氧机。
2.施用方法及施用量
XD63Y生物制剂每亩2.00升，5亩共施用10.00升，用试验塘的水稀释20-30倍后全塘均匀泼洒，具体的：取试验塘的水400升加入500升容器中，加入10.00升XD63Y生物制剂，稀释后全塘均匀泼洒。
3.施用时间及施用次数
试验组和对照组均于2021年6月22日放苗，2021年6月29日第一次施用XD63Y生物制剂，所有试验组试验过程每隔7天施用一次，早上7:30开始施用，按上述试验方案施用XD63Y生物制剂后，开启水车式增氧机增氧3小时，然后关闭增氧机进行溶解氧测量，试验结果见表五、表六、表七。
表五2021年6月29日各试验组表层水溶解氧情况(晴转多云，有阳光)
从表五可以看出：在各方面养殖条件相同的情况下：
试验塘一XD63Y生物制剂促进了藻类的生长，溶解氧全天各时段的溶解氧均高于对照组。
表六2021年6月29日13:00各试验组不同水层溶解氧情况(有阳光)
表七：2021年6月29日18:00各试验组不同水层溶解氧情况(多云)
从表六、表七可以看出：在各方面养殖条件相同的情况下：
试验塘一XD63Y生物制剂与对照组相比，养殖水体不同水层的溶解氧都有较大的提高，特别是在下午六点没有光照藻类光合作用基本停止，同时还未开启增氧机的条件下，中下层以下的溶解氧下降的幅度比中上层以上水体要小一些。
2021年7月6日，7月13日，7月20日，7月27日，8月3日，8月10日分别进行了第二、三、四、五、六、七次施用，检测结果的数据跟6月29日的数据基本一致，只不过随着养殖动物逐步长大，对氧气的需求量越来越大，中层以下的溶解氧数值会略低一些，养殖户的解决方法是把增氧机开机的时间延长一些来解决这个问题。
2021年8月18日开始捕捞，表八是试验塘的产量及成本数据
表八2021年8月18日试验塘捕捞后统计的养殖成本及收益数据
从表八可以看出：在各方面养殖条件相同的情况下，XD63Y生物制剂对提高养殖产量，降低养殖成本有较好的效果。
试验塘一与对照塘相比，增产明显，由于增产的收益分摊了塘租、人工、水费等固定费用，是养殖总成本占比下降，同时由于使用了生物制剂大幅度减少了增氧机的开机时间，使电费占比明显下降，当然由于使用了生物制剂增加了部分制剂使用成本，但增加与成本与增收的效益以及减少的成本相比是很少的。
实施例三
2021年9月18日至11月30日，在广东省江门鹤山市共和镇胡成杰养殖场进行秋季养殖试验，养殖周期72天，同样设一个试验塘和一个对照塘，均为5亩，养殖动物均为南美白对虾，养殖密度均为每40万尾。
实验方案、施用方法及施用量、施用时间及施用次数与实施例二相同，试验过程由于秋季光照强度、气温的因素的影响，养殖周期比夏季长了16天，整体产量比夏季略低。试验结果见表九、表十、表十一。
表九2021年9月25日各试验组表层水溶解氧情况(晴转多云，有阳光)
| 试验塘 | 7:30 | 11:00 | 13:00 | 15:00 | 18:00 |
| 试验塘一 | 4.90mg/L | 9.80mg/L | 10.15mg/L | 10.15mg/L | 7.65mg/L |
| 对照塘 | 4.90mg/L | 7.25mg/L | 8.00mg/L | 7.90mg/L | 5.95mg/L |
从表五可以看出：在各方面养殖条件相同的情况下：
试验塘一XD63Y生物制剂促进了XD63Y的生长，在秋季实验中的溶解氧在全天各时段都高于对照塘，增氧效果明显。
表十2021年9月25日13:00各试验组不同水层溶解氧情况(有阳光)
表十一2021年9月25日18:00各试验组不同水层溶解氧情况(多云)
从表十、表十一可以看出：在秋季养殖各方面养殖条件相同的情况下：
试验塘一XD63Y生物制剂与对照组相比，养殖水体不同水层的溶解氧都有较大的提高，特别是在下午六点没有光照藻类光合作用基本停止的条件下，中下层以下的溶解氧下降的幅度比中上层以上水体要小一些。
2021年10月2日，10月9日，10月16日，10月23日，10月30日，11月6日，11月13日，11月20日分别进行了第二、三、四、五、六、七、八、九次施用，检测结果的数据跟9月25日的数据基本一致，只不过随着养殖动物逐步长大，对氧气的需求量越来越大，中层以下的溶解氧数值会略低一些，养殖户的解决方法是把增氧机开机的时间延长一些来解决这个问题。
2021年11月30日开始捕捞，表十二是试验塘的产量及成本数据
表十二2021年11月30日试验塘捕捞后统计的养殖成本及收益数据
从表十二可以看出：在各方面养殖条件相同的情况下，XD63Y生物制剂对提高养殖产量，降低养殖成本有较好的效果。
试验塘一与对照塘相比，增产明显，由于增产的收益分摊了塘租、人工、水费等固定费用，是养殖总成本占比下降，同时由于使用了生物制剂大幅度减少了增氧机的开机时间，使电费占比明显下降，当然由于使用了生物制剂增加了部分制剂使用成本，但增加与成本与增收的效益以及减少的成本相比是很少的。
Claims (7)
1.特基拉芽孢杆菌的新菌株Bacillus tequilensis XD63Y，其保藏号为GDMCC No:62521，具备增加养殖水体溶解氧的能力。
2.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的养殖水体增氧生物制剂，其特征是，由特基拉芽孢杆菌XD63Y经发酵而得，含有特基拉芽孢杆菌XD63Y。
3.根据权利要求2所述的特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的养殖水体增氧生物制剂，其特征是，其制备方法为：特基拉芽孢杆菌XD63Y接种至培养基中，恒温水浴摇床，用40-50℃，10-30转/分钟慢速摇瓶，摇瓶24-96小时即可制成目标养殖水体增氧生物制剂。
4.根据权利要求3所述的特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的养殖水体增氧生物制剂，其特征是，所述培养基包含：蒸馏水500ml，葡萄糖5-40％，酵母膏0.3-3％，N 0.5-5％，P2O5 0.3-3％，K2O 0.1-2％，微量元素0.05-1％，pH为5.5-8.5。
5.权利要求1所述特基拉芽孢杆菌XD63Y在改善养殖水体溶氧能力的应用。
6.权利要求2-4任一项所述特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的生物制剂在改善养殖水体溶氧能力的应用。
7.根据权利要求6所述的特基拉芽孢杆菌XD63Y制备的生物制剂在改善养殖水体溶氧能力的应用，其特征是，在养殖水体中按每666立方米添加0.5-4升特基拉芽孢杆菌XD63Y生物制剂。
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