CN115974968A - 一种特异性结合人类免疫缺陷病毒p24蛋白的荧光素标记多肽、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒快速检验领域，具体公开了一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽、试剂盒及其应用。所述荧光素标记多肽的多肽序列如SEQ ID NO：2＝AQSYNYPA或者SEQ ID NO：3＝VSGISAM所示；所述试剂盒包括荧光显色试剂和背底消除液，本发明所述的试剂盒中试剂种类数量少，操作简便，采用多肽代替抗体进行产品设计；分子较小穿透力强，不需对细胞进行通透处理即可进入细胞；故不需要进行细胞固定、通透、孵育、洗脱等冗长的操作时间，具有检测时间段的优势，同时操作和结果判断直观，对检验人员要求较低。

Description

一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病毒快速检验领域，具体公开了一种特异性结合人类免疫缺陷病毒(HIV)P24蛋白的荧光素标记多肽、试剂盒及其应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒又称艾滋病病毒，艾滋病(AcquiredImmune DeficiencySyndrome，AIDS)是人类免疫缺陷病毒感染的最后阶段。进入艾滋病期，艾滋病病毒感染会引起各种机会性感染和肿瘤的发生，这些并发症会对人的健康生活带来影响，甚至可能会威胁生命，因此艾滋病病毒会引发人们的恐慌情绪。

艾滋病病毒的基因组是两条相同的正链RNA，全长约9.7千碱基对(kb)，包裹在一个病毒蛋白壳内，核衣壳外周是来源于宿主细胞膜的磷酸脂质双层，也包括病毒编码的膜蛋白，艾滋病病毒基因组两端长末端重复序列发挥着调节病毒基因整合、表达和病毒复制的作用。基因组含有3个结构基因gag、pol和env，2个调节基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节因子)，4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒蛋白r、vpu病毒蛋白和vif病毒感染因子)。其中gag基因序列编码核壳蛋白；env基因序列编码病毒感染细胞所必需的两种糖蛋白，即包膜糖蛋白gp120和gp41；pol基因序列编码病毒复制所必需的酶，即逆转录酶、结合酶和病毒蛋白酶。我国人类免疫缺陷病毒的主要流行株为HIV-1，目前已发现10种亚型，流行的主要亚型是AE重组型和BC重组型。

1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的gag基因编码一种称为Pr55Gag的前体蛋白。病毒蛋白酶PR切割此前体产生p17、p24、p7和p6蛋白质，这些蛋白质是病毒颗粒组装所必需的。p24是一种主要的病毒核心结构蛋白，HIV包膜蛋白、gpl20、gp41或它们的前体蛋白gpl60拥有最大程度的基因变异，然而HIV-1P24抗原在不同的HIV类型中是最保守的蛋白质。因此，检测HIV-1P24可以更广泛地进行HIV基因型的检测。它的检测通常被用作HIV-1感染和病毒载量的指标。由于HIV抗体的检测存在一个窗口期(平均为2个月)，因此对尚未产生抗体的早期感染者往往造成漏检。而在HIV-1病毒感染早期，病毒在人体内复制时会产生p24蛋白。通过检测血液中p24蛋白，可达到早期诊断的目的，以便更加有效地控制HIV的传播。P24抗原的检测也可以用来监测疾病进程和评价抗反转录病毒药物的治疗效果。

目前检测HIV的主要检测方法有酶联免疫检测、化学发光法检测、免疫复合物裂解检测等。如CN202110829124.0抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗原(HIV-1P24)兔单克隆抗体及其应用，CN202111542020.8公布了一种快速检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒及其应用，CN200910272336.2公开了一种艾滋病毒P24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用，但上述的试剂盒均需要使用完整的P24单抗，不仅制备成本高和保存要求高，试剂盒的组成复杂，需要多种缓冲液和标准品，对照品，检测时间久，对使用者的操作和判读能力要求高，并且不够直观，敏感性差、假阳性或假阴性高等问题，从而影响检出率，不利于患者早期诊断与治疗、同时，上述试剂盒并不能检测活细胞的绝对感染率，对于分析HIV病毒的感染活跃程度无法判断，进一步的限制了上述试剂盒在涉及细胞感染率的科研方面的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开了一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽、试剂盒及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽，所述荧光素标记多肽的多肽序列如SEQ ID NO：2＝AQSYNYPA或者SEQ ID NO：3＝VSGISAM所示。

进一步的，上述一种特异性结合人类免疫缺陷病毒HIV-1的P24蛋白的荧光素标记多肽，所述荧光素标记多肽由以下步骤制备获得：

1)将人类免疫缺陷病毒P24蛋白基因克隆表达，获得基因工程蛋白；

2)将所述的基因工程蛋白进行实验小鼠免疫和杂交瘤细胞融合实验制备单克隆抗体；

3)采用HIV阳性血液进行实验验证，确定上述单克隆抗体的特异性和灵敏度，筛选出特异性和灵敏度较高的单克隆抗体细胞株；

4)对单克隆抗体细胞株进行基因测序，获得抗体全基因序列，生物信息学分析获得其高变区多肽序列，人工合成多肽；

5)对上述多肽进行荧光素标记。

一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，所述试剂盒中含有上述荧光素标记多肽中的任一种或者两种。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，所述试剂盒由荧光显色试剂和背底消除液组成，所述荧光素标记多肽溶解于所述荧光显色试剂中。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，包括以下制备步骤：

1)将多肽进行修饰和荧光素标记，获得荧光素标记多肽；

2)将荧光素标记多肽配制成高浓度保存液；

3)将荧光素标记多肽配制成工作液；

4)将上述工作液装入到棕色避光瓶中，标记为荧光显色试剂；

5)将含有伊文思兰的PBS缓冲液装入到滴瓶中，标记为背底消除液；

6)将荧光显色试剂和背底消除液装入到试剂盒中，即为一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，所述荧光显色试剂内含2.0mg/ml的荧光素标记多肽、PBS缓冲液、0.05％DMSO、10％已腈。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，

所述荧光显色试剂由以下步骤配置：

S1母液配置：将荧光素标记多肽按照25mg/ml溶解在30％已腈的水溶液中，作为母液；

S2缓冲体系配制：包括PBS缓冲液、5mg/ml的BSA、0.05％DMSO、8％已腈；

S3工作液配置：母液和缓冲体系按照1：11.5比例进行配制成工作液；

S4荧光显色试剂制备：将工作液取1.05ml,装入到2ml的棕色避光瓶中，盖上带密封圈的瓶盖，标记为荧光显色试剂。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，所述背底消除液内含PBS缓冲液和2.0mg/ml伊文思兰。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒在涉及计算活细胞HIV病毒感染率的科学研究方面的应用(非医学诊断和检测领域)，

包括以下步骤：

a.将待检样本10微升滴加在准备好的玻片上，滴加5微升的荧光显色试剂和5微升背底消除液并混匀。

b.荧光显微镜观察和计数；

c.确定阴/阳性结果及细胞感染率。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒在非医学治疗或者诊断领域的应用，

所述步骤b的结果是指：在荧光显微镜下，HIV感染的血液细胞因为细胞内的HIV富集了试剂中的荧光素标记多肽而发亮色，未受HIV感染的细胞为背景色或者黑色。

本发明具有如下有益效果:

1)本采用特异性荧光试剂进行HIV感染细胞的荧光显色，在荧光显微镜下，HIV感染的血液细胞因为细胞内的HIV富集了试剂中的荧光素标记多肽而发亮色，未受HIV感染的细胞为背景色或者黑色；操作和结果判断直观，对检验人员要求较低。

2)本发明采用多肽代替抗体进行产品设计；就分子量而言，多肽分子的分子量约为抗体的1-2％，分子较小穿透力强，不需对细胞进行通透处理即可进入细胞；故不需要进行细胞固定、通透、孵育、洗脱等冗长的操作时间，具有检测时间短的优势。

3)利用HIV特异性荧光素标记多肽进行HIV感染细胞的检测。可实现一步法操作，过程简单快速。即把荧光显色试剂和待检血在玻片上混合，即可放置在荧光显微镜下进行观测。

4)通过对总细胞量和感染细胞的量的比较，获得细胞感染率的绝对计数。血细胞的绝对计数。

5)本发明具有高灵敏度和高特异性的特点。

在其中样本评估中，针对52份抗凝全血样本(其中含20份阳性HIV感染者临床治愈时采集的样本，32份临床其他检查随机获得的抗凝全血)的性能研究中，采用荧光PCR+测序作为对照技术。结果如下：

采用其中的7份阳性样本和1份阴性样本进行胶体金抗原和抗体实验，结果显示抗原未检出，抗体检出3份。

小样本研究说明本方法同PCR+测序技术相比较，具有基本相当的敏感性和特异性，且其性能远高于胶体金检测技术。

6)本发明具有高稳定性的特点

放置于室温45天期间内适用，对于HIV阳性感染的细胞染色的效果并无明显变化。

附图说明

附图1一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒的盒装示意图；

附图2一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒的使用步骤示意图；

附图3 HIV感染细胞阳性的结果示意图；

附图4 HIV感染细胞阴性的结果示意图；

附图5细胞计数仪细胞计数和获得细胞感染率。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

抗体制备

抗原为重组HIV1 p24蛋白购自abcam(货号ab43037),

小鼠免疫：抗原加福氏完全佐剂皮下多点注射免疫10只BALB/C小鼠，分别在二周和四周后用抗原加福氏不完全佐剂进行两次加强免疫。7天后，毛细管眼眶采血，分离血清，用ELISA间接法测其效价，取效价高者做融合用。

杂交瘤制备和筛选依据教科书《抗体制备与使用实验指南进行》，取脾前三天加强免疫，三天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏并研碎过无菌不锈钢筛网。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的数量比例混合，用40％PEG 4000(质量体积比，下同)介导融合，逐步加入不完全培养液稀释PEG，消除PEG的作用来终止融合。将融合细胞加到已有饲养细胞层的培养板培养，细胞培养至覆盖10～20％孔底面积时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆。

杂交瘤克隆化采用有限稀释法，选取阳性杂交瘤克隆转接于24孔板扩大培养，并做再次克隆化筛选，连续两次克隆率达到100％后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养。

单抗制备：选用BALB/c小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将获得的杂交瘤克隆腹腔注射(1×10⁶个杂交瘤细胞)接种到小鼠体内，制备腹水或血清，7～10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。

单抗纯化：采用SPA-Sepharose CL-4B(购自pharmacia-sigma公司)亲合层析纯化，上柱前用1mol/LpH9.0Tris液调整样本液pH值至8.1或对平衡液透析过夜，样品上柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，用不同pH(0.1mol/lpH＝4.0～6.0)的枸橼酸洗脱液洗脱，收集洗脱液测OD值，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

单抗的Ig类与亚类的鉴定：最经常得到的单抗是IgM和IgG，采用免疫扩散法鉴定单抗Ig类和亚类，检测标准采用小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。本发明所得单抗被鉴定为IgG2a亚类。

实施例2

多肽的设计

对获得的抗体进行效价测定(筛选过程参见《抗体制备与使用实验指南进行》)，具体的用RETRO-TEK HIV-1p24 Antigen ELISA检测试剂盒中的p24标准抗原作为检测抗原时，2A13B抗体检测灵敏度最高，能检测到10pg/ml的HIV-1 p24，最终选取2A13B抗体为最佳抗体。

对抗体进行测序分析，得到其单链序列为SEQ ID NO：1，使用生物信息学分析其高变区序列，合成多条多肽进行亲和实验筛选，最终选择2段多肽，SEQ ID NO：2＝AQSYNYPA或者SEQ ID NO：3＝VSGISAM，其分别能检测低至14pg/ml和21pg/ml的HIV-1 p24蛋白抗原。

实施例3

试剂盒的制备

(1)人工合成上述多肽，并按照常规方法在N端进行荧光素FITC修饰，获得本试剂盒中的荧光素标记多肽。

2)将荧光素标记多肽配制成高浓度保存液；

3)将荧光素标记多肽配制成工作液；

4)将上述工作液装入到棕色避光瓶中，标记为荧光显色试剂；

5)将含有伊文思兰的PBS缓冲液装入到滴瓶中，标记为背底消除液；

6)将荧光显色试剂和背底消除液装入到试剂盒中，即为一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒。

所述荧光显色试剂由以下步骤配置：

S1母液配置：将荧光素标记多肽按照25mg/ml溶解在30％已腈的水溶液中，作为母液；

S2缓冲体系配制：包括PBS缓冲液、5mg/ml的BSA、0.05％DMSO、8％已腈；

S3工作液配置：母液和缓冲体系按照1：11.5比例进行配制成工作液；

S4荧光显色试剂制备：将工作液取1.05ml,装入到2ml的棕色避光瓶中，盖上带密封圈的瓶盖，标记为荧光显色试剂。

进一步的，上述一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，所述背底消除液内含PBS缓冲液和2.0mg/ml伊文思兰。

实施例4

检测例

参照附图1，取出荧光显色试剂，轻甩试剂瓶，使瓶内液体到底部。

参照附图2，取抗凝血样本或者指尖血样本10μL放置于1.5ml的EP管中，加入10μL荧光显色液并混匀，约3min后滴入4滴缓冲液，点动离心30s离心后弃上清。

参照附图2，用背景消除液悬浮细胞后将细胞悬浮液加到玻片中，并盖上盖玻片。

参照附图2，进行荧光显微观察，所述显微镜型号为浩康HL2000观测

参照附图3和4，出现荧光信号的血细胞图像，表明为HIV阳性，计数总细胞数和阳性细胞数并推算细胞感染率；未出现荧光信号细胞图像，表明为HIV阴性。

实施例5

检测例

参照附图1，取出荧光显色试剂，轻甩试剂瓶，使瓶内液体到底部。

参照附图2，取抗凝血样本或者指尖血样本10μL放置于1.5ml的EP管中，加入10μL荧光显色液并混匀，约3min后滴入4滴缓冲液，点动离心30s离心后弃上清。

参照附图2，用背景消除液悬浮细胞后将细胞悬浮液加到细胞计数片中。

参照附图5，进行荧光细胞计数仪进行细胞读数，并计算细胞感染率。

根据以上实施例可知，本发明采用特异性荧光试剂进行HIV感染细胞的荧光显色，在荧光显微镜下，HIV感染的血液细胞因为细胞内的HIV富集了试剂中的荧光素标记多肽而发亮色，未受HIV感染的细胞为背景色或者黑色；操作和结果判断直观，对检验人员要求较低。并且，就分子量而言，多肽分子的分子量约为抗体的1-2％，分子较小穿透力强，不需对细胞进行通透处理即可进入细胞；故不需要进行细胞固定、通透、孵育、洗脱等冗长的操作时间，具有检测时间段的优势；进一步的，利用HIV特异性荧光素标记多肽进行HIV感染细胞的检测。可实现一步法操作，过程简单快速。即把荧光显色试剂和待检血在玻片上混合，即可放置在荧光显微镜下进行观测；通过对总细胞量和感染细胞的量的比较，获得细胞感染率的绝对计数。血细胞的绝对计数。

以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽，其特征在于，所述荧光素标记多肽的多肽序列如SEQ ID NO：2＝AQSYNYPA或者SEQ ID NO：3＝VSGISAM所示。

2.根据权利要求1所述的一种特异性结合人类免疫缺陷病毒P24蛋白的荧光素标记多肽，其特征在于，所述荧光素标记多肽由以下步骤制备获得：

1)将人类免疫缺陷病毒HIV-1中的P24蛋白基因克隆表达，获得基因工程蛋白；

2)将所述的基因工程蛋白进行实验小鼠免疫和杂交瘤细胞融合实验制备单克隆抗体；

3)采用HIV阳性血液进行实验验证，确定上述单克隆抗体的特异性和灵敏度，筛选出特异性和灵敏度较高的单克隆抗体细胞株；

4)对单克隆抗体细胞株进行基因测序，获得抗体全基因序列，生物信息学分析获得其高变区多肽序列，人工合成多肽；

5)对上述多肽进行荧光素标记。

3.一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求2所述的荧光素标记多肽中的任一种或者两种。

4.根据权利要求3所述的人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由荧光显色试剂和背底消除液组成，所述荧光素标记多肽溶解于所述荧光显色试剂中。

5.根据权利要求4所述的人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，

包括以下制备步骤：

1)将多肽进行修饰和荧光素标记，获得荧光素标记多肽；

2)将荧光素标记多肽配制成高浓度保存液；

3)将荧光素标记多肽配制成工作液；

4)将上述工作液装入到棕色避光瓶中，标记为荧光显色试剂；

5)将含有伊文思兰的PBS缓冲液装入到滴瓶中，标记为背底消除液；

6)将荧光显色试剂和背底消除液装入到试剂盒中，即为一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，所述荧光显色试剂内含2.0mg/ml的荧光素标记多肽、PBS缓冲液、0.05％DMSO、10％已腈。

7.根据权利要求6所述的一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，所述荧光显色试剂由以下步骤配置：

S1母液配置：将荧光素标记多肽按照25mg/ml溶解在30％已腈的水溶液中，作为母液；

S2缓冲体系配制：包括PBS缓冲液、5mg/ml的BSA、0.05％DMSO、8％已腈；

S3工作液配置：母液和缓冲体系按照1：11.5比例进行配制成工作液；

S4荧光显色试剂制备：将工作液取1.05ml，装入到2ml的棕色避光瓶中，盖上带密封圈的瓶盖，标记为荧光显色试剂。

8.根据权利要求5所述的一种人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒，其特征在于，所述背底消除液内含PBS缓冲液和2.0mg/ml伊文思兰。

9.如权利要求4-8任一项所述的人类免疫缺陷病毒感染细胞的荧光显色检测试剂盒在涉及计算活细胞HIV病毒感染率的科学研究方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a.将待检样本10微升滴加在准备好的玻片上，滴加5微升的荧光显色试剂和5微升背底消除液并混匀；

b.荧光显微镜观察和计数；

c.确定阴/阳性结果及细胞感染率。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤b的结果是指：在荧光显微镜下，HIV感染的血液细胞因为细胞内的HIV富集了试剂中的荧光素标记多肽而发亮色，未受HIV感染的细胞为背景色或者黑色。

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