CN115975173A - 一种酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结构式如下的酰胺键连接的聚乙二醇‑磷脂成脂材料及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。本发明的酰胺键连接的聚乙二醇‑磷脂成脂材料由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE与PEG2K‑CDM通过酰化反应制得。本发明的酰胺键连接的聚乙二醇‑磷脂成脂材料能够用于制备具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体。本发明将酰胺键连接的聚乙二醇‑磷脂成脂材料与双胍类阳离子材料制备的脂质体，可在肿瘤组织基质脱去PEG，促进纳米粒子在肿瘤中的渗透和肿瘤细胞的内化，提高肿瘤细胞内药物含量，进而提高药物治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料及其制备方法与应用。
背景技术
恶性细胞增殖和新生血管不足导致肿瘤缺氧，这是快速生长的实体肿瘤的一个常见特征。值得注意的是，进展期肿瘤对缺氧应激的适应不仅会加速肿瘤的侵袭和转移，还会导致对氧依赖治疗的治疗耐药性和不良预后，由于缺氧条件下活性氧(ROS)的生成受限，光动力疗法(PDT)作为一种很有前景的介入治疗方法受到了严重的挑战。许多策略已经被用来克服PDT的缺氧限制，如直接输送氧气(O2)、催化分解细胞过氧化氢(H2O2)产氧、光解水产氧等。然而，由于有限的氧气负荷、O2泄漏、内源性H2O2水平不足以及低氧气产生率等限制，导致治疗效果不理想。一般来说，供氧和耗氧之间的平衡决定了肿瘤内的氧压水平。在肿瘤组织新生血管不足、血流缓慢的情况下，相比直接增加氧气供应，减少氧气消耗可能是消除肿瘤缺氧的更好策略。特别是氧化磷酸化(OXPHOS)代谢途径需要不断消耗O2来产生ATP以保证细胞存活，通过抑制线粒体电子传递链(ETC)中的线粒体复合物来降低OXPHOS的耗氧量，实现O2节约是可行的。此外，OXPHOS抑制剂和光敏剂(PSs)的共定位对O2节约型PDT至关重要，以避免PSs和O2的不均一分布。
二甲双胍是一种应用广泛的治疗2型糖尿病的小分子药物，研究表明，二甲双胍可通过抑制线粒体复合物I有效缓解肿瘤缺氧。然而，二甲双胍的亲水特性导致瘤内积聚不足，不同的物理化学性质限制了其与其它药物的共同递送。纳米载体可以解决这个问题，但复杂的设计和不可生物降解性限制了他们的临床转化。因此，设计一种既能充当药物载体材料，又能充当抗肿瘤药物的成脂材料是具有前景的，避免过多辅料的使用。
纳米颗粒提高药物疗效需要具备以下几个条件：1)具有合适的血液循环时间；2)能够增强药物在肿瘤中的富集；3)能够促进肿瘤细胞对药物的内化；4)进入肿瘤细胞后药物分子能够快速释放。制备脂质体时通常加入聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂材料以延长脂质体的血液循环时间，改善药物在体内的分布，提高治疗效果。覆盖在脂质体表面的PEG虽然延长脂质体的血液循环时间，提高纳米颗粒在肿瘤中的富集，但也阻碍了肿瘤细胞对纳米药物的摄取。
研究表明，肿瘤细胞通过糖酵解来满足其快速增殖时所需要的营养和能量，糖酵解产生的乳酸堆积使肿瘤组织的pH值低于正常组织和血液，肿瘤组织基质pH 6.5～6.8，与正常生理环境的pH值相差较小，这对酸敏感化学键提出了更高的要求。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料及其制备方法与应用。本发明将酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料与双胍类阳离子材料制备的脂质体，可在肿瘤组织基质脱去PEG，促进纳米粒子在肿瘤中的渗透和肿瘤细胞的内化，提高肿瘤细胞内药物含量，进而提高药物治疗效果。
本发明第一个目的是提供一种结构式如下的酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料：
本发明提供的上述酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料，其酰胺键可在pH小于6.8时断裂，具有良好的pH敏感性。
本发明第二个目的是提供上述酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料的制备方法，由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE与PEG2K-CDM通过酰化反应得到所述酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料DSPE-ASlink-PEG2k。
本发明一个优选地实施方式是所述PEG2K-CDM由以下方法制得：以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酸为原料，加入草酰氯，制得2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯；以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯为原料，与PEG2K-OH进行酯化反应，制得PEG2K-CDM。
优选地，所述PEG2K-CDM与DSPE混合后，加入三乙胺，加热搅拌反应，即得DSPE-ASlink-PEG2k；所述PEG2K-CDM与DSPE的摩尔比为1：1～2。
进一步优选地，所述PEG2K-CDM与DSPE的摩尔比为1：1。
进一步优选地，所述反应的溶剂为氯仿；反应的温度为45～50℃；反应时间为16～24h。
优选地，所述DSPE-ASlink-PEG2k的纯化过程为：将反应溶液滴到冷乙醚中沉淀，再用冷乙醚洗涤两次。
本发明第三个目的是提供上述酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料在制备具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体中的应用。
本发明第四个目的是提供一种具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体，所述纳米脂质体由以下方法制得：N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺与胆固醇形成阳离子脂质体，插入DSPE-ASlink-PEG2K，制备成血液循环相对稳定的纳米脂质体。
优选地，所述纳米脂质体粒径为100～250nm。在处方比例相同条件下，过不同孔径的膜，可以制备出不同粒径的纳米粒子。
所述纳米脂质体在肿瘤微环境，即pH小于6.8，脱去PEG水化层从而促进肿瘤组织的渗透和细胞内化。
本发明第五个目的是提供上述具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
将N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺DOBG、胆固醇和DSPE-ASlink-PEG2K按照质量比为10～40：4：2～5，混合均匀，蒸馏得到脂质薄膜，超声水化薄膜得到粗脂质体溶液；粗脂质体溶液过膜得最终纳米脂质体溶液。
本发明制备的纳米脂质体作为药物载体，可以负载例如T780等抗肿瘤药物，上述纳米脂质体具有良好的pH敏感性，在肿瘤微环境可脱去PEG水化层，促进纳米粒子在肿瘤组织的渗透和肿瘤细胞的内化，提高细胞内药物含量。当负载T780时，由于作用于线粒体复合物I的N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺与T780在线粒体共定位，可增强光疗效果。
负载的药物T780由IR780与(3-氨基丙基)三苯基溴化膦通过取代反应得到。
本发明载药纳米脂质体的一种优选地制备方法，包括以下步骤：
分别将DOBG(N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺)，胆固醇，DSPE-ASlink-PEG2k，T780溶于5ml氯仿中，质量比为13：4：2：1，超声混合均匀，在40℃下旋转蒸发得到脂质薄膜，超声水化薄膜得到粗脂质体溶液。粗脂质体溶液过膜得最终脂质体溶液。
本发明所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺为一种载体和药用兼备的双胍类阳离子脂质材料，其结构式如下：
本发明提供的双胍类阳离子脂质材料，既能充当脂质体的成脂材料，又具有抑制线粒体复合物I缓解肿瘤缺氧和抗肿瘤的作用，其制备的纳米载体负载光敏剂时，可增强光敏剂的光动疗效。特别是负载线粒体靶向光敏剂，可通过其与光敏剂在线粒体的共定位，增强光动力治疗的效果。
本发明提供的双胍类阳离子脂质材料与盐酸或三氟乙酸形成盐。
本发明一种优选地实施方式是所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺由以下方法制得：N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺与油酰氯通过酯化反应得到Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺，再通过脱Boc得到N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺，最后通过亲核加成反应得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺。
进一步优选地，将N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺与双氰胺在氮气氛围下加热搅拌反应，反应完成后，旋蒸除去溶剂并用二氯甲烷重新溶解，用甲醇和氯化钠的混合溶液洗涤，旋蒸除去溶剂得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺粗产物；所述N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺与双氰胺的摩尔比为1：1～4。
更进一步优选地，所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺与双氰胺的摩尔比为1：3.5。
更进一步优选地，所述反应温度为120℃；反应时间为24h。
进一步优选地，所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺粗产物采用硅胶柱色谱提纯，提纯过程采用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱。
本发明还提供了所述N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的制备方法：将Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌反应，反应完成后除去溶剂，用二氯甲烷重新溶解，用超纯水洗涤，旋蒸溶剂得到油状粗产物；所述油状粗产物采用硅胶柱色谱提纯，提纯过程采用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱。
进一步优选地，所述二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1：0.25～1。
更进一步地，所述二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1：1；所述Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺与三氟乙酸的反应时间为6h。
本发明还提供了所述Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的制备方法：将N-叔丁氧羰基-N，N-(2-羟乙基)乙二胺与DMAP和三乙胺混合，缓慢加入油酰氯溶液，室温搅拌，反应结束后，用甲醇和氯化钠的混合溶液终止反应，收集有机相，用稀碳酸氢钠溶液洗涤，旋蒸除去有机溶剂，即得粗产物。
进一步优选地，反应溶剂为氯仿；所述油酰氯溶液溶剂为氯仿；所述N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺、油酰氯、DMAP和三乙胺的摩尔比为1：2～5：0.1～1：2～5。
更进一步地，所述N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺、油酰氯、DMAP和三乙胺的摩尔比为1：2：0.15：2；所述N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺、油酰氯、DMAP和三乙胺的反应时间为16h；所述甲醇和氯化钠溶液的体积比为1：1。
有益效果：
(1)模拟DSPE-PEG2k，本发明合成了酰胺键连接的DSPE-ASlink-PEG2k。相比于DSPE-PEG2k，DSPE-ASlink-PEG2k具有良好的pH敏感性，可在肿瘤组织降解脱去PEG，促进纳米粒子的内化。
(2)DSPE-ASlink-PEG2k、N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺和胆固醇制备的纳米脂质体，可在肿瘤组织脱去PEG水化层，促进肿瘤组织的渗透和肿瘤细胞的内化，解决了二甲双胍亲水性强导致的肿瘤积聚不足的问题。
(3)上述纳米脂质体包载T780后，通过氧化呼吸链抑制剂与光敏剂协同增强光动力治疗效果。
(4)本发明合成了一种双胍类阳离子脂质材料(N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺)，既是载体材料，又可以缓解肿瘤缺氧。
附图说明
图1为实施例1的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的核磁图谱；
图2为实施例1的N，N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺的核磁图谱；
图3为实施例3的DSPE-ASlink-PEG2k的核磁图谱；
图4为T780@ASDOBG的粒径分布图；
图5为western blotting检测不同药物处理后，细胞内上调的p-AMPK蛋白表达水平，细胞内下调的HIF-1α蛋白表达水平和PD-L1蛋白表达水平。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
鉴于二甲双胍水溶性强，瘤内积聚差，为了解决如上的技术问题，本发明提供了一种双胍类阳离子脂质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺与DMAP和三乙胺混合，然后缓慢加入油酰氯溶液，室温搅拌，反应完成后，用甲醇和氯化钠的混合溶液淬灭反应，收集有机相，再用稀碳酸氢钠溶液洗涤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-氨基乙基胺。
(2)N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-氨基乙基胺溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌反应，反应完成后除去溶剂，用二氯甲烷重新溶解，然后用超纯水洗涤，旋蒸溶剂得到油状粗产物。柱色谱纯化(二氯甲烷和甲醇梯度洗脱)。
(3)N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺的合成。
将N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺与双氰胺在氮气氛围下加热搅拌反应，反应完成后，旋蒸除去溶剂并用二氯甲烷重新溶解，用甲醇和氯化钠的混合溶液洗涤，旋蒸除去溶剂得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺粗产物。柱色谱纯化(二氯甲烷和甲醇梯度洗脱)。
实施例1N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺的制备
(1)Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺(0.415g，1.67mmol)与DMAP(0.306g，0.25mmol)和三乙胺(0.464ml，3.34mmol)加入到7ml氯仿中混合，在冰浴条件下缓慢加入油酰氯(1.05g，3.49mmol)在3ml氯仿中的溶液，室温搅拌16h，反应完成后，用8ml甲醇和氯化钠的混合溶液(甲醇和氯化钠的体积比为1：1)淬灭反应，收集有机相，再用4ml稀碳酸氢钠溶液洗涤，旋蒸除去有机溶剂得到1.3g如浅黄色油状的粗产品。
(2)N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-氨基乙基胺(1.3g，1.67mmol)溶于8ml二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌反应6h，其中二氯甲烷和三氟乙酸体积比为1：1。反应完成后除去溶剂，用10ml二氯甲烷重新溶解，用超纯水洗涤，旋蒸溶剂得到油状粗产物。粗产用柱层析纯化，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，洗脱程序为100：1，50：1，20：1，最终得到0.91g油状产物(产率：60％)。核磁图谱见图1。
1HNMR(300MHz，CDCl3)，δ0.87(t，6H，CH3)，δ1.27(m，40H，CH2)，δ1.56(m，4H，CH2CH2C(＝O))，δ2.00(m，8H，CH2CH＝CH)，δ2.29(t，4H，CH2C(＝O))，δ2.82-2.90(t，4H，CH2N)，δ3.04(t，2H，CH2NH)，δ4.14(t，4H，NCH2CH2O)，δ5.35(m，4H，CH＝CH)。
(3)N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺(DOBG)的合成
将N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺(0.904g，1mmol)溶于5ml正丁醇，然后加入双氰胺(0.168mg，3.5mmol)，120℃并在氮气氛围下加热搅拌反应24h，反应完成后，旋蒸除去溶剂并用20ml二氯甲烷重新溶解，用10ml甲醇和氯化钠的混合溶液(甲醇和氯化钠的体积比为1：1)洗涤，旋蒸除去溶剂得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺粗产物。粗产物用柱层析纯化，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，洗脱程序为50：1，30：1，20：1，10：1，最终得到0.445mg蜡状产物(产率45％)。核磁图谱见图2。
1HNMR(300MHz，CDCl3)，δ0.87(t，6H，CH3)，δ1.27(m，40H，CH2)，δ1.56(m，4H，CH2CH2C(＝O))，δ2.00(m，8H，CH2CH＝CH)，δ2.29(t，4H，CH2C(＝O))，δ2.77(t，2H，CH2N)，δ2.86(t，4H，NCH2CH2O)，δ3.31(t，2H，CH2NH)，δ4.14(t，4H，NCH2CH2O)，δ5.35(m，4H，CH＝CH)，δ6.5-7.2为双胍信号峰。
实施例2N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺的制备
(1)Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺(0.415g，1.67mmol)、DMAP(0.47g，0.38mmol)和三乙胺(0.7ml，5.01mmol)加入到7ml氯仿中，在冰浴条件下缓慢加入油酰氯(1.58g，5.24mmol)在3ml氯仿中的溶液，室温搅拌16h，反应完成后，用8ml甲醇和氯化钠的混合溶液(甲醇和氯化钠溶液的体积比为1：1)淬灭反应，收集有机相，再用4ml稀碳酸氢钠溶液洗涤，旋蒸除去有机溶剂得到1.6g如浅黄色油状的粗产品。
(2)N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺的合成
将Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-氨基乙基胺(1.6g，2mmol)溶于6ml二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌反应6h，其中二氯甲烷和三氟乙酸体积比为1：0.25。反应完成后除去溶剂，用10ml二氯甲烷重新溶解，用超纯水洗涤，旋蒸溶剂得到油状粗产物。粗产用柱层析纯化，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，洗脱程序为100：1，50：1，20：1，最终得到0.91g油状产物(产率：50％)。
(3)N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺(DOBG)的合成
将N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺(0.904g，1mmol)溶于5ml正丁醇，然后加入双氰胺(0.096g，2mmol)，氮气氛围下加热到120℃，搅拌反应24h，反应完成后，旋蒸除去溶剂并用20ml二氯甲烷重新溶解，用10ml甲醇和氯化钠的混合溶液(甲醇和氯化钠溶液的体积比为1：1)洗涤，旋蒸除去溶剂得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺粗产物。粗产物用柱层析纯化，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，洗脱程序为50：1，30：1，20：1，10：1，最终得到0.396mg蜡状产物(产率：40％)。
实施例3酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料(DSPE-ASlink-PEG)的制备
以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酸为原料，加入草酰氯，制得2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯；以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯为原料，与PEG2K-OH进行酯化反应，制得PEG2K-CDM。具体制备方法参见：冯兵，基于奥沙利铂前药的纳米载药系统增强肿瘤化疗—免疫治疗效果的研究[D].中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)，2019。
将DSPE(0.374g，0.5mmol)与PEG2K-CDM(1g，0.5mmol)在10ml氯仿中混合后，加入0.07ml三乙胺，45℃下加热搅拌24h，反应完成后，反应液通过真空干燥得到浓缩液，然后滴入40ml冷乙醚中，继续用20ml冷乙醚洗涤两次得0.9g目标产物(产率：66％)。核磁图谱见图3。如核磁共振氢谱所示，δ0.87为DSPE上甲基信号峰，δ3.4为PEG2K-CDM上甲基信号峰，δ8.18处出现酰胺氮上的活泼氢信号峰，δ12处出现破环后羧基的活泼氢信号峰，以上信号峰证明DSPE-ASlink-PEG2K的成功合成。
实施例4DSPE-ASlink-PEG的制备
将DSPE(0.374g，0.5mmol)与PEG2K-CDM(0.5g，0.25mmol)10ml在氯仿中混合后，加入0.035ml三乙胺，50℃下加热搅拌18h，反应完成后，反应液通过真空干燥得到浓缩液，然后滴入40ml冷乙醚中，继续用20ml冷乙醚洗涤两次得0.43mg目标产物(产率：63％)。
实施例5载药纳米脂质体T780@ASDOBG的制备
分别将13mg DOBG(N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺)，4mg胆固醇，2mg DSPE-ASlink-PEG2k，1mg T780溶于5ml氯仿中，超声混合均匀，在40℃下旋转蒸发得到脂质薄膜，超声水化薄膜得到粗脂质体溶液。粗脂质体溶液过0.22μm滤膜得最终脂质体溶液。图4为T780@ASDOBG的粒径分布图。DLS检测粒径为140nm，粒径分布0.136。
T780自制，具体制备方法参见：张静，线粒体靶向的光-化疗纳米粒用于增强乳腺癌的免疫治疗研究[D].山东大学，2020。
实施例6p-AMPK，HIF-α，PD-L1蛋白表达水平检测
(1)细胞的培养
以4T1细胞为研究对象，取冻存细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)，用RPMI1640培养基(美国Gibco公司)于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞长至高密度时传代。
(2)p-AMPK，HIF-α，PD-L1表达水平检测
用0.05％胰蛋白酶(美国Gibco公司)消化对数生长期的4T1细胞并用新鲜培养基配制为单细胞悬液，细胞计数后以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜后，弃去孔内培养基，加入用新鲜培养基稀释的二甲双胍(给药浓度26μM)，T780@AIDOBG脂质体(有效成分DOBG浓度为26μM)，T780@ASDOBG脂质体(有效成分DOBG浓度为26μM)溶液。孵育完成后，加入100μl裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解，收集各组样品，4℃下12000rpm离心20分钟，收集上清液。利用BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测各组别蛋白浓度并调整使其保持一致，向各组样品中加入一定量(样品溶液与上样缓冲液体积比为4：1)的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)，100℃加热煮沸5分钟，使蛋白充分变性后，依次进行电泳，转膜，封闭，一抗孵育(HIF-1αRabbit mAb购自美国Cell Signaling Technology公司，Phospho-AMPKα(Thr172)Rabbit mAb购自美国Cell Signaling Technology公司，PD-L1 Rabbit pAb购自Proteintech公司，β-Actin Rabbit mAb购自上海碧云天生物技术有限公司)，二抗孵育(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海碧云天生物技术有限公司)，通过ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)对蛋白进行染色，通过凝胶成像系统检测各蛋白条带。
图5为western blotting检测不同药物处理后，细胞内上调的p-AMPK蛋白表达水平，细胞内下调的HIF-1α蛋白表达水平和PD-L1蛋白表达水平。给药组p-AMPK蛋白表达水平均高于空白组(磷酸盐缓冲液PBS)，且给药组PD-L1蛋白表达水平均低于空白组，说明DOBG可通过激活AMPK影响PD-L1蛋白的糖聚化进而降低PD-L1的表达水平。给药组HIF-α蛋白表达水平均低于空白组，说明DOBG可抑制线粒体氧化呼吸链复合物I进而抑制氧气消耗，缓解肿瘤缺氧，降低HIF-α的表达。
作为对照，本发明合成了在肿瘤组织不能降解脱去PEG的纳米粒子，表述为T780@AIDOBG，T780@AIDOBG的制备方法与T780@ASDOBG的制备方法完全相同，只需将DSPE-ASlink-PEG2K替换成等摩尔数的DSPE-AIlink-PEG2K即可得到T780@AIDOBG。
DSPE-AIlink-PEG2K的制备方法为：将DSPE(0.374g，0.5mmol)，PEG2K-COOH(1g，0.5mmol，购自重庆渝偲医药科技有限公司)，EDCI(0.115g，0.6mmol)，HOBT(0.081g，0.6mmol)溶解到10ml氯仿中，45℃下加热搅拌24h，然后将溶液浓缩并滴入到40ml冷乙醚中，并用20ml冷乙醚洗涤两次，得887mg DSPE-AIlink-PEG2K(产率：65％)。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (10)
1.一种结构式如下的酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料：
2.权利要求1所述的一种酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料的制备方法，其特征在于，由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE与PEG2K-CDM通过酰化反应得到所述酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料DSPE-ASlink-PEG2k。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PEG2K-CDM由以下方法制得：以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酸为原料，加入草酰氯，制得2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯；以2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧代-3-呋喃丙酰氯为原料，与PEG2K-OH进行酯化反应，制得PEG2K-CDM。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PEG2K-CDM与DSPE混合后，加入三乙胺，加热搅拌反应，即得DSPE-ASlink-PEG2k；所述PEG2K-CDM与DSPE的摩尔比为1：1～2。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂为氯仿；反应的温度为45～50℃；反应时间为16～24h。
6.权利要求1所述的一种酰胺键连接的聚乙二醇-磷脂成脂材料在制备具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体中的应用。
7.一种具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体由以下方法制得：N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺与胆固醇形成阳离子脂质体，插入DSPE-ASlink-PEG2K，制备成血液循环相对稳定的纳米脂质体。
8.根据权利要求7所述的一种具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体粒径为100～250nm。
9.一种权利要求7或8所述的具有缓解肿瘤缺氧作用的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺DOBG、胆固醇和DSPE-ASlink-PEG2K按照质量比为10～40：4：2～5，混合均匀，蒸馏得到脂质薄膜，超声水化薄膜得到粗脂质体溶液；粗脂质体溶液过膜得最终纳米脂质体溶液；
所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺为一种双胍类阳离子脂质材料，其结构式如下：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺由以下方法制得：N-叔丁氧羰基-N,N-(2-羟乙基)乙二胺与油酰氯通过酯化反应得到Boc保护的N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺，再通过脱Boc得到N,N-二油酰羟乙基-2-胺基乙基胺，最后通过亲核加成反应得到N,N-二油酰羟乙基-2-双胍基乙基胺。
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