CN115955970A - 使用Pelorol衍生物治疗SHIP1介导的疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了式I的化合物及其可药用盐、溶剂化物和/或衍生物。此外，本公开还提供了治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1激活治疗的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括施用式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物或衍生物。所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物或衍生物可用于治疗SHIP1介导的疾病、障碍或病症，包括炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性骨髓瘤、肝损伤、急性肝炎和重症脓毒症。

Description

使用Pelorol衍生物治疗SHIP1介导的疾病的方法

技术领域

本公开涉及化合物及其在治疗SHIP1介导的疾病、障碍或病症例如炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性骨髓瘤、肝损伤、急性肝炎和重症脓毒症中的用途。

背景技术

含Src同源2结构域的肌醇5′-磷酸酶1(SHIP1)和SHIP2两者都是在哺乳动物细胞中重要的磷酸酶，它们控制包括PI3K/Akt通路在内的各种不同细胞信号传导通路和白介素-10(IL-10)的产生。这些细胞信号传导通路参与由SHIP1介导的大量疾病和病症。

多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的血液系统恶性肿瘤(Naymagon 2016)，其是一种浆细胞赘生物，特征是骨髓(BM)中恶性B细胞和相关单克隆免疫球蛋白的增加(Kuehl2002)。尽管目前存在包括高剂量化疗和干细胞移植在内的治疗选项，但绝大多数患者经历疾病复发，这由于耐药性的发展仍然是无法治愈的(Naymagon 2016，Abramson 2018，Harding 2019)。

MM细胞与BM微环境之间的细胞-细胞和细胞因子介导的相互作用，通过激活包括Ras/Raf/Erk、Jak2/STAT3和PI3K/Akt通路在内的许多信号传导级联来支持增殖、存活和耐药性(在Harding 2019中综述)，因此存在治疗性干预的大量潜在靶点。通过PI3K/Akt级联的信号传导对于赘生性浆细胞克隆的存活和扩增以及耐药性的发展是重要的(Hu 2018,Zhu 2015,Hideshima 2001,Qiang 2002,Tu 2000,Hsu 2001,Mitsiades 2002)。PI3K的激活导致质膜中磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP₃)的产生，导致Akt和其他含有普列克底物蛋白同源(PH)结构域的蛋白质的膜募集和激活(Zhu2015)。在MM中，丝氨酸/苏氨酸激酶Akt及其下游效应物的磷酸化水平与疾病的进展相关(Hsu 2001，Alkan 2002)，并且已显示Akt和下游哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)的抑制剂在体外和体内诱导凋亡(Hideshima 2006，Frost 2004，Hideshima 2007)。因此，抑制PI3K/Akt信号传导是用于MM治疗的一种有希望的方法。

正常条件下，通过调控生成PIP₃的PI3K和水解PIP₃的肌醇脂磷酸酶两者的活性，细胞PIP₃水平受到严格控制。存在两种主要的降解PIP₃的磷酸酶：产生PI-4,5-P₂的3′-磷酸酶PTEN和产生PI-3,4-P₂的5′-磷酸酶SHIP1和SHIP2(Vivanco 2002)。PTEN和SHIP2在所有细胞中表达，而SHIP1仅在造血细胞中表达。PTEN是一种已知的肿瘤抑制物(Steck 1997，Li1997)，并且PTEN缺陷的MM细胞具有更高的Akt磷酸化并且对Akt抑制引起的灭杀更加敏感(Ge 2000，Shi 2002，Zhang 2003)。另一方面，SHIP1是B细胞中PI3K信号传导的重要调控物(Aman 1998，Liu 1999，Helgason2000)，并且在血液恶性肿瘤中已观察到其活性或表达的降低(Luo 2004，Fukuda 2005，Vanderwinden 2006，Liang 2006)。目前正在开发以逆转PI3K/Akt信号传导的升高的药剂包括靶向PI3K、Akt或mTOR的激酶抑制剂(Naymagon 2016，Abramson 2018，Harding 2019，Hu 2003，Zhu 2014)。SHIP1的激活提供了一种可以单独使用或补充现有疗法的独特方法(Li 2011，Meimetis 2012，Ong 2007)。体外研究显示，Pelorol家族的化合物通过与SHIP1磷酸酶内的别构激活结构域结合选择性地激活所述酶的活性(Ong 2007)。这些化合物在体外在MM内(但不在非造血癌细胞内)抑制PI3K/Akt信号传导，并且这与MM细胞的增殖减少和凋亡增加有关(Kennah 2009)。

炎性肠病(IBD)是另一个SHIP1对疾病发病机制有贡献的实例。许多因素对IBD的发展有贡献，但基因组广度的关联研究(Verstockt 2018)和临床数据(Engelhardt 2014，Glocker 2009，Glocker 2011，Louis 2009)显示细胞因子白介素-10(IL10)的抗炎作用(Ouyang 2011)是维持适当免疫稳态的关键。在其不存在的情况下，炎性刺激性通路持续不减，导致不适当的炎症。IL10缺陷的小鼠会患与人类IBD相似的结肠炎(Kuhn1993，Shouval2014)。在人类中，IL10基因中的多态性与溃疡性结肠炎有关，并且纯合的IL10受体亚基的功能丧失突变导致早发性结肠炎(Engelhardt 2014，Glocker2009，Glocker 2011)。

研究显示IL10需要激活SHIP1才能诱导炎症(Chan 2012，Cheung 2013)。SHIP1是一种主要在造血细胞中表达的胞质蛋白(Fernandes 2013，Huber 1999，Krystal 2000)。对细胞外信号做出响应，SHIP1可以被募集到细胞膜，其作用之一是通过将PI3K产物PIP₃去磷酸化成PI-3,4-P₂(Fernandes 2013，Huber 1999，Krystal 2000，Pauls 2017)而关闭磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号传导(Brown 2010)。SHIP1还可以充当信号传导复合体组装的对接蛋白(Pauls 2017)。已显示，SHIP1是一种别构调节酶，其天然激动剂是其产物PI-3,4-P₂(Ong 2007)。Pelorol家族的化合物能够结合SHIP1的别构结构域以激活SHIP1(Ong 2007)。体外结果表明，Pelorol家族的化合物以与IL-10类似的方式表现出抗炎作用(Chan 2012，Cheung 2013，Ong 2007)。

激活抗炎通路例如IL-10在其他情况下可能有用。炎性反应增强的一个实例是脓毒症。脓毒症是一种复杂的全身性疾病，其中对细菌或病毒感染的失调的炎症反应导致多器官功能障碍综合征(MODS)。全世界的发病数据估计为每年3100万例。重症脓毒症占住院患者的2％，并占所有重症监护室入住者的10％。重症脓毒症同等地攻击年轻人和老年人，估计的死亡率为38％至45％。在过去的几十年中，超过100项用于重症脓毒症的药物的临床试验均已失败，强调了治疗这种疾病的复杂性和困难性，并且当前用于这种严重的综合征的疗法主要是支持性的(Marshall 2014)。目前大流行的COVID-19是病毒脓毒症的一种类型。COVID-19患者的死亡主要由急性呼吸窘迫综合征(ARDS)造成。ARDS由宿主对病毒或细菌感染的免疫应答失调引起，这是重症脓毒症的标志。宿主的过度应答引起“细胞因子风暴”(Liu 2016)，导致全身毛细血管渗漏、严重的肺水肿、ARDS和患者死亡。

炎症也常见于各种不同的肝脏疾病例如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和肝同种异体抑制排斥，它们与T细胞的活化和浸润、肝脏中促炎性细胞因子的产生有关，导致肝损伤(Louis 2003，Asdullah 2003，Czaja 2021)。

因此，SHIP1为开发靶向治疗炎性疾病和肿瘤的疗法提供了一个可行的靶点，市场上急需开发用于治疗此类疾病的小分子SHIP1激动剂。

发明内容

目前已显示，本公开的化合物在体外和体内均可激活SHIP1，并且可用于治疗下文描述的SHIP1介导的病症。此外，已显示本公开的化合物可以在LPS诱导的细胞中降低肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平，并在结肠炎小鼠模型中降低促炎性细胞因子的水平。此外，已显示在带有MM肿瘤的动物中，本公开的化合物在体内减小肿瘤块。此外，目前已显示在IBD的小鼠IL-10敲除模型中，本公开的化合物在体内抑制炎症。此外，已显示本公开的化合物在小鼠中保护由伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝损伤。此外，在盲肠结扎和穿刺(CLP)模型中，使用本申请的化合物治疗脓毒症小鼠能提高存活率。

由于SHIP1激活可刺激抗炎性IL-10信号传导通路，因此SHIP1的激活可用于抑制通过IL10通路调控的炎性细胞因子产生，用于治疗不同的炎性疾病或病症。实例包括在脓毒症中观察到的炎性细胞因子风暴和各种不同肝损伤中细胞因子的过度产生。

因此，本公开包括一种式I的化合物

或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，

其中R¹选自H、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基、N琥珀酰亚胺和NHC(O)C_1-3烷基；

其中R²、R³、R⁴和R⁵独立地选自H、OH、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基；或者R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵与它们附连到的原子合在一起形成包含至少一个NH和任选的选自N、O和S的一个或多个额外的杂原子的取代或未取代的5或6元杂环；并且

其中当R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵合在一起形成所述取代或未取代的5或6元杂环时，R⁴和R⁵、R²和R⁵或R²和R³分别独立地选自H和C_1-3烷基。

另一方面，本公开包括一种治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

另一方面，本公开包括本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，用于治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症。

另一方面，本公开包括一种或多种本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物用于治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的用途。

另一方面，本公开包括一种或多种本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物在制备由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的药物中的用途。

附图说明

现在将参考附图更详细地描述本公开的实施方式，在附图中：

图1示出了腹腔内注射1h所指示浓度的LPS、LPS+IL10(图A)或LPS+化合物I-1(ZPR-100或ZPR-MN100或MN-100)(图B)的SHIP1^+/+或SHIP1^-/-小鼠的血清TNFα水平。数据代表n≥4的平均值。当与仅LPS刺激的小鼠相比时，*p<0.05，**p<0.01，ns＝不显著。图C示出了在连续流动装置中，将STAT3^+/+、STAT^-/-、SHIP1^+/+和SHIP1^-/-骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)在180min的过程中用LPS(虚线)或LPS+IL10(实线)刺激。每5min收集级分用于测量TNFα水平。数据代表了两个独立实验。

图2示出了IL-10诱导SHIP1和STAT3的物理联合。在图A中，在LPS刺激的TNFα生产测定法中，测试了表达His₆-SHIP1或His₆-SHIP1 3PT的J17 SHIP1^-/-细胞被IL10抑制的能力。在图B中，将J17 His₆-SHIP1细胞用IL6、IL10或化合物I-2刺激5分钟。使用镍珠将His₆-SHIP1拉下，并与细胞裂解液一起用SHIP1、STAT3和磷酸化-STAT3抗体探测。(图C)对表达FRET成对融合构建体Clover-SHIP1和mRuby2-STAT3的J17 SHIP1^-/-细胞进行的单细胞FRET分析，所述细胞经“模拟”刺激或用IL6、IL10、化合物I-2刺激1分钟。FRET效率使用受体光漂白法确定。数据代表来自于每种处理的至少三个独立实验的单细胞FRET效率的％(单向ANOVA和Tukey’s校正，****p<0.0001)。

图3示出了SHIP1 Y190参与SHIP1和STAT3复合物的形成。(A)通过ELISA确定的经1ng/ml LPS+IL10刺激的SHIP1 KO细胞的TNFα产生，从其计算IL10的IC50值(单向ANOVA和邓氏(Dunnett’s)校正，****p<0.0001)，其中SHIP1 KO细胞用WT或突变体SHIP1或载体(无)重构。(B)将表达WT或Y190F SHIP1的细胞用IL10或化合物I-2刺激5分钟。使用镍珠将His₆-SHIP1拉下，并与细胞裂解液一起用SHIP1、STAT3和磷酸化-STAT3和肌动蛋白抗体探测。(C)对用His₆-SHIP1(WT或Y190F)拉下的STAT3蛋白的量进行定量(双向ANOVA和Sidak’s校正，**p<0.01，*p<0.05)。

图4示出了IL10诱导SHIP1和STAT3的核移位。(A)将SHIP1+/+和STAT3+/+perimacs用IL10或化合物I-2刺激2或20分钟，并且如指示的用CD11b、SHIP1和STAT3抗体以及DAPI染色。(B)计算皮尔逊系数以显示SHIP1或STAT3与膜标志物CD11b或DNA标志物DAPI的重叠程度。数据代表每种细胞类型中来自于至少两个独立实验的细胞的单个视野的皮尔逊系数(双向ANOVA和Sidak’s校正，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)。

图5示出了PPAC、PAC1和PAC2具有与全长SHIP1相近的酶活性。(A)不同SHIP1截短构建体的示意图。PPAC由PH-R结构域、磷酸酶和C2结构域(aa 293-877残基)组成。PAC1和PAC2由磷酸酶和C2结构域(分别为aa 402-861和aa 402-857残基)组成。PAC1-cc和PAC2-cc在C2结构域中含有表面熵降低突变(E770A、E772A、E773A)。这组残基使用SERp服务器鉴定(http://services.mbi.ucla.edu/SER/intro.php)。(B)在指示的IP4浓度下确定酶催化的起始速度。使用GraphPad软件计算Kcat和Km值。(C)化合物I-1刺激全长SHIP1、PPAC和PAC的磷酸酶活性的能力(双向ANOVA和Tukey校正用于多重比较，**p<0.01，****p<0.0001)。

图6示出了PAC2野生型和突变体蛋白对化合物I-2和PI(3,4)P₂的响应，以及表达野生型或突变体SHIP1或不表达SHIP1的细胞的TNFα水平。(A)暴露于20μM化合物I-2或PI(3,4)P₂的装载有PAC2 WT和K681A的传感器的生物层干涉分析(BLI)数据。WT PAC2与K681A相比(未配对Student’s t-检验)，****p<0.0001。(B)通过ELISA确定经10ng/ml LPS+IL10刺激的用WT或K681A SHIP1或无(SHIP1 KO)重构的细胞的TNFα生产，从其计算IL10的IC50值。当与用WT SHIP1重构的细胞相比时(未配对Student’s t-检验)，****p<0.0001。

图7示出了与化合物I-2和PI(3,4)P₂相比，AQX-1125/Rosiptor与PAC2的结合弱。(A)化合物I-1及其衍生化合物I-2和AQX-1125/Rosiptor的结构。(B)20μM化合物I-2、AQX-1125和PI(3,4)P₂与野生型(WT)PAC2结合的代表性生物层干涉分析(BLI)曲线。每个数据点表示来自于独立生物传感器的数据(单向ANOVA和Tukey’s校正，***p<0.001，**p<0.01)。

图8示出了化合物I-1对IL10^-/-结肠炎中的炎症的影响。(A)代表性的H&E染色的近端、中段和远端结肠区段，(B)正常(无结肠炎，n＝6)和用媒介物(Veh.，n＝9)、I-1(3mg/kg)(n＝8)或地塞米松(Dex.，0.4mg/kg)(n＝3)治疗3周的结肠炎IL10^-/-小鼠的病理评分。当与媒介物治疗组相比时(单向ANOVA和Tukey’s校正，F＝34.59)，****p<0.0001。(C)从正常(无结肠炎)和用媒介物(Veh.)、I-1(3mg/kg)或地塞米松(Dex.，0.4mg/kg)治疗的结肠炎IL10^-/-小鼠的结肠区段制备的cDNA的RT-qPCR。数据代表IL-17和CCL2相对于GAPDH的表达的平均值。当与载体治疗组相比时(单向ANOVA和Tukey’s校正，F＝34.59)，**p<0.01，****p<0.0001。

图9示出了IL10和IL6在BMDM中刺激STAT1和STAT3的磷酸化。将细胞用10或100ng/mL IL10/IL6刺激30分钟并制备裂解液，用于使用针对所指示的蛋白和磷酸化蛋白的抗体的免疫印迹分析。

图10示出了化合物I-1在体内抑制MM细胞生长。将表达萤火虫萤光素酶的MM.1S细胞与Matrigel基底膜一起皮下注射到NOD/SCID小鼠的上胁部并允许其建立2周。每3天以50mg/kg体重的剂量将化合物I-1或对照媒介物(n＝4)以油储库形式皮下施用到下胁部中。(A)对照和化合物I-1治疗的小鼠的生物发光图像。(B)使用生物发光成像定量肿瘤体积。

图11示出了化合物I-1在保护ConA诱导的肝损伤中的作用。图A至D分别示出了用空白对照、单独的化合物I-1(MN-100)、单独的ConA、ConA和化合物I-1(MN-100)(3mg/kg/d)或ConA和化合物I-1(MN-100)(10mg/kg/d)治疗的C57小鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血浆酶水平以及总胆红素(TBIL)和血液尿素氮(BUN)的水平。图E和F分别示出了用空白对照、单独的ConA、ConA和化合物I-1(MN-100)(10mg/kg/d)或ConA和地塞米松(0.5mg/kg/d)(阳性对照)治疗的C57小鼠的ALT和AST的血浆酶水平。

图12示出了来自于空白/载体对照小鼠(图A)、盲肠结扎和穿刺(CLP)手术的脓毒症小鼠(图B)或假手术对照小鼠(图C)的血液培养的琼脂平板的照片。

图13示出了化合物I-1(ZPR-MN100)在治疗CLP脓毒症小鼠中的剂量依赖性治疗效果。将CLP手术的小鼠通过口饲管用3mg/kg/天或10mg/kg/天的I-1治疗，并与对照进行存活率的比较。

具体实施方式

本公开的其他特点和优点将从下面的详细描述变得显而易见。然而应该理解，所述详细描述和具体实例尽管指示了本公开的实施方式，但仅仅作为说明给出，并且权利要求书的范围不应受到这些实施方式限制，而是应该给出与作为整体的描述相一致的最宽泛的解释。

I.定义

除非另有指明，否则在本章节和其他章节中描述的定义和实施方式旨在适用于本领域技术人员将会理解的它们所适合的本文描述的本公开的所有实施方式的方面。

当在本文中使用时，术语“本公开的化合物”等是指式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

当在本文中使用时，术语“本公开的组合物”等是指包含一种或多种本公开的化合物的组合物，例如药物组合物。

本文中使用的术语“ZPR-100”、“ZPR-MN100”、“AQX-MN100”或“MN-100”是指化合物I-1。

本文中使用的术语“ZPR-151”是指化合物I-2。

当在本文中使用时，术语“和/或”意味着所列条目单独地或组合地存在或使用。实际上，该术语意味着使用或存在所列条目中的“至少一者”或“一者或多者”。对于其可药用盐和/或溶剂化物来说，术语“和/或”意味着本公开的化合物作为单独的盐和水合物以及例如本公开的化合物的盐的溶剂化物的组合存在。

当在本公开中使用时，没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。例如，包括“化合物”的实施方式应该被理解为提出了某些含有一种化合物或两种或更多种额外化合物的情况。

在包含“额外”或“第二”组分例如额外或第二化合物的实施方式中，所述本文中使用的第二组分在化学上不同于其他组分或第一组分。“第三”组分不同于所述其他的第一和第二组分，并且进一步列举的或“额外”组分同样是不同的。

本文中使用的术语“适合的”意味着特定化合物或条件的选择将依赖于待执行的具体合成操作、待转化的分子的身份和/或所述化合物的具体用途，但所述选择将完全在暴露技术人员的技术之内。

在本公开的实施方式中，本文描述的化合物可能具有至少一个不对称中心。在化合物具有超过一个不对称中心的情况下，它们可能作为非对映异构体存在。应该理解，所有此类异构体及其采取任何比例的混合物被涵盖在本公开的范围之内。还应该理解，尽管在本文列出的任何给定化合物中所述化合物的立体化学可能正如所示，但此类化合物可能还含有一定量(例如少于20％、适合地少于10％、更适合地少于5％)的具有可选立体化学的本公开的化合物。打算将作为分离的、纯的或部分纯化的光学异构体的任何光学异构体或其外消旋混合物包括在本公开的范围之内。

本公开的化合物也可以以不同的互变异构形式存在，并且打算将所述化合物形成的任何互变异构形式及其混合物包括在本公开的范围之内。

本公开的化合物也可能以不同的多晶型形式存在，并且打算将形成的任何多晶型或其混合物包括在本公开的范围之内。

本描述涉及本领域技术人员使用的许多化学术语和缩略语。然而，为了清晰和一致，提供了所选术语的定义。

当在本文中使用时，术语“约”、“基本上”和“大约”意味着所修饰的术语的使得最终结果不显著改变的合理偏差量。这些程度性术语应该被解释为包括所修饰的术语的至少±5％的偏差，如果这种偏差不会否定它所修饰的词语的含义的话，或者除非上下文对本领域技术人员另有建议。

本文中使用的术语“烷基”不论是单独还是作为另一个基团的一部分使用，均意味着直链或支链饱和烷基。在提到的烷基中可能的碳原子数目由前缀“C_n1-n2”指明。例如，术语C_1-10烷基意味着具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的烷基。

本文中使用的术语“杂环”是指取代或未取代的5或6元杂环，其可以是芳香族或非芳香族的，包含至少一个NH部分。

本文中使用的术语“取代的”是指化合物上的一个或多个可用的氢被非氢官能团代替的情况。

在“可用的氢原子”或“可用的原子”中，术语“可用的”是指本领域技术人员已知能够被取代基代替的原子。

本文中使用时术语“胺”或“氨基”不论是单独还是作为另一个基团的一部分使用，均意味着通式NR′R″的基团，其中R′和R″各自独立地选自氢或C_1-6烷基。

本文中使用的术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，并且适合情况下是指人类。因此，本公开的方法和用途适用于人类疗法和兽医应用两者。

术语“可药用”意味着与受试者的治疗相容。

术语“可药用载体”意味着无毒性溶剂、分散剂、赋形剂、佐剂和其他材料，其与活性成分混合以便允许形成药物组合物，即能够施用到受试者的剂型。

术语“可药用盐”意味着适合于受试者的治疗或与其相容的酸加成盐或碱加成盐。

适合于受试者的治疗或与其相容的酸加成盐是任何碱性化合物的任何无毒性有机或无机酸加成盐。

适合于受试者的治疗或与其相容的碱加成盐是任何酸性化合物的任何无毒性有机或无机碱加成盐。

本文中使用的术语“溶剂化物”意味着其中在晶格中并入有适合的溶剂分子的化合物或化合物的盐。

本公开的化合物的前药可以是例如与可用的羟基、硫醇、氨基或羧基形成的常规酯类。形成前药的其他方法通常被本领域技术人员所知，并且可以适用于本公开的化合物。

当在本文中使用时并且正如本领域中公知的，术语“治疗”意味着获得有益或所需结果、包括临床结果的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状或病症的减轻或改善、疾病严重程度的降低、疾病状态的稳定(即不恶化)、阻止疾病蔓延、延迟或减缓疾病进展、疾病状态的改善或减轻、疾病复发的减少和缓解(不论是部分还是完全)，不论是可检测还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与不接受治疗的情况下的预期生存期相比延长生存期。本文中使用的“治疗”还包括预防性治疗。例如，可以对患有早期癌症的受试者进行治疗以阻止进展，或者可以用本公开的化合物或组合物治疗缓解中的受试者以防止复发。治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本公开的化合物，并任选地由单次施用组成或包括一系列施用。

“减轻”疾病、障碍或病症意味着与不治疗所述障碍相比减轻疾病、障碍或病症的严重程度和/或不想要的临床表现，和/或减缓或延长进展的时间过程。

本文中使用的术语“预防”是指降低患者患上疾病、障碍或病症或表现出与疾病、障碍或病症有关的症状的风险或可能性。

本文中使用的术语“疾病、障碍或病症”是指由SHIP1介导或者可以通过激活SHIP1例如通过本公开的化合物治疗的疾病、障碍或病症。

本文中使用的术语“SHIP1”是指含Src同源2的肌醇5′-磷酸酶1。

本文中使用的术语“由SHIP1介导的或者可以通过SHIP1的激活治疗的”意味着所述待治疗的疾病、障碍或病症直接或间接地受到某些生物基础影响、由某些生物基础调节和/或具有某些生物基础，所述生物基础包括细胞中SHIP1磷酸酶的存在。此类生物基础包括例如作为SHIP1磷酸酶的直接或间接产物的细胞因子。在示例性情形中，“SHIP1的激活”是指细胞或生物体中通过由SHIP1例如由PIP₃和/或IL-10激活信号传导而介导的效应。

当在本文中使用时，术语“有效量”或“治疗有效量”意味着一种或多种本公开的化合物在实现所需结果所必需的剂量和时间长度上有效的量。例如，在治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的情形中，有效量是例如与不施用所述一种或多种化合物时的SHIP1活性相比提高SHIP1活性的量。

本文中使用的术语“施用”意味着向细胞、组织、器官或受试者施用治疗有效量的一种或多种本公开的化合物或组合物。

本文中使用的术语“赘生性障碍”是指以能够自主生长或复制的细胞为特征的疾病、障碍或病症，例如以增殖性细胞生长为特征的异常状态或病症。本文中使用的术语“赘生物”是指由患有赘生性障碍的受试者中细胞的异常生长和/或分裂产生的组织团。

本文中使用的术语“癌症”是指细胞增殖性疾病状态。

II.本公开的化合物和组合物

本公开包括一种式I的化合物

或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，

其中R¹选自H、OH、OC(O)C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基、N琥珀酰亚胺和NHC(O)C_1-3烷基；

其中R²、R³、R⁴和R⁵独立地选自H、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基；或者R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵与它们附连到的原子合在一起形成取代或未取代的5或6元杂环，所述取代或未取代的5或6元杂环包含至少一个NH和任选的选自N、O和S的一个或多个额外的杂原子；并且

其中当R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵合在一起形成所述取代或未取代的5或6元杂环时，R⁴和R⁵、R²和R⁵或R²和R³分别独立地选自H和C_1-3烷基。

在某些实施方式中，所述式I的化合物是式IA的化合物

其对映异构体或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

在某些实施方式中，R¹选自H、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基、N琥珀酰亚胺和NHC(O)C_1-3烷基。

在某些实施方式中，R²和R⁴是H，并且R³和R⁵选自OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基。

在某些实施方式中，R³和R⁵选自OH、CH₃、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃。

在某些实施方式中，R³选自OH、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃；并且R⁵是CH₃。

在某些实施方式中，R²、R⁴和R⁵是H，并且R³选自OH、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基。例如，R³选自OH、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃。

在某些实施方式中，所述取代或未取代的5或6元杂环是芳香族或非芳香族的。在另一个实施方式中，所述5或6元杂环包含NH部分和一个或多个选自O和N的杂原子。在其他实施方式中，所述5或6元杂环上的取代基选自C＝O和C_1-3烷基。

在某些实施方式中，所述取代或未取代的5或6元杂环选自

在某些实施方式中，R²和R³与它们附连到的原子合在一起形成所述取代或未取代的5或6元杂环，并且R⁴和R⁵独立地选自H和C_1-3烷基。

在某些实施方式中，所述式I的化合物选自：

及其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

在某些实施方式中，本申请的式I的化合物不包括化合物I-1。在某些实施方式中，本申请的式I的化合物不包括化合物I-2。任选地，化合物I-1和I-2两者均不包括在式I的化合物中。

另一方面，本公开提供了一种本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，其用于治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症。

在实施方式中，所述可药用盐是酸加成盐或碱加成盐。适合的盐的选择可以由本领域技术人员做出(参见例如S.M.Berge等，"Pharmaceutical Salts,"J.Pharm.Sci.1977,66,1-19)。

适合于受试者的治疗或与其相容的酸加成盐是任何碱性化合物的任何无毒性有机或无机酸加成盐。形成酸加成盐的碱性化合物包括例如包含胺基的化合物。形成适合的盐的说明性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸，以及酸性金属盐例如正磷酸氢二钠和硫酸氢钾。形成适合的盐的说明性有机酸包括单、二和三羧酸。此类有机酸的示例是例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、对甲苯磺酸和其他磺酸例如甲磺酸、乙磺酸和2-羟基乙磺酸。在实施方式中，形成单酸或二酸盐，并且此类盐以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。通常，酸加成盐与它们的游离碱形式相比在水和各种亲水性有机溶剂中更加可溶，并且通常表现出更高的熔点。适合的盐的选择标准对于本领域技术人员来说是已知的。其他不可药用盐例如但不限于草酸盐可用于例如本公开的化合物的分离，用于实验室用途或用于随后转变成可药用酸加成盐。

适合于受试者的治疗或与其相容的碱加成盐是任何酸性化合物的任何无毒性有机或无机碱加成盐。形成碱加成盐的酸性化合物包括例如包含羧酸基团的化合物。形成适合的盐的说明性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡以及氨。形成适合的盐的说明性有机碱包括脂族、脂环族或芳香族有机胺例如异丙胺、甲胺、三甲胺、甲基吡啶、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。示例性有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。选择适合的盐可能是有用的，例如使得化合物中别处的酯官能团(如果有的话)不被水解。适合的盐的选择标准对于本领域技术人员来说是已知的。

本公开的化合物的溶剂化物包括例如使用可药用的溶剂制成的溶剂化物。此类溶剂的实例包括水(得到的溶剂化物被称为水合物)和乙醇等。适合的溶剂在施用的剂量下是生理可耐受的。

本公开的化合物适合地使用一种或多种载体以常规方式配制成组合物。因此，本公开还包括一种组合物，其包含一种或多种本公开的化合物和载体。本公开的化合物被适合地配制成药物组合物，用于以适合于体内施用的生物相容的形式施用到受试者。因此，本公开还包括一种药物组合物，其包含一种或多种本公开的化合物和可药用载体。在本公开的实施方式中，所述药物组合物用于治疗本文中描述的任何疾病、障碍或病症。

在某些实施方式中，本公开的组合物基本上由一种或多种本公开的化合物或其一种或多种可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物以及可药用载体组成。

在某些实施方式中，本公开的组合物由一种或多种本公开的化合物或其一种或多种可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物以及可药用载体组成。

正如本领域技术人员将会理解的，取决于所选的施用途径，本公开的化合物以各种不同的形式施用到受试者。例如，本公开的化合物通过口服、吸入、肠胃外、颊、舌下、鼻、直肠、阴道、贴片、泵、局部或透皮施用和因此配制的药物组合物施用。在某些实施方式中，施用利用定期或连续递送的泵进行。用于选择和制备适合的组合物的常规程序和成分被描述在例如《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(2000–第20版)和1999年出版的《美国药典：国家处方集》(The United States Pharmacopeia:The NationalFormulary)(USP 24NF19)中。

肠胃外施用包括胃肠(GI)道之外的全身性递送途径，并包括例如静脉内、动脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、经上皮、鼻、肺内(例如通过使用气溶胶)、鞘内、直肠和局部(包括使用贴片或其他透皮递送装置)施用方式。肠胃外施用可以通过在所选时间段内的连续输注来进行。

在某些实施方式中，本公开的化合物与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用，或者将它封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者将它压制成片剂，或者将它与饮食中的食物直接合并。在某些实施方式中，将所述化合物与赋形剂合并，并以可吞服片剂、颊含片、锭剂、胶囊、囊片、球丸、颗粒剂、含片、口香糖、粉剂、糖浆、酏剂、薄片、水性溶液和悬液等的形式使用。在片剂的情况下，使用的载体包括乳糖、玉米淀粉、柠檬酸钠和磷酸盐。可药用赋形剂包括粘合剂(例如预明胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙基酸淀粉钠)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。在实施方式中，所述片剂通过本领域中公知的方法包衣。在用于口服施用的片剂、胶囊、囊片、球丸或颗粒剂的情况下，任选地使用被设计用于控制活性成分的释放的pH敏感性肠溶包衣例如Eudragits^TM。口服剂型还包括改良的释放，例如立即释放和定时释放制剂。改良释放制剂的实例包括例如持续释放(SR)、延长释放(ER、XR或XL)、时间释放或定时释放、受控释放(CR)或连续释放(CR或Contin)，以例如包衣片剂、渗透递送装置、包衣胶囊、微囊化微球、团聚粒子例如分子筛类型的粒子或细中空可渗透纤维束或团聚或保持在纤维包中的切碎的中空可渗透纤维的形式使用。定时释放组合物被配制成例如脂质体或其中例如通过微囊化、多重包衣等将活性化合物用不同可降解包衣保护的组合物。脂质体递送系统包括例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。在某些实施方式中，脂质体从各种不同的磷脂例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。对于胶囊形式的口服施用来说，有用的载体或稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。

在某些实施方式中，用于口服施用的液体制剂采取例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们适合地作为干燥产品存在，在使用前用水或其他适合的载体构造。当水性悬液和/或乳液被口服施用时，本公开的化合物被适合地悬浮或溶解在与乳化和/或悬浮剂合并的油性相中。如果需要，添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。此类用于口服施用的液体制剂通过常规手段，使用可药用添加剂制备，所述可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性载体(例如杏仁油、油性酯类或乙醇)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。有用的稀释剂包括乳糖和高分子量聚乙二醇。

也可以将本公开的化合物冷冻干燥，并将得到的冻干物用于例如制备注射用产品。

在某些实施方式中，本公开的化合物肠胃外施用。例如，在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适合的混合的水中制备本公开的化合物的溶液。在某些实施方式中，在含有或不含醇的甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其混合物中和在油中制备分散系。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。本领域技术人员将知道如何制备合适的制剂。对于肠胃外施用来说，通常制备本公开的化合物的无菌溶液，并适当调节和缓冲所述溶液的pH。对于静脉内使用来说，应控制溶质的总浓度以使所述制剂等渗。对于眼部施用来说，例如通过本领域已知的眼部递送系统如涂药器或滴眼器来递送软膏或可滴液体。在某些实施方式中，此类组合物包含黏液模拟物例如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯醇，防腐剂例如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬，以及通常量的稀释剂或载体。对于肺部施用来说，将选择适合的稀释剂或载体以允许形成气溶胶。

在某些实施方式中，本公开的化合物被配制成用于通过注射、包括使用常规的导管插入技术或输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂以例如单位剂型存在，例如在安瓿或多剂容器中，并添加有防腐剂。在某些实施方式中，所述组合物采取诸如在油性或水性载体中的无菌悬液、溶液或乳液的形式，并含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是流体以达到容易注射的程度。或者，本公开的化合物适合地采取无菌粉剂的形式，用于在使用前用适合的载体例如无菌无热原水重构。

在某些实施方式中，用于鼻施用的组合物被方便地配制成气溶胶、滴剂、凝胶和粉剂。对于鼻内施用或吸入施用来说，本公开的化合物方便地体溶液、干粉制剂或悬液的形式从被患者挤压或泵送的泵喷雾容器递送，或作为气溶胶喷雾形式从加压容器或喷雾器递送。气溶胶制剂通常包含活性物质在生理上可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细小悬浮液，并且通常以单剂或多剂的量以无菌形式存在于密封容器中，例如采取药筒的形式或重新装填以与雾化装置一起使用。或者，所述密封容器是一体式分配装置例如单剂鼻吸入器或装备有计量阀的气溶胶分配器，旨在使用后丢弃。在所述剂型包含气溶胶分配器的情况下，它将含有推进剂，其是例如压缩气体如压缩空气或有机推进剂例如氟氯烃。适合的推进剂包括但不限于二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、七氟烷烃、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位通过提供阀门适合地确定，以递送计量的量。在某些实施方式中，加压容器或喷雾器含有活性化合物的溶液或悬液。例如，用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)被配制成含有本公开的化合物与适合的粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述气溶胶剂型也可以采取泵雾化器的形式。

适合于颊或舌下施用的组合物包括片剂、含片和软锭剂，其中将本公开的化合物与载体例如糖、阿拉伯胶、黄耆胶或明胶和甘油一起配制。用于直肠施用的组合物方便地采取含有常规栓剂基料例如可可脂的栓剂的形式。

本公开的化合物的栓剂形式可用于阴道、尿道和直肠施用。此类栓剂通常由在室温下为固体但在体温下融化的物质的混合物构成。常用于制造此类载体的物质包括但不限于可可油(也被称为可可脂)、甘油化明胶、其他甘油酯、氢化植物油、各种不同分子量的聚乙二醇的混合物和聚乙二醇的脂肪酸酯。关于栓剂剂型的进一步讨论，参见例如《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第16版，Mack Publishing,Easton,PA,1980,pp.1530-1533。

在某些实施方式中，本公开的化合物与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物包括例如聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺-苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，在某些实施方式中，本公开的化合物与可用于实现药物的受控释放的一类可生物降解聚合物偶联，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。

本公开的化合物、包括其可药用盐和/或溶剂化物在适合情况下自身使用，但通常以药物组合物的形式施用，其中将所述一种或多种本公开的化合物(活性成分)与可药用载体联合。取决于施用方式，所述药物组合物将包含约0.05wt％至约99wt％或约0.10wt％至约70wt％的活性成分和约1wt％至约99.95wt％或约30wt％至约99.90wt％的可药用载体，所有百分率均以总组合物的重量计。

III.本公开的方法和用途

另一方面，本公开包括一种治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括在有需要的受试者中施用治疗有效量的本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

另一方面，本公开包括一种或多种本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物用于治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的用途。

另一方面，本公开包括一种或多种本公开的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物用于制备药剂用于由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的药物的用途。

在某些实施方式中，所述由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症选自炎性肠病(IBD)、多发性骨髓瘤、过敏和赘生性障碍例如结肠癌、脓毒症、器官损伤、创伤、心血管疾病、骨质疏松症和睡眠障碍。在某些实施方式中，所述IBD选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。

在某些实施方式中，所述器官损伤和创伤由IL-10通过SHIP1介导。在某些实施方式中，所述器官损伤和创伤是肝损伤。在某些实施方式中，所述肝损伤选自病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和肝同种异体抑制排斥。已知IL-10施用减轻器官损伤例如肝或肺炎症，并减轻神经或脊髓损伤中的神经病变。

在某些实施方式中，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化。已知IL-10施用限制组织炎症并改善内皮细胞和巨噬细胞功能。

在某些实施方式中，所述骨质疏松障碍包括那些IL-10施用可以抑制成熟破骨细胞的再吸收功能的障碍。

在某些实施方式中，所述由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症是多发性骨髓瘤。

在某些实施方式中，所述脓毒症是重症脓毒症。已知病毒感染例如COVID-19引起重症脓毒症。在某些实施方式中，所述重症脓毒症由COVID-19引起。

在实施方式中，所述治疗采用在需要此类治疗的受试者中有效改善赘生性障碍的至少一种症状例如减少细胞增殖或缩小肿瘤团块。

赘生物可以是良性的(例如子宫肌瘤和黑素细胞痣)、潜在恶性的(例如原位癌)或恶性的(即癌症)。示例性的赘生性障碍包括所谓的实体肿瘤和液体肿瘤，包括但不限于上皮癌、肉瘤、转移性障碍(例如来从前列腺产生的肿瘤)、造血赘生性障碍(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和其他恶性浆细胞障碍)、转移性肿瘤和其他癌症。

本公开还包括一种或多种本公开的化合物，其用于治疗癌症。在实施方式中，所述化合物被施用以在具有癌症易感性的受试者例如哺乳动物中预防癌症。

在实施方式中，所述癌症选自但不限于：成人急性成淋巴细胞性白血病，儿童急性成淋巴细胞性白血病，成人急性髓系白血病，肾上腺皮质癌，儿童肾上腺皮质癌，AIDS相关淋巴瘤，AIDS相关恶性肿瘤，肛门癌，儿童小脑星形细胞瘤，儿童大脑星形细胞瘤，肝外胆管癌，膀胱癌，儿童膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，儿童脑干胶质细胞瘤，成人脑肿瘤，儿童脑肿瘤脑干胶质细胞瘤，儿童脑肿瘤小脑星形细胞瘤，儿童脑肿瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质细胞瘤，儿童脑肿瘤室管膜瘤，儿童脑肿瘤成髓细胞瘤，儿童脑肿瘤幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童脑肿瘤视觉通路和下丘脑胶质细胞瘤，儿童脑肿瘤(其他)，乳腺癌，乳腺癌和妊娠，儿童乳腺癌，男性乳腺癌，儿童支气管腺瘤/类癌，儿童类癌瘤，胃肠道类癌瘤，肾上腺皮质癌，胰岛细胞癌，原发性不明癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，儿童小脑星形细胞瘤，儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质细胞瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病，慢性骨髓增生性障碍，腱鞘透明细胞肉瘤，结肠癌，儿童结肠直肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，儿童室管膜瘤，卵巢上皮癌，食道癌，儿童食道癌，尤因家族的肿瘤，儿童颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，眼癌眼内黑素瘤，眼癌成视网膜细胞瘤，胆囊癌，胃癌，儿童胃癌，胃肠类癌瘤，儿童颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，卵巢生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，儿童脑干胶质细胞瘤，儿童视觉通路和下丘脑胶质细胞瘤，毛细胞白血病，头颈癌，成人(原发性)肝细胞(肝)癌，儿童(原发性)肝细胞(肝)癌，成人霍奇金淋巴瘤，儿童霍奇金淋巴瘤，妊娠期霍奇金淋巴瘤，下咽癌，儿童下丘脑和视觉通路胶质细胞瘤，眼内黑素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺)，卡波斯肉瘤，肾癌，喉癌，儿童喉癌，成人急性成淋巴细胞性白血病，儿童急性成淋巴细胞性白血病，成人急性髓系白血病，儿童急性髓系白血病，慢性淋巴细胞性，慢性髓细胞性白血病，毛细胞白血病，唇和口腔癌，成人(原发性)肝癌，儿童(原发性)肝癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，成人急性成淋巴细胞性白血病，儿童急性成淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，AIDS相关淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，成人霍奇金淋巴瘤，儿童霍奇金淋巴瘤，妊娠期霍奇金淋巴瘤，成人非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，妊娠期非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，华氏巨球蛋白血症，男性乳腺癌，成人恶性间皮瘤，儿童恶性间皮瘤，恶性胸腺瘤，儿童成髓细胞瘤，黑素瘤，眼内黑素瘤，默克尔细胞癌，恶性间皮瘤，隐匿原发性转移性鳞状颈癌，儿童多发性内分泌瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样真菌病，骨髓增生异常综合征，慢性髓细胞性白血病，儿童急性髓系白血病，多发性骨髓瘤，慢性骨髓增生性障碍，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，儿童鼻咽癌，成神经细胞瘤，成人非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，妊娠期非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，儿童口腔癌，口腔和唇癌，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，儿童卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜能肿瘤，胰腺癌，儿童胰腺癌，胰岛细胞胰腺癌，副鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体肿瘤，浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，妊娠和乳腺癌，妊娠和霍奇金淋巴瘤，妊娠和非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，成人原发性肝癌，儿童原发性肝癌，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌，儿童肾细胞癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，儿童横纹肌肉瘤，唾液腺癌，儿童唾液腺癌，尤因氏肿瘤家族肉瘤，卡波西肉瘤，肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤，儿童横纹肌肉瘤，成人软组织肉瘤，儿童软组织肉瘤，赛扎里综合征，皮肤癌，儿童皮肤癌，皮肤癌(黑素瘤)，默克尔细胞皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，成人软组织肉瘤，儿童软组织肉瘤，隐匿原发性转移性鳞状颈癌，胃癌，儿童胃癌，儿童幕上原始神经外胚层肿瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，儿童胸腺瘤，恶性胸腺瘤，甲状腺癌，儿童甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，妊娠滋养细胞肿瘤，儿童原发部位未知的癌症，儿童不寻常癌症，输尿管和肾盂移行细胞癌，尿道癌，子宫肉瘤，阴道癌，儿童视觉通路和下丘脑胶质细胞瘤，外阴癌，华氏巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤。上述癌症的转移也可以按照本文描述的方法治疗。

在其他实施方式中，所述由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症和所述一种或多种本公开的化合物与一种或多种另外的癌症治疗联合施用。在另一个实施方式中，所述另外的癌症治疗选自放疗、化疗、靶向疗法例如抗体疗法和小分子疗法例如酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂、免疫疗法、激素疗法和抗血管生成疗法。

在实施方式中，有效量随着多种因素例如疾病状态、受试者的年龄、性别和/或体重而变。在其他实施方式中，给定的一种或多种化合物的对应于有效量的量将随着多种因素而变，例如所述给定的药物或化合物、药物制剂、施用途径、病症、疾病或障碍的类型、所治疗的受试者的身份等，然而可以由本领域技术人员按常规确定。

在实施方式中，本公开的化合物每周施用至少一次。然而，在另一个实施方式中，所述化合物约每两周、三周或一个月施用到受试者一次。在另一个实施方式中，所述化合物约每周一次至约每日一次施用。在另一个实施方式中，所述化合物每日施用2、3、4、5或6次。治疗时间段的长度取决于各种不同因素，例如所述疾病、障碍或病症的严重程度、受试者的年龄、本公开的化合物的浓度和/或活性和/或其组合。还应该认识到，在特定治疗方案的过程中用于治疗的化合物的有效剂量可以提高或降低。剂量的变化可以通过本领域中已知的标准诊断测定法获得并变得显而易见。在某些情况下，需要长期施用。例如，所述化合物以足以治疗受试者的量和持续时间施用到所述受试者。

在实施方式中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方式中，所述受试者是人类。

本公开的化合物被单独地或者与其他已知药剂联合使用，所述其他药剂可用于治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症和可以用SHIP1激动剂例如本文公开的化合物治疗的疾病、障碍或病症。当与可用于治疗由SHIP1介导的或可以通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的其他药剂联合使用时，一个实施方式是将本公开的化合物与那些药剂同时施用。当在本文中使用时，两种物质向受试者的“同时施用”意味着提供所述两种物质中的每一者，使得它们在个体中同时具有活性。施用的确切细节取决于所述两种物质在彼此存在时的药代动力学，并且可以包括彼此在几小时内施用所述两种物质，或者如果药代动力学合适，甚至在施用一种物质的24小时内施用另一种物质。适合的施用方案的设计对于本领域技术人员来说是常规的。在特定实施方式中，两种物质基本上同时施用，即彼此在几分钟以内，或者在含有两种物质的单一组合物中。本公开的另一个实施方式是将药剂的组合以非同时方式施用到受试者。在实施方式中，将本公开的化合物与另一种治疗剂同时或顺序地在分开的单位剂型中施用，或者在单一单位剂型中一起施用。因此，本公开提供了一种单一单位剂型，其包含一种或多种本公开的化合物、另外的治疗剂和可药用载体。

本公开的化合物的剂量随着许多因素而变，例如化合物的药效学特性，施用方式，接受者的年龄、健康和体重，症状的本质和程度，治疗频率和如果有的话同时治疗的类型，以及所述化合物在待治疗的受试者中的清除率。本领域技术人员可以在上述因素的基础上确定适合的剂量。在某些实施方式中，本公开的化合物一开始以适合的剂量施用，然后随着临床反应根据需要调整所述剂量。剂量通常被选择成将本公开的化合物的血清水平维持在约0.01μg/cc至约1000μg/cc或约0.1μg/cc至约100μg/cc。作为代表性实例，对于成人来说，一种或多种本公开的化合物的口服剂量在约1mg/天至约1000mg/天、适合地约1mg/天至约500mg/天、更适合地约1mg/天至约200mg/天之间的范围内。对于肠胃外施用来说，代表性的量是施用约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。对于口服施用来说，代表性的量是约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。对于采取栓剂形式的施用来说，代表性的量是约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。

实施例

下面的非限制性实施例对本公开进行了说明。

通用方法

小鼠群体。BALB/c小鼠野生型(+/+)或SHIP1敲除(-/-)小鼠由Dr.Gerald Krystal(BC癌症研究中心(Cancer Research Centre),温哥华,BC)提供。STAT3-/-小鼠的产生起始于将C57BL/6STAT3 flox/flox小鼠(Dr.Shizuo Akira,兵库医科大学(Hyogo College ofMedicine),西宫，日本)与C57BL/6LysMcre小鼠(杰克森实验室(Jackson Laboratory))杂交。然后将它们的后代与纯合的STAT3 flox/flox小鼠杂交，以在同一窝幼崽中产生STAT3flox/flox/LysMCre+/-小鼠(称为STAT3-/-小鼠)和STAT3flox/flox小鼠(STAT3+/+小鼠)。所有小鼠按照由不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准的伦理学方案饲养。

构建体。使用Gateway LR反应，从pENTR1A(英杰(Invitrogen),柏灵顿,ON)构建体产生在FUGWBW中的SHIP1的哺乳动物(慢病毒)表达质粒。将pENTR1A-His₆-SHIP1 WT(SHIP1Uniprot ID Q9ES52)质粒作为模板，进行标准的基于引物的定点突变，以产生K681A、Y190F、Y799F、Y659F和Y657F突变体。磷酸酶被破坏的SHIP1构建体(磷酸酶结构域中的P671A、D675A和R676G)由Dr.KS Ravichandran(弗吉尼亚大学)善意提供。通过DNA测序来确认构建体。随后，在pENTR1A构建体与FUGWBW(FUGW，其中绿色荧光蛋白被替换成Gateway盒，并杀稻瘟菌素S抗性基因表达盒插入到Gateway盒的下游(Peacock等，2009))之间进行Gateway LR反应。通过限制性酶消化来确认LR反应的成功。对于基于Clover/mRuby2的FRET实验(Lam等，2012)来说，通过将pcDNA3 Clover(Addgene)中的Clover片段插入到pENTR1A-His₆-SHIP1 WT中SHIP1的N-端以替换His₆，构建了pENTR1A Clover-SHIP1。通过将鼠类STAT3(Uniprot ID P42227)克隆到pENTR1A中，然后将pcDNA3 mRuby2(Addgene)中的mRuby2片段插入到STAT3的N-端，构建了pENTR1A STAT3-mRuby2。构建体通过测序进行确认，并如上所述转移到FUGWBW。

通过连接酶不依赖性克隆(LIC)方法，在LIC-HMT载体(Van Petegem等，2004)中产生细菌表达载体，以生产用于晶体学和生物膜干涉技术的重组蛋白。该质粒含有N-端标签，其中N-端标签由His₆和麦芽糖结合蛋白(MBP)，随后的TEV蛋白酶切割位点构成(简写为HMT-标签)。PCR产物经过纯化，并在仅存在dCTP的情况下用T4 DNA聚合酶(LIC质量)(Novagen,麦迪逊,WI)处理。将LIC-HMT载体用SspI消化，并将线性化质粒在仅存在dGTP的情况下用T4 DNA聚合酶处理。将等体积的插入片段和载体混合并在室温温育10分钟，然后使用标准的热激法转化到化学感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞中，在含有卡那霉素的LB琼脂平板上进行选择。使用标准的定点突变，以产生不同的PAC2突变体。所有质粒的序列信息通过DNA测序来确认。

细胞系。分别源自于SHIP1+/+和-/-BMDM的J16和J17细胞系以前已被描述过(Ming-Lum等，2012)，并在Mac培养基(补充有10％(v/v)FCS、10μMβ-巯基乙醇、150μM单硫代乙醇酸和1mM L-谷氨酰胺的IMDM)中培养。如以前所述(Cheung等，2013)，通过慢病毒介导的基因转移，产生表达野生型和突变体His₆-SHIP1、Clover-SHIP1或mRuby2-STAT3构建体的J17细胞。转导的细胞用5μg/ml杀稻瘟菌素进行选择。Clover-SHIP1和mRuby2-STAT3细胞进一步在FACS Aria II细胞仪上进行荧光活化细胞的分选，以选择最亮的细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离。通过用3ml无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(赛默飞(Thermo Fisher Scientific),尼平(Nepean),ON)进行腹腔灌洗，从小鼠中分离出原代腹腔巨噬细胞(perimacs)。收集Perimacs并转移到Mac培养基。

骨髓来源的巨噬细胞的产生。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)通过如下步骤产生：首先从小鼠收集股骨和胫骨，然后通过26-G针头冲洗出骨髓。将提取的细胞在10-cm组织培养板上，在补充有各5ng/ml的CSF-1和GM-CSF(Stem Cell Technologies,温哥华(Vancouver),BC)的Mac培养基中铺板，在37℃下孵育2小时。收集非贴壁细胞，并以每个10-cm组织培养板中9×10⁶个细胞的密度重新铺板。然后将细胞在存在CSF-1和GM-CSF的情况下进行培养。7至8天后使用分化的BMDM。所有细胞被维持在37℃、5％ CO₂、95％湿度的培养箱中。

连续流动培养。连续流动装置便于恒定的刺激和除去细胞上清液，以确定细胞因子随时间产生的动力学情况。将BMDM以3×10⁵个细胞/孔的密度接种在已用聚L-赖氨酸(Thermo Fisher Scientific,Nepean,ON)包被并用PBS清洗的24孔组织培养板中。在过夜温育后，除去培养基并添加补充有3％ FCS、10μMβ-巯基乙醇和150μM单硫代乙醇酸的Leibovitz’s L-15(L-15)培养基(Invitrogen,伯灵顿(Burlington),ON)。允许细胞在L-15培养基中平衡1小时，然后放置在连续流动装置中。在37℃平衡的相同培养基中配制刺激溶液，并通过注射泵(新纪元注射泵公司(New Era Syringe Pumps Inc.),法明代尔(Farmingdale),NY)穿过安装在孔上的改良入口。使用每分钟150μl的流速。同时，以相同的流速从孔中移除细胞上清液，在3小时的过程中以5分钟的间隔收集级分。通过ELIS分析这些级分中的分泌的TNFα水平。

实时定量PCR。使用Trizol试剂(Invitrogen,Burlington,ON)按照制造商的说明书提取总RNA。将约2～5μg RNA用DNAseI(Roche Diagnostics,Laval,QC)按照产品手册进行处理。对于mRNA表达分析来说，在Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(RocheDiagnostics,Laval,QC)中使用120ng RNA，并通过基于SYBR Green的实时PCR(实时PCR)(Roche Diagnostics,Laval,QC)分析产生的0.1μl至0.2μl cDNA，其中实时PCR使用300nM基因特异性引物。使用StepOne Plus RT-PCR系统(应用生物系统公司(AppliedBiosystems),Burlington,ON)测量mRNA的表达水平，并使用GAPDH作为标准化对照，通过比较Ct法来定量mRNA水平。

TNFα生产的测量。将细胞以50×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中，并允许过夜贴壁。第二天，在刺激前1小时更换培养基。将细胞用1或10ng/ml LPS+/-不同浓度的IL10刺激1小时。收集上清液，并使用BD OptEIA小鼠TNFα酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(BD Biosciences,米西索加(Mississauga),ON)来测量分泌的TNFα蛋白水平。每种刺激条件均进行三个平行实验孔。从三个独立实验来计算IC50值，并通过单向ANOVA，分析表达SHIP1突变体相比于表达SHIP1 WT蛋白的细胞的IL10 IC50值的差异。

体外磷酸酶测定法。磷酸酶测定如前所述在96孔微量滴定板中进行，每孔使用10ng酶，在总体积为25μL的20mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.05％吐温(Tween)-20、10mM MgCl₂中(Ong等，2007)。将酶与化合物I-1(溶解在乙醇中)在23℃温育10分钟，然后添加50μM肌醇-1,3,4,5-四磷酸(IP4)(Echelon Bioscience Inc.,盐湖城(Salt LakeCity),犹他州(Utah))。允许反应在37℃进行10分钟，并通过添加孔雀石绿试剂，在650nm处测量吸光值来评估释放的无机磷酸盐的量。使用不同浓度的IP4(0～300μM)，在不同时间点终止反应，来确定酶动力学。计算初始速度，并使用GraphPad 6软件确定K_cat和K_M。

体外拉下(pull down)测定法。将J17 His₆-SHIP1和Y190F细胞以2×10⁶个细胞/孔的密度接种在6孔板中。在过夜温育后，添加新鲜的细胞培养基，30分钟后用100ng/ml的IL10、IL6或20μM化合物I-2刺激5分钟。将细胞用含有1％辛基葡萄糖苷、0.01M咪唑和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断(Roche Diagnostics),拉瓦尔(Laval),QC)的蛋白溶解缓冲液(PSB，50mM Hepes，pH 7.5，100nM NaF，10mM焦磷酸钠，2mM NaVO₄，2mM钼酸钠，2mM EDTA)在4℃裂解30分钟，并以10000rpm离心15分钟。向上清液添加抗EDTA Ni珠(RocheDiagnostics,Laval,QC)，并将混合物在4℃温育1小时，然后离心，并将珠子用PSB中的0.1％辛基葡萄糖苷清洗三次。将珠子样品和起始材料的细胞裂解液在7.5％SDS-PAGE凝胶上分离。

免疫印迹。将蛋白裂解液在SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,怡陶碧谷(Etobicoke),ON)上。将膜进行封闭，并在适合的情况下用下述一抗探测过夜：SHIP1(P1C1)(圣克鲁斯(Santa Cruz Biotechnology))，pSHIP1(Y190)(Kinexus)，STAT3(9D8)(赛默飞世尔(ThermoFisher Scientific))，pSTAT3(Y705)(ThermoFisher Scientific)，STAT1(BD Transduction Laboratories)，pSTAT1(Y701)(UpstateBiotechnology)，GAPDH和肌动蛋白(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))。将膜用Alexa

660抗小鼠IgG或Alexa

680抗兔IgG抗体(Thermo Fisher Scientific)显色，并使用LI-COR Odyssey成像仪成像。

受体光漂白FRET分析。将表达Clover-SHIP1和/或mRuby2-STAT3的J17细胞以50×10⁴个细胞/孔的密度接种在8孔Ibidiμ-载片(易必迪公司(Ibidi GmbH),马丁斯里德(Martinsried),德国)上。在过夜温育后，将细胞用含有1％血清的Mac培养基血清饥饿3小时，然后将培养基更换成补充有1％血清、10μMβ-巯基乙醇、150μM单硫代乙醇酸和1mM L-谷氨酰胺的Leibovitz’s(L-15)培养基(Invitrogen,Burlington,ON)，用于共聚焦显微成像。将细胞在配备有63X/1.3Gly HC PL APO CS2物镜的DMi8共聚焦显微镜系统的莱卡(Leica)SP8X上，使用白光激光线(其使用488nm进行供体激发，使用555nm进行受体激发)，进行成像。通过对受体mRuby2-STAT3进行漂白之前和之后，在“感兴趣区域”(ROI)的细胞视野内以100％的激光强度测量60帧的Clover-SHIP1供体荧光强度，来进行光漂白FRET分析。受体光漂白首先在静息细胞中，然后在用L-15培养基或含有100ng/ml IL10、IL6或20μM化合物I-2的L-15培养基“模拟”刺激后1分钟(±5秒)时进行。在漂白之前和之后，对被漂白的ROI内单个细胞的供体和受体荧光强度进行定量。FRET效率百分比通过公式％FRET_eff＝100×(D_后–D_前)/D_后来计算，其中D_前和D_后分别表示漂白之前和之后的Clover-SHIP1供体荧光强度。

免疫荧光。将Perimacs以3×10⁵个细胞/孔的密度接种在18孔Ibidiμ-载片(IbidiGmbH,Martinsried,Germany)中并允许其贴壁3小时，然后用PBS清洗以除去非贴壁细胞。将CD8+T细胞以2×10⁶个细胞的量接种在12孔组织培养板中。将细胞用100ng/ml IL10或20μM化合物I-2刺激2或20分钟，然后用3×PBS清洗，并将细胞在4％多聚甲醛中，在室温固定15分钟。将细胞与抗小鼠CD16/CD32 Fc Block(BD Pharmingen)温育1小时，然后在4℃，与抗SHIP1抗体(P1C1)(Santa Cruz Biotechnology)或抗STAT3抗体(9D8)(ThermoFisherScientific)温育过夜。然后将细胞与抗小鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor 660的二抗(ThermoFisher Scientific)温育1小时，之后对于perimacs与抗CD11b-FITC抗体(BDPharmingen)温育30分钟。在共聚焦显微术之前，将CD8+T细胞封装在18孔Ibidiμ-载片上，并且细胞储存在补充有ProLong Gold抗衰减试剂和DAPI(Molecular Probes,LifeTechnologies)的Ibidi封片介质中。将细胞在带有63x/1.4-0.6Oil PL APO物镜的DM6000共聚焦显微镜上的Leica SP5II成像，使用405、488和633nm激光线进行激发。顺序扫描最终的图像，获取8个Z-堆栈，平均帧数为4。使用ImageJ软件进行共定位分析，首先将各个z-堆栈的共聚焦图像合并，然后分别使用CUDA反卷积和JACoP插件进行反卷积和共定位。产生皮尔逊系数值作为SHIP1或STAT3与CD11b(Perimacs)或DAPI之间重叠程度的度量。

小鼠内毒素血症模型。将6～8周龄BALB/c SHIP1+/+和SHIP1-/-小鼠的组，用1或5mg/kg LPS，在进行或不进行1mg/kg IL10共同施用的情况下进行腹腔内注射。1小时后通过心脏穿刺抽血，用于通过ELISA确定血浆细胞因子水平。用于TNFα的ELISA试剂盒购自BDBiosciences(Mississauga,ON)。

小鼠结肠炎模型。通过口饲管施用在PBS中1:10稀释的常规C57BL/6小鼠的结肠内含物，在6～8周龄BALB/c IL10-/-小鼠中诱导结肠炎。监测小鼠体重和粪便粘稠度，并允许结肠炎发展6周。将乙醇(溶媒)和化合物I-1(3mg/kg)稀释在笼子的饮用水中，并且每两天通过口饲管施用地塞米松(0.4mg/kg)，共持续3周。在给药期结束时，收集近端、中段和远端的结肠区段，进行石蜡包埋或储存在RNALater(Invitrogen，Mississauga，ON)中用于RNA提取。由UBC病理学和实验室医学系组织化学实验室制备载片，用苏木精和曙红染色并封片。根据Madsen等人(Madsen等，2001)描述的方法，由两位独立、不知情的研究人员对样本进行病理评分。简而言之，结肠炎症使用4分量表进行分级，对黏膜下水肿、免疫细胞浸润、杯状细胞消融和上皮层完整性中的每一者进行0～3的评分。为了分析mRNA表达，将结肠区段匀浆并如上所述提取总RNA，并使用IL17、CCL2和GAPDH(标准化对照)的基因特异性引物通过实时PCR进行分析。

用于晶体学分析的PAC2的表达。将LIC-HMT-PAC2表达载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)pLacI细胞中。将过夜培养物以250倍稀释接种，以开始实际培养。将细胞在LB培养基(补充有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)中，在37℃下以225rpm振摇培养。当OD₆₀₀达到约0.6时，将培养物冷却至室温，然后添加0.4mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导重组蛋白的表达。将培养物在摇床中，22℃培养过夜(通常16～18小时)，然后通过离心(在4℃下，5000g，10分钟)收集。随后将细胞沉淀物重悬浮在裂解缓冲液(20mMTris-HCl pH 7.4，350mM NaCl，10mM TCEP，5mM咪唑，补充有1×无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(PIC)(Roche Diagnostics,Laval,QC)和25μg/ml溶菌酶)中，并在冰上通过超声处理(2分钟脉冲，进行2个循环)进行裂解。通过两轮离心除去细胞碎片，第一轮在4℃以5000g离心15分钟，然后在4℃以18000rpm离心30分钟。将上清液用0.45μm滤器过滤，并装载到预先用缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 7.4，250mM NaCl，1mM TCEP)平衡的Talon Co²⁺亲和柱上，并用10倍柱体积(CV)的缓冲液B(缓冲液A+5mM咪唑)清洗。将结合的蛋白质用6CV缓冲液C(缓冲液A+50mM咪唑)洗脱。

为了去除HMT标签，向洗脱的蛋白质中添加TEV蛋白酶(内部纯化的带有His₆标签的蛋白)，然后将其在4℃和轻柔搅拌下，用缓冲液D(20mM Tris-HCl pH 7.4，250mM NaCl，1mM TCEP)透析过夜。将透析过的样品装载到Amylose柱(New England Biolabs,惠特比(Whitby),ON)上，并将含有不带标签的蛋白质的穿流液装载到Talon柱上，以除去His₆-TEV蛋白酶。将来自于Talon柱的穿流液，用缓冲液E(20mM Tris-HCl pH 7.4，25mM NaCl，1mMTCEP)在4℃和轻柔搅拌下透析过夜，然后装载到ResourceQ柱(6ml柱体积)(GEHealthcare,Mississauga,ON)上，并用3CV的缓冲液E清洗。使用缓冲液F(20mM Tris-HClpH 7.4，1000mM NaCl，1mM TCEP)，洗脱蛋白质。在20CV内使用25mM NaCl(0％缓冲液G)至200mM NaCl(20％缓冲液G)的梯度来分离蛋白质样品中的组分。通过SDS-PAGE分析各级分。PAC2通常在～130mM NaCl，从ResourceQ柱上洗脱下来。使用具有30K MWCO的Amicon浓缩器(Millipore,Etobicoke,ON)，将纯化的蛋白质浓缩至约5～10mg/ml，并交换到所需的缓冲液中。蛋白质结晶所需的缓冲液含有50mM Tris-HCl pH7.4，25mM NaCl和0.5mM TCEP。对于生物层干涉仪来说，将从第一个Talon柱洗脱的HMT-PAC2蛋白直接在ResourceQ柱上进行纯化，无需切除HMT标签。

用于生物层干涉分析的PAC2-Avi标签的纯化。通过标准的限制性消化和连接，将对应于Avi-标签的序列(GLNDIFEAQKIEWHE)添加到LIC-HMT-PAC2表达载体中PAC2的c-末端。然后将LIC-HMT-PAC2-Avi表达载体与pBirAcm表达载体以1:1的摩尔比共转化到大肠杆菌BL21细胞中。将过夜培养物以250倍稀释接种，以开始实际培养。将细胞在LB培养基(补充有50μg/mL卡那霉素和10μg/mL氯霉素)中，在37℃，225rpm振摇速度下生长。当OD₆₀₀达到约0.6时，向培养物添加pH 8.3的在Bicine缓冲液中的5mM生物素，以获得125μM的生物素终浓度。然后将培养物冷却至室温，然后添加0.4mM异丙基-B-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导带有Avi-标签的重组蛋白的表达。方法的其余部分与在“用于晶体学分析的PAC2的表达”中书写的相同。

蛋白质结晶、数据采集、相位调整和细化。使用可商购的晶体学溶液(Qiagen,Toronto,ON)，在96孔板中通过稀疏矩阵筛选获得初始结晶命中物。使用悬滴蒸气扩散法，以24孔板格式进行结晶条件的优化。在室温下，使用0.1M HEPES-NaOH pH6.7，20％PEG1500和5mM MgCl₂，以4～7mg/ml的蛋白质浓度获得衍射质量的蛋白质晶体。PAC2-cc蛋白含有表面熵降低突变(E770A、E772A、E773A)，并有助于改善晶体质量。将蛋白质晶体簇的独特片段在含有25％异丙醇的结晶溶液中浸泡5至10秒，并在液氮中快速冷冻。

在先进光子源(Advance Proton Source，APS)光束线23-ID-D-GM/CA处收集衍射数据集，并通过XDSGUI₄₅用XDS处理。在移相器(Phaser)MR ₄₇中，使用未发表的结构作为搜索模型来解决相位问题。使用COOT₄₈和Refmac5₄₉对初始模型进行细化。为了获得最终模型，将侧链的占用率细化用于Phenix(Adams等，2010)并定义了三个TLS组。数据采集和细化统计数据示出在表1中。将模型和数据储存在蛋白质数据库ID 6DLG下。

小角度X-射线散射。190μM的PAC1样品在含有和不含570μM化合物I-1(6倍摩尔过量)的50mM TrisHCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM TCEP和2％ EtOH中。在收集SAXS收据之前，收集PAC1和PAC1-化合物I-1复合物的动态光散射(DLS)数据，以确认所有样品都是高纯的并适于进行数据采集。数据采集在装备有Rigaku 

微焦点密封管(Cu Kα辐射，

)和以40W运行的共聚焦Max-Flux(CMF)光学系统(Rigaku)的3针孔相机(S-MAX3000；理学美国(Rigaku Americas),伍德兰德斯(The Woodlands),TX)上进行。使用200mm多线二维检测器，记录散射数据。对于每个样品，按照以前描述的方法，收集样品和缓冲液的、在

范围内的数据，收集3h，并进行处理，其中s＝4πsinθ/λ(Patel等，2011；Patel等，2010；Patel等，2012)。不带配体和带有配体的PAC1模型的归一化空间差异(NSD)分别为0.6和1.0。

生物层干涉分析。使用超级链霉亲合素(SSA)生物传感器尖端和Octet Red 96仪器(ForteBio,菲利蒙特(Fremont),CA)，通过生物层干涉分析(BLI)实验检测PAC2蛋白与小分子变构调控物之间的结合亲和性。在蛋白质固定之前，将SSA生物传感器尖端在测定缓冲液20mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，10mM MgCl₂，0.5mM TCEP，0.2％ Tween-20中进行水合。在4℃下，将0.5ug/mL蛋白质在SSA生物传感器上固定过夜。在将蛋白质固定到生物传感器后，将尖端用0.1％ BSA封闭90分钟，然后用补充有1％ EtOH的测定缓冲液清洗20分钟。使用1,000RPM的轨道流，在30℃下进行动力学测量。使用补充有1％ EtOH的测定缓冲液保持60s，来获得基线。在20μM的分析物浓度下测量600s的结合，然后在相同的缓冲液中测量300s的解离作为基线。使用Octet Red数据分析软件(ver.8.2)分析原始数据。将原始数据与基线对齐，并使用单参比和双参比减法进行删减。

定量和统计分析

所有免疫印迹的条带定量使用LI-COR Odyssey成像系统和Image StudioTMLite软件(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)进行。使用GraphPad Prism 6(GraphPadSoftware Inc.,拉荷亚(La Jolla),CA)进行所有的统计分析。统计详情可以在图例中找到。值被呈现为平均值±标准偏差。在适合情况下使用未配对t检验来产生双尾P值。在需要时使用适合的多重比较检验进行单向或双向ANOVA。当p≤0.05时，差异被认为是显著的。

数据和软件的可用性

支持本研究的发现的X-射线晶体学数据已保存在全球蛋白质数据库(wwPDB)中ID代码PDB ID 6DLG下。

化合物的配制

按照下述通用程序，制备在50％ Cremophor EL/50％乙醇v/v中的50mg/mL化合物I-1储用物。将溶于Cremophore EL的100mg/mL化合物I-1和等体积乙醇中通过吸打混合在一起(大约50次或更多次，以确保只能看到一个相)。其他化合物的储用溶液以类似方式制备。将储用溶液保持在4℃下。在制备工作溶液(参见下文)之前可以将储用溶液升温至室温。

按照下述通用程序，制备5mg/mL化合物I-1溶于5％v/v Cremophore EL/5％v/v乙醇和PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液中。除了水体积之外，计算所需的50mg/mL化合物I-1在50％Cremophor EL/50％乙醇v/v中的储用溶液的体积。向所需体积的50mg/mL储用溶液中添加等体积的水，并通过吸打充分混合。用少量剩余体积的水多次反复冲洗用于储用溶液的移液器吸头，直至移液器吸头干净，并且达到5mg/mL溶液的所需的总体积。将得到的溶液充分混合直至均匀。

在饮用水中向小鼠进行给药

所使用的小鼠每只为30g，并且每天饮用2mL左右的水。

向IBD模型小鼠给药2或3mg/kg本公开的化合物，例如化合物I-1。向MM模型小鼠给药约20至约50mg/kg本公开的化合物，例如化合物I-1。将适合量的如上所制备的含有5％v/v Cremophore EL/5％v/v乙醇的5mg/mL PBS溶液稀释在小鼠的饮用水中。

实施例1.IL10需要SHIP1和STAT3来抑制巨噬细胞的TNFα产生

Takeda等人(Takeda等，1999)首先描述了STAT3在体内介导IL10抑制TNFα中的作用。已发现，与野生型小鼠相比，向STAT3髓系特异性敲减的小鼠施用LPS产生更多的TNFα，结论是内源IL10不能抵消STAT3^-/-小鼠中的LPS信号传导。然而，对他们的数据进行更仔细的检查显示，尽管在IL10^-/-小鼠中，施用LPS后TNFα水平仍然较高(Berg等，1995)，但TNFα水平在STAT3^-/-小鼠中随着内源IL10水平的升高而下降(Takeda等，图2B)。这暗示了STAT3之外的其他蛋白质可能对IL10的作用有贡献。之前已显示，基于培养的研究表明SHIP1参与了IL10的作用(Chan等，2012；Cheung等，2013)。目前，在SHIP1^+/+和SHIP1^-/-小鼠中，显示IL10能够在体内抑制LPS诱导的炎性细胞因子/趋化因子的表达(图1A)，并发现IL10在SHIP1^+/+小鼠中抑制TNFα，但在SHIP1^-/-小鼠中不能抑制TNFα。之前已显示，SHIP1的磷酸酶活性受到其产物PI(3,4)P₂的变构刺激(Ong等，2007)。化合物I-1(以前被称为AQX-MN100)结合到与PI(3,4)P₂相同的SHIP1 C2结构域，并提高SHIP1的功能活性(Ong等，2007)。目前显示，化合物I-1能够在SHIP1^+/+小鼠中抑制LPS诱导的TNFα，但在SHIP1^-/-小鼠中不能抑制LPS诱导的TNFα，这表明这些化合物可以模拟IL-10的抗炎性质，并且确实对SHIP1是特异性的(图1B)。

不希望受到理论限制，SHIP1和STAT3在介导IL10的作用中可以独立地或共同起作用。为了帮助区分这两种可能性，使用连续流动细胞培养系统，来评估在SHIP1和STAT3野生型和敲除的骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中TNFα生产的动力学。LPS刺激了两个TNFα表达峰，一个在1小时左右，另一个在3小时(图1C)。IL10在SHIP1^+/+和STAT3^+/+细胞中均降低了TNFα水平，但在STAT3^-/-和SHIP1^-/-细胞中抑制1小时峰上均是完全受损的，并在两种KO BMDM中抑制3小时峰上是部分受损的。这种一致的无响应模式表明SHIP1和STAT3配合。

图1示出了，腹腔内注射1h所指示浓度的LPS、LPS+IL10(图A)或LPS+化合物I-1(ZPR-100或ZPR-MN100或MN-100)(图B)的SHIP1^+/+或SHIP1^-/-小鼠的血清TNFα水平。数据代表n≥4的平均值。当与仅LPS刺激的小鼠相比时，*p<0.05，**p<0.01，ns＝不显著。图C示出了在连续流动装置中，在180min的过程中用LPS(虚线)或LPS+IL10(实线)刺激STAT3^+/+、STAT^-/-、SHIP1^+/+和SHIP1^-/-骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。每5min收集级分用于测量TNFα水平。数据代表了两个独立实验。

实施例2.IL10在巨噬细胞中诱导SHIP1和STAT3的物理联合

SHIP1和STAT3蛋白都存在于静息细胞的细胞质中，并响应于细胞外刺激，通过的不同机制被募集到细胞膜。STAT3主要起到转录因子的作用(Matsuda等，2015)，而SHIP1最为人熟知的是其脂质磷酸酶活性(Pauls和Marshall，2017)。然而，SHIP1也可以作为停靠蛋白或衔接蛋白，用于信号传导复合物的组装(Pauls和Marshall，2017)。事实上，已发现一种具有最低磷酸酶活性的SHIP1型式(3PT)(An等，2005)介导IL10对LPS刺激的TNFα生产的抑制作用(图2A)，因此研究了SHIP1是否可以在IL10信号传导中起到衔接蛋白的作用，并在对IL10响应中与STAT3相关联。图2B显示了，用IL10处理细胞导致SHIP1与STAT3的共沉淀。即使STAT3变得与对IL10响应相同程度的酪氨酸磷酸化，IL6也不能诱导STAT3与SHIP1关联。值得注意的是，用小分子SHIP1变构调节物化合物I-2处理细胞，足以诱导SHIP1和STAT3的联合(图2B)。化合物I-2诱导SHIP1和STAT3联合的能力表明，化合物I-2的结合可能诱导构象变化，其可以改变SHIP1与其他蛋白质的联合。为了观察SHIP1/STAT3相互作用是否在完整细胞中发生，生成了Clover-SHIP1和mRuby2-STAT3融合蛋白构建体并将它们转导到J17SHIP1^-/-细胞中进行FRET分析。图2C显示，用IL10或化合物I-2(而不是IL6)刺激Clover-SHIP1/mRuby2-STAT3细胞提高了Clover-mRuby2 FRET信号，这表明SHIP1和STAT3在体内相互作用。

SHIP1和STAT3都具有SH2结构域，并且已报道两者在酪氨酸残基上都发生磷酸化，因此复合物的形成可能通过磷酸化酪氨酸/SH2相互作用来介导。由于图2B显示STAT3不是必须被磷酸化才能与SHIP1结合(参见I-2泳道)，因此研究了SHIP1上的酪氨酸残基是否可能发生磷酸化以与STAT3 SH2结构域相互作用。在STAT3 SH2结构域识别序列的背景中，SHIP1中存在4个酪氨酸残基。构建了其中这些残基各自替换成苯丙氨酸的SHIP1突变体，将它们在J17 SHIP1^-/-巨噬细胞系中进行表达，并测试IL10在这些细胞中抑制TNFα表达的能力(图3A)。表达Y190F突变体的细胞的表现类似于SHIP1^-/-细胞(图3A)。响应于IL10和化合物I-2，Y190F突变体与STAT3相互作用的能力降低了2倍(图3B和3C)，表明一部分SHIP1与STAT3的相互作用需要SHIP1 Y190的磷酸化。

还评估了SHIP1和STAT3在原代细胞中的亚细胞定位。用IL10或化合物I-2刺激野生型、SHIP1^-/-或STAT3^-/-腹腔巨噬细胞，并用针对SHIP1或STAT3的抗体染色。图4A和图4B显示，在野生型细胞中，IL10或化合物I-2在2min时诱导SHIP1和STAT3的膜关联。SHIP1在STAT3^-/-细胞中不发生移位，并且STAT3在SHIP1^-/-细胞中不发生移位(图4B)。在20min时，发现SHIP1和STAT3均存在于野生型细胞的核中，并且移位需要细胞表达STAT3和SHIP1。因此对于SHIP1和STAT3移位而言，化合物I-1可以模拟IL10。

实施例3.SHIP1在变构调节物结合后经历构象变化

为了更好地理解小分子变构调节物与SHIP1的相互作用，产生了截短的SHIP1蛋白用于X-射线晶体学(图5)，其中截短的SHIP1蛋白含有受变构调节的磷酸酶活性所需的最小SHIP1区域。全长SHIP1不能表达出足以用于晶体学的量，因此定义了变构激活所需的SHIP1的最小区域。以前已显示C2结构域结合SHIP1变构调节物(PI(3,4)P₂、化合物I-1)，并且可能涉及磷酸酶结构域N-端的PH-R结构域(Ong等，2007)。表达了全长SHIP1蛋白(其只能在哺乳动物293T细胞中产生)、PPAC蛋白(其含有PH-R-磷酸酶-C2结构域，并且可以在293T细胞和大肠杆菌中表达)和PAC1/PAC2蛋白(其含有磷酸酶-C2结构域，并且可以在大肠杆菌中表达)(图5A)。检查了它们的酶(磷酸酶)动力学性质和被化合物I-1激活的能力。已发现，293T和大肠杆菌来源的PPAC具有相同的酶学性质(图5B)，并且所有四种蛋白质(全长SHIP1、293T来源的PPAC、大肠杆菌来源的PPAC和PAC2)均可以被化合物I-1激活(图5C)。

只有PAC1和PAC2蛋白可以以结构研究所需的量表达，因此这些蛋白质被生产出来用于条件筛选，以产生质量足以用于结构确定的晶体。这包括制造表面熵降低的型式(Derewenda,2004；Goldschmidt等，2007)，命名为PAC1-cc和PAC2-cc，其中PAC1和PAC2中的三个谷氨酸残基被替换成丙氨酸。对几种PAC1-cc和PAC2-cc晶体的结构进行了解析，并且可以在PDB中获得(PDB ID 6DLG)，表1中示出了以

分辨率衍射的PAC2-cc晶体的数据。使用小角度X-射线散射数据(SAXS)生成了含有和不含化合物I-1的PAC1模型。通过SAXS确定的不含配体的PAC1溶液构象证实了X-射线晶体结构。

表1.PAC2-cc晶体的数据

*括号内列出了最高分辨率壳的值

此外，SAXS分析显示化合物I-1与PAC1的结合导致其整体构象的变化。

使用分子建模(Fuqiang等，2018)鉴定了PAC2中用于化合物I-1和I-2的潜在结合口袋。预测该口袋中的K681残基参与结合化合物I-1和I-2，因此产生了PAC2的K681A点突变，并使用生物层干涉分析(BLI)测试了野生型和PAC2-K681A结合化合物I-2的能力。如图6A中所示，假设的口袋中的K681A替换损害了化合物1-2和PI(3,4)P₂与PAC2结合的能力。评估了K681A替换对全长SHIP1介导IL10抑制巨噬细胞的能力的影响。图6B显示，在表达野生型(但不是K681A)SHIP1的细胞中，IL10高效抑制TNFα的产生。

Stenton等人描述了一种被称为AQX-1125的分子(结构在图7A中，后来给出了临床试验名称Rosiptor)是SHIP1激动剂(Stenton等，2013a；Stenton等，2013b)。然而，AQX-1125/Rosiptor具有小的增强SHIP1磷酸酶的活性(Stenton等，2013b)，并显示出与使用化合物I-1时观察到的(Ong等，2007)不同的酶动力学性质(Stenton等，2013b)。Stenton等人使用闪烁迫近测定法研究了氚代AQX-1125/Rosiptor与SHIP1蛋白的结合，但难以评估他们观察到的～300cpm信号的重要性。因此在这里，在BLI测定法中比较了PI(3,4)P₂、化合物I-2和AQX-1125/Rosiptor与SHIP1结合的能力(图7B)，发现与化合物I-2或SHIP1的天然激动剂PI(3,4)P₂相比，AQX-1125/Rosiptor与SHIP1的结合非常弱。

实施例4.在IL-10^-/-小鼠结肠炎模型中缓解炎症

为了显示本公开的化合物的体内抗炎作用，将示例性化合物I-1施用到IL-10敲除小鼠结肠炎模型(Keubler 2015)。IL10敲除小鼠在用正常肠道菌群定殖时发生结肠炎，这是因为IL10对于缓和宿主对肠道共生细菌的免疫应答是必需的(Keubler 2015；Kuhn1993)。通过用正常的、无特定病原体的小鼠的新鲜分离的结肠内含物接种IL10-/-小鼠并允许炎症发展6周，在这些小鼠中引发结肠炎(Sydora 2003)。然后将小鼠用媒介物、2mg/kg化合物I-1或0.4mg/kg地塞米松(用作阳性对照的甾类消炎药)治疗3周，然后收集结肠组织进行分析。从小鼠以及未接种菌群的小鼠(无结肠炎组)的近端、中段和远端结肠制备苏木精和曙红染色的切片(图8A)。两位对治疗组不知情的研究人员根据黏膜下水肿、免疫细胞浸润、杯状细胞的存在和上皮完整性对所述切片进行评分(图8B)。在诱导结肠炎的三个组中，地塞米松和化合物I-1组的病理评分显著低于媒介物组(图8B)。从所有四个组的结肠制备RNA，用于分析IL17和CCL2(在结肠炎中升高的炎性介质)的表达(Lee 2007)。如图8C中所示，化合物I-1和地塞米松治疗均显著降低了IL17和CCL2 mRNA的水平。这些数据表明，在由IL10丢失引起的结肠炎中，化合物I-1治疗可以减轻炎症。发现了化合物I-1在降低结肠炎症的组织学和分子标志物方面与地塞米松同样有效。

实施例5.讨论

IL6和IL10分别对巨噬细胞具有相反的促炎和抗炎作用(Garbers等，2015；Yasukawa等，2003)，但两种细胞因子均刺激细胞中的STAT3的Y705发生酪氨酸磷酸化。发现IL10(但不是IL6)诱导STAT3与SHIP1的联合，并表明这种差异可能造成了为什么STAT3可以介导两种细胞因子下游的促炎和抗炎反应。IL10诱导的SHIP1/STAT3信号传导支持抗炎反应，而IL6诱导的STAT3/STAT3二聚体支持促炎反应。Yasukawa等人对SOCS3敲除细胞的研究表明，巨噬细胞中STAT3激活的持续时间可能构成了IL10和IL6相反的生物学效应的基础(Yasukawa等，2003)。本发明的数据与他们的数据相容，因为STAT3激活也可以通过它与SHIP1的联合而被延长。

还探讨了STAT3如何可以介导相反的生物学反应的问题，以了解IL6与IL27对幼稚T细胞分化的相反作用。用IL6处理幼稚T细胞抑制Th1并增强Th2和Th17分化，而IL27处理则相反(Hirahara等，2015；Peters等，2015)。IL6和IL27均强烈地激活STAT3，但IL27比IL6更强烈地激活STAT1。Hirahara等人使用基因组方法得出结论，STAT3控制转录的整体强度，但STAT1的激活水平控制IL27特异性基因表达的表达(Hirahara等，2015)。Peters等人报告的观察与这个结论相一致，即如果STAT1被缺失，则IL6和IL27均刺激Th17分化(Peters等，2015)。

然而，IL10和IL6对巨噬细胞活化的相反作用不是由于STAT3或STAT1的不同用途造成的，因为这两种细胞因子诱导相似的STAT1和STAT3磷酸化(图9)。

以前已显示，小分子SHIP1激动剂在体外具有抗炎作用(Meimetis等，2012；Ong等，2007)，并将这些作用归因于刺激SHIP1的磷酸酶，以将PI3K的产物PIP₃去磷酸化成PI(3,4)P₂(Fernandes等，2013；Huber等，1999；Krystal,2000；Pauls和Marshall，2017)。然而，本公开的数据证实具有检测不到的磷酸酶活性的SHIP1蛋白足以介导IL10的抗炎作用，因此SHIP1的衔接功能本身可以支持IL10的作用。本公开的SAXS分析表明SHIP1激动剂与SHIP1结合引起SHIP1的构象变化。这种构象变化可能允许SHIP1与STAT3相互作用，并允许SHIP1/STAT3复合物移位到细胞核。介导SHIP1激动剂的变构作用所需的最小SHIP1结构域(PAC1/2)的结构被解析，并通过分子对接分析鉴定了药物结合口袋。预测参与化合物I-2结合的残基突变完全破坏了化合物I-2的结合，以及SHIP1在巨噬细胞中介导IL10抑制TNFα表达的能力。

发现了SHIP1 Y190对SHIP1与STAT3联合的能力有贡献。与野生型SHIP1相比，Y190F突变体与STAT3相互作用的能力降低2倍(图3B)。然而，SHIP1 Y190F完全破坏了其支持IL10抑制TNFα的能力(图3A)。不希望受到理论限制，一种解释是一部分SHIP1/STAT3复合物的抑制在生理上是重要的，因为完全破坏了对TNFα的抑制。或者，形成SHIP1/STAT3复合物仅仅是Y190的一个功能。SHIP1激动剂化合物I-1本身可以诱导SHIP1/STAT3复合物的形成。向perimacs添加化合物I-2也可以诱导SHIP1和STAT3向细胞核的移位。这些数据合在一起表明，SHIP1激动剂的作用包括它们刺激SHIP1磷酸酶活性和诱导SHIP1与STAT3联合这两种能力。

在本研究和以前的研究中，用化合物I-1或I-2处理巨噬细胞足以在体外引发与IL10相似的抗炎作用(Chan等，2012；Cheung等，2013；Ong等，2007)。因此，将化合物I-1在小鼠结肠炎模型中进行了测试，因为IL10在结肠炎中的有益抗炎作用是通过IL10对巨噬细胞的作用(Friedrich等，2019；Ouyang和O’Garra，2019；Shouval等，2014b；Zigmond等，2014)。发现了化合物I-1在降低结肠炎症的组织学和分子标志物方面与地塞米松同样有效。Medzhitov的研究组最近报告了，IL10刺激线粒体自噬和炎性体失活作为其在结肠炎中的保护作用的一部分，并且这涉及DDIT4蛋白的STAT3依赖性上调(Ip等，2017)。在这里已证实，IL10在巨噬细胞中上调DDIT4需要STAT3和SHIP1；此外，化合物I-2本身能够诱导DDIT4表达。

最近在临床试验中测试了小分子SHIP1变构调节物(AQX-1125/Rosiptor)(Stenton等，2013a；Stenton等，2013b)在缓解间质性膀胱炎(IC)患者经历的膀胱疼痛中的效果(Nickel等，2016)。据报道，选择IC作为疾病适应症是因为：AQX-1125/Rosiptor在膀胱中积累(Stenton等，2013b)，两篇论文暗示IC中存在PI3K依赖性炎症(Liang等，2016；Qiao等，2014)，并且初步的2期试验似乎是有希望的(Nickel等，2016)。然而，3期试验未能显示出AQX-1125/Rosiptor的功效(AQXP，2018)。在药物开发过程中小分子药物失败存在很多原因。然而，值得注意的是，均未暗示IL10和SHIP1参与IC的生理学/病理生理学。此外，发现了AQX-1125/Rosiptor与SHIP1的结合非常弱，这与Stenton’s等人的发现相一致，即AQX-1125具有非常弱的SHIP1磷酸酶激活活性(Stenton等，2013b)。

由此可以看出，为其开发小分子SHIP变构调节物的疾病适应症应该是一些其中IL10(或SHIP1的其他生理调节物)(Chan等，2012；Cheung等，2013；Dobranowski和Sly，2018；Pauls和Marshall，2017)已显示出有益作用的疾病。这些小分子还应该具有与SHIP1的天然配体PI(3,4)P₂相似的与SHIP1结合的性质。根据这些标准，诸如Pelorol家族的小分子SHIP1激动剂可用于治疗人类炎性肠病。

实施例6.在小鼠模型中抑制MM

将表达萤火虫萤光素酶的MM.1S细胞与Matrigel基底膜一起注射到NOD/SCID小鼠的上胁部并允许其建立2周。通过饮用水施用化合物I-1或媒介物(n＝4)(如通用方法中所述)。获取用对照和化合物I-1治疗的小鼠的生物发光图像并示出在图10A中。肿瘤体积使用生物发光成像来定量，并示出在图10B中。向带有MM肿瘤的小鼠施用化合物I-1有效减小了肿瘤块。

实施例7.化合物在保护肝损伤方面的功效

伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝损伤模型是免疫介导的肝损伤模型，类似于人类中的病毒和自身免疫性肝炎。已知在小鼠中静脉内递送ConA能激活T细胞，导致炎性细胞因子例如TNF-a、IFN-r和IL-6的增加，以及抗炎性细胞因子IL-10的减少。T细胞在肝中的浸润引起肝细胞凋亡和坏死的结果，导致血浆中的肝酶ALT和AST的水平升高(Zhou 2015)。

方法：将5组(每组n＝5)C57小鼠用单独的空白对照、单独的化合物I-1(10mg/kg/d)、ConA(15mg/kg)、ConA+化合物I-1(3mg/kg/d)或ConA+化合物I-1(10mg/kg/d)治疗。在每种情况下，在ConA注射(如果适用的话)前5天，通过口饲管每天两次施用化合物I-1。在最后一次施用后1小时，静脉内递送ConA(15mg/kg)。在ConA注射后12小时，从眼获取眼眶血，并通过分析仪进行酶生物化学(血浆)和血细胞类型化验。

结果：如图11的A至D中所示，15mg/kg的ConA显著提高了ALT、AST、TBIL和BUN的水平(图11A至11D)。化合物I-1(MN-100)显著降低ALT、AST、TBIL和BUN的水平(*P<0.05)，证实了在ConA诱导的肝损伤中的抗炎效果。在一起施用地塞米松(0.5mg/kg/d)与ConA作为阳性对照的重复实验中，确定了ALT和AST的血浆水平(图11的E和F)。可以看到，与阳性对照地塞米松类似，化合物I-1显著降低ConA诱导的ALT和AST水平。

实施例8.SHIP1激动剂用于在小鼠盲肠结扎和穿刺(CLP)模型中治疗重症脓毒症

小鼠CLP模型是用于抗脓毒症药物测试的公认的临床相关的方法。手术操作包括打开小鼠腹部、结扎盲肠并用针穿刺结扎的盲肠。遵照Rittirsch，2009的方法诱导中至高等级的实验性脓毒症，在CLP手术后7天内实现70～100％的存活率。

方法：设计了5组(每组n＝10)小鼠，分别为(1)空白对照，(2)假手术对照(进行腹部手术，但没有盲肠结扎/穿刺)，(3)CLP组(进行手术并且盲肠结扎/穿刺)，(4)CLP+化合物I-1(MN100)(3mg/kg/d)，和(5)CLP+化合物I-1(MN100)(10mg/kg/d)。ZPR-MN100(化合物I-1)在CLP手术前3天施用并继续施用到CLP后7天。ZPR-MN100每天两次通过口饲管递送。在CLP后24小时，在无菌环境下取尾血进行血液培养，以证实CLP手术后的脓毒性感染。每天记录小鼠的状况和存活率。在CLP后7天终止实验，并使用GraphPad Prism绘制存活曲线。

结果：如图12中所示，在CLP手术后24小时，从CLP手术组(图12B)但未从空白对照(图12A)或假手术对照(图12C，小鼠仅接受皮肤切开和伤口闭合但未进行盲肠结扎或穿刺)的血液培养形成细菌菌落，证实了CLP模型建模成功。化合物I-1以口服递送剂量依赖性地保护小鼠免于CLP诱导的死亡(图13)。没有化合物I-1治疗的CLP组的7天存活率为20％(图13A)。而化合物I-1能够以剂量依赖性方式将存活率提高到50％小鼠存活(相比于没有药物的CLP组中的20％存活率)。

实施例9.刺激IL-10/IL-10R通路作为过敏和哮喘的治疗

已确定，IL-10在抑制过敏性炎症中发挥非常重要的作用，并防止过敏性气道疾病和哮喘的发生(Hawrylowicz等，2005；Coomes SM等，2015)。过敏性鼻炎(AR)是一种普遍存在的炎性气道疾病，尚无有效的治疗方法。在小鼠模型中，在OVA诱导的AR模型中，施用重组IL-10似乎减少了AR小鼠鼻黏膜中嗜酸性粒细胞和肥大细胞的数量(Wang等，2014)，表明IL10/IL10R通路是AR治疗的有效靶点。小分子SHIP1激动剂例如化合物1-2(ZPR-151)可用于通过激活IL-10/IL10R通路来抑制鼻炎性反应。

尽管已参考实施例对本公开进行了描述，但应该理解，权利要求书的范围不应受到实施例中所阐述的实施方式的限制，而是应该被提供与作为整体的说明书相一致的最宽泛的解释。

所有出版物、专利和专利申请整体通过参考并入本文，其程度等同于每个单独的出版物、专利和专利申请被具体且单独地指明整体通过参考并入本文。在发现本公开中的术语与在通过参考并入本文的文献中的定义有所不同的情况下，将本文提供的定义用作该术语的定义。

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Claims (26)

1.式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物在治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1激活治疗的疾病、障碍或病症中的用途

或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，

其中R¹选自H、OH、OC_1-3烷基、OC(O)C_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基、N琥珀酰亚胺和NHC(O)C_1-3烷基；

其中R²、R³、R⁴和R⁵独立地选自H、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基；或者R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵与它们附连到的原子合在一起形成取代或未取代的5或6元杂环，所述取代或未取代的5或6元杂环包含至少一个NH和任选的选自N、O和S的一个或多个额外的杂原子；并且

其中当R²和R³、R³和R⁴或R⁴和R⁵合在一起形成所述取代或未取代的5或6元杂环时，R⁴和R⁵、R²和R⁵或R²和R³分别独立地选自H和C_1-3烷基。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述式I的化合物是式IA的化合物

或其对映异构体或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中R¹选自H、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基、N琥珀酰亚胺和NHC(O)C_1-3烷基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中R²和R⁴是H，并且R³和R⁵选自OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO2C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基。

5.根据权利要求4所述的用途，其中R³和R⁵选自OH、CH₃、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃。

6.根据权利要求4或5所述的用途，其中R³选自OH、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃；并且R⁵是CH₃。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中R²、R⁴和R⁵是H，并且R³选自OH、OC_1-3烷基、NH₂、NHC_1-3烷基、NHSO₂C_1-3烷基和NHC(O)C_1-3烷基。

8.根据权利要求7所述的用途，其中R³选自OH、OCH₃、NHSO₂CH₃和NHC(O)CH₃。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述取代或未取代的5或6元杂环选自

10.根据权利要求1至3和9中任一项所述的用途，其中R²和R³与它们附连到的原子合在一起形成所述取代或未取代的5或6元杂环，并且R⁴和R⁵独立地选自H和C_1-3烷基。

11.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述式I的化合物选自：

及其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

12.权利要求1至11中任一项中所定义的式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，其中所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物被配制在组合物中，其中所述组合物包含所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物和可药用载体。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症选自炎性肠病(IBD)、多发性骨髓瘤、过敏、赘生性障碍例如结肠癌、脓毒症、器官损伤、创伤、心血管疾病、骨质疏松症和睡眠障碍。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述IBD选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。

16.根据权利要求14所述的用途，其中所述器官损伤是肝损伤，任选地所述肝损伤选自病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和肝同种异体移植排斥。

17.根据权利要求14所述的用途，其中所述由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症是多发性骨髓瘤。

18.根据权利要求14所述的用途，其中所述脓毒症是重症脓毒症，任选为由COVID-19引起的重症脓毒症。

19.一种治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至11中任一项中所定义的式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症如权利要求14至18中任一项中所定义。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物被配制在组合物中，其中所述组合物包含式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物和可药用载体。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

23.权利要求1至11中任一项中所定义的式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物，其用于治疗由SHIP1介导的或能通过SHIP1的激活治疗的疾病、障碍或病症。

24.根据权利要求23所述的化合物，其中所述疾病、障碍或病症如权利要求14至18中任一项中所定义。

25.根据权利要求23或24所述的用途的化合物，其中所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物被配制在组合物中，其中所述组合物包含所述式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物和可药用载体。

26.一种权利要求1至11中任一项中所定义的式I的化合物或其可药用盐、溶剂化物、前药和/或衍生物。

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