CN115948929B - 一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用。果胶裂解酶PMGL‑Ba是一种可直接作用于高度甲基化果胶的果胶酶，通过β‑消除反应有效裂解聚半乳糖醛酸的α‑1,4‑糖苷键，生成果胶寡糖，并且不会产生剧毒甲醇，具有酶选择性好、副产物少、反应条件温和、效率高等优点。该酶可以在毕赤酵母中高效表达，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用，环境友好，条件适配性高等特点。本发明同时提供了多种酶复配方案，用于制浆造纸中胶黏物处理时，能显著提高纸张的物理性能，降低电导率与浊度，是潜在的新型造纸复合酶制剂。

Description

一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程与制浆造纸领域，特别涉及一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用。
背景技术
全球纸浆和造纸工业持续增长，预计到2027年全球纸浆市场价值将增长超过6000亿美元。废纸是我国造纸产业重要的纤维原料，占比接近60％，使用废纸做成的再生纸浆有助于资源的循环利用，更有利于国内造纸产业可持续发展需求。随着废纸回用次数的增加，造成胶黏性物质急剧增多，带来成纸品质下降、以及纸机停机频率增加等实际问题。解决废纸二次加工过程中存在胶黏物累积等问题，是实现再生浆品质提升的关键技术。
胶黏物是指再生浆回用过程中出现的具有黏性、柔软性及疏水性的有机物质，通常是多种物质的组合，主要包括树脂、粘合剂、热熔物、压敏物、施胶剂和油墨残留物等，主要成分有果胶、聚醋酸乙烯酯(PVAc)、聚丙烯酸酯、丁苯橡胶(SBR)、乙烯醋酸乙烯酯(EVA)、等。胶黏物具有粘附性、亲脂性、表面负电性以及性变形等特点，很容易黏附和沉积在纸机系统的相应部位，如在成型网部出现粘性物质堵塞、在烘干部的烘缸上呈现胶黏性片状或条状胶黏物粘缸。因此会带来多频次的停机、更换刮刀频次增多，且所制作出来的成纸洞眼增多、纸张黑点增多、品质下降、以及成型网、毛布更换时间缩短等不利现象。目前去除和控制浆料中胶黏物的方法主要采用物理法、化学法和生物法。物理法主要通过筛选、净化、热分散、机械处理等方式除去大部分大胶黏物和部分微细胶黏物，但是对机械设备的选型和工艺流程的设计有着比较高的要求，并且存在高耗能、低效率等问题。化学法是通过往浆料中添加各类化学品来控制胶黏物，其所产生的化学垃圾在回用白水中积累，对纸机系统的正常运转和造纸白水的封闭循环有着不良影响，并且容易产生大量工业废水。
生物酶具有效率高、环境友好等显著优势，以生物酶为基础的生物造纸技术是实现造纸行业技术改造升级和绿色健康发展必然趋势。目前市面上销售的胶黏物控制用酶主要集中在酯酶和脂肪酶，如巴克曼公司开发的酯酶Optimyze系列，诺维信公司的胶黏物控制酶等。它们都属于羧酸酯水解酶，可断裂部分胶黏物组成中的酯键，使其黏附物体积变小及黏附效率减弱，且被分解的胶黏物很难再重新聚合成大颗粒。现有的胶黏物控制酶专利也以酯酶、脂肪酶为主，如CN106368035A公开了一种高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法；公布号CN109666661A提供了一种去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂，改造了高温脂肪酶；公布号CN114591931A则说明了一种乙酰木聚糖酯酶克隆表达及其在造纸胶黏物控制中的应用等；另外多酶复配降解胶黏物的专利也主要采用酯类酶为主要酶制剂，如CN109957558A介绍中性酯酶的制备方法及用于废纸造纸工艺，CN110983849A选用脂肪酶与角质酶为胶黏物控制酶试剂。虽然脂肪酶及酯酶有一定的胶黏物去除效果，但造纸浆料中的黏性物质的种类多，组成变化大。单依靠脂肪酶、酯酶降解胶黏物，由于生物酶底物的选择性，其有效性只局限于某一种或某一类黏性材料，因此，目前的生物酶对胶黏物控制的效果不理想，需要找寻新的酶种以不同的作用方式协同去除胶黏物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法。果胶裂解酶PMGL-Ba能够耐受中/高温高碱条件，高效去除胶黏物，提高纸浆的品质，且能够与多种酶复合用于再生浆生产过程中的胶黏物控制，同时该方法具有环境友好、生产成本低、工艺简单等特点，适合工业化生产。
本发明的另一目的在于，提供上述方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法，包括以下步骤：
在再生浆中加入酶，处理后得到低胶黏物的纸浆；
所述的酶包括果胶裂解酶PMGL-Ba，其氨基酸序列的NCBI数据库登记号为WP_009329358.1。
所述的再生浆为旧瓦楞纸箱、书刊杂志纸、旧报纸、纸箱厂的边角料、印刷厂的白纸切边、水泥袋、混合废纸及杂废纸中的至少一种为原料制备的再生浆；优选为废旧箱板纸制备的再生浆料。
所述的再生浆的纸浆浓度为2～6％；优选为2％。
所述的处理的条件为pH5.0～11.0，温度30～90℃；优选为pH7～8，温度50～60℃；进一步优选为pH8.5，温度60℃。
所述的处理的时间为1～3h；优选为3h。
所述的处理为搅拌处理，转速为100～300rpm；优选为200rpm。
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba的加入量为2～50U/g，以再生浆的绝干质量计；优选加入量为44U/g。
所述的酶还包括脂肪酶、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、淀粉酶、甾醇酶、木聚糖酶、酯酶中的至少一种；优选为还包括脂肪酶和果胶酸裂解酶。
所述的脂肪酶的EC号为EC 3.1.1.3。
所述的脂肪酶的加入量为20～30U/g，以再生浆的绝干质量计。
所述的果胶酸裂解酶的氨基酸序列的Genbank数据库登记号为Genbank:AB428424.1。
所述的果胶酸裂解酶的加入量为2～5U/g，以再生浆的绝干质量计。
所述的淀粉酶的EC号为EC 3.2.1.1。
所述的淀粉酶的加入量为200～400U/g，以再生浆的绝干质量计。
所述的甾醇酶的氨基酸序列的GenBank数据库登记号为GenBank:AKZ66521.1。
所述的甾醇酶的加入量为10～30U/g，以再生浆的绝干质量计。
所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶与果胶裂解酶PMGL-Ba复配得到；优选为按酶活比20～30:2～4:2～50复配得到。
所述的酶为果胶酸裂解酶、淀粉酶与果胶裂解酶PMGL-Ba复配得到；优选为按酶活比2～4:200～400:2～50复配得到。
所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶、淀粉酶、甾醇酶与果胶裂解酶PMGL-Ba复配得到；优选为按酶活比20～30:2～4:200～400:10～30:2～50复配得到。
所述的低胶黏物的纸浆为白水浊度和电导率低的纸浆。
所述的果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法在造纸中的应用。
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba的氨基酸序列为一种多肽序列包含与SEQ ID NO.1具有至少90％的序列同一性；优选地，与SEQ ID NO.1具有至少95％，最优选至少100％的序列同一性的多肽；包括一种源自SEQ ID NO.1的多肽，其通过取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸，对其进行改造，同源性在90％以上。
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba为密码子优化后的编码基因核苷酸序列经构建真核重组表达载体转入毕赤酵母发酵后的上清液经层析后得到。
所述果胶裂解酶PMGL-Ba上清液酶活可达200～500U/mL，工程菌所产蛋白可达0.4～0.9g/L。优选的，上清液酶活可达440.0U/mL，工程菌上清所产蛋白可达0.89g/L。
所述的层析包含阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析中的至少一种。优选的，所述层析为Ni-NTA亲和层析。
优选的，所述的真核重组表达载体的出发载体包括但不限于pPICZαA。
优选的，所述的毕赤酵母包括但不限于毕赤酵母X33。
优选的，单独使用果胶裂解酶PMGL-Ba能达到去除胶黏物、改善纸张质量的目的。
更为优选的，多酶联合使用时可更好地降解胶黏物，提高纸张物理性能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
果胶裂解酶PMGL-Ba是一种可直接作用于高度甲基化果胶的果胶酶，通过β-消除反应有效裂解聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，生成果胶寡糖，并且不会产生剧毒甲醇，具有酶选择性好、副产物少、反应条件温和、效率高等优点。在制浆造纸工艺中，由于胶黏物在浆料体系中呈现负电性，因而可以吸附各种阳离子物质，降低阳离子聚合物吸附黏性物质的效率，从而加剧胶黏物沉积，因而也被称为“阴离子垃圾”，即溶解和胶体物质(Dissolvedand Colloidal Substances,DCS)，其中的主要物质包括甲基化果胶与聚半乳糖醛酸。因此果胶裂解酶通过降解DCS中的聚半乳糖醛酸来提高阳离子聚合物的效率并减少胶黏物的沉积，同时也可作用于胶黏物中的树脂等聚半乳糖醛酸类物质从而降解胶黏物。本发明旨在开发一种适用于工厂使用环境的中碱性、中高温果胶裂解酶，可特异性降解甲基化果胶，从而减少胶黏物沉积，其与酯酶、木聚糖酶等联合使用效果更佳，且生产成本低，工艺简单，更适合工业化生产。
本发明采用真核表达的方法，获得了重组芽孢杆菌来源的果胶裂解酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。
本发明中的果胶裂解酶PMGL-Ba可以应对再生浆生产过程中的中高温以及中碱性环境，在较高温度下仍能保持较好的胶黏物去除效果。
本发明提供了一种果胶裂解酶处理造纸胶黏物的方法，该酶可单独使用，也可以与其他种类酶复配使用，能显著提高纸张的物理性能，降低浊度和电导率，是一种潜在的新型造纸用酶制剂，具体的，
本发明获得的果胶裂解酶PMGL-Ba，可有效降解多聚半乳糖醛酸类物质，改善阳离子聚合物效率，进而吸附更多胶黏物；
果胶裂解酶PMGL-Ba与酯酶、脂肪酶、木聚糖酶等复配使用，可水解纤维素和半纤维、纤维素和纤维素之间的黏连的物质，使纤维有效分离，增加纤维的渗透性，利于纤维充分吸水润涨，增强纸张抗张、撕裂、环压、耐破等物理性能。
附图说明
图1是实施例1中重组果胶裂解酶PMGL-Ba Ni-NTA亲和层析后SDS-PAGE分析结果图；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：纯化后获得的蛋白；泳道2：果胶裂解酶PMGL-Ba粗酶液。
图2是实施例2重组果胶裂解酶PMGL-Ba酶学性质法分析结果图；其中，A：最适反应pH；B：pH稳定性；C：最适反应温度；D：温度稳定性。
图3是实施例2中金属离子、试剂等对重组果胶裂解酶PMGL-Ba酶活的影响分析结果图；其中，A：金属离子、试剂对酶活的影响；B：常用造纸助剂对酶活的影响。
图4是实施例3中单一酶在再生浆胶黏物控制中的应用效果结果图；其中，A：电导率、浊度、阳离子需求量的指标结果；B：抗张与撕裂强度的指标检测；C：环压与耐破强度的检测结果。
图5是实施例6中复配酶在再生浆胶黏物控制中的应用效果结果图；其中，A：电导率、浊度的指标结果；B：抗张与撕裂强度的指标检测；C：环压与耐破强度的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
在所述实施例中，所述加酶量相对于绝干浆质量计算，实验结果均重复三次取平均数。本发明所使用的果胶裂解酶PMGL-Ba，来源于Bacillus菌种，其氨基酸序列如NCBI数据库ID WP_009329358.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例1一种重组果胶裂解酶PMGL-Ba的生产方法
利用全基因合成方法获取毕赤酵母密码子优化后的的果胶裂解酶PMGL-Ba的编码基因，优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由商业公司合成得到；利用限制性内切酶Eco R I和Not I双酶切目的基因PMGL-Ba以及载体pPICZαA，用同源重组方法进行连接，连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，获得重组大肠杆菌，对提取的重组质粒pPICZαA-PMBL-Ba进行Eco R I、Not I双酶切鉴定与测序。利用限制性内切酶DraI单酶切重组质粒，与酵母基因组发生整合，与HIS形成融合蛋白获得重组表达载体。利用电转化的方法将其转化至宿主细胞毕赤酵母X33中(具体步骤可参照文献High-Level Expressionand Biochemical Properties of A Thermo-Alkaline Pectate Lyase From Bacillussp.RN1 in Pichia pastoris With Potential in Ramie Degumming)，获得基因工程菌。
将筛选出来的毕赤酵母重组子接种于10mL BMGY液体培养基中，30℃，250rpm，振荡培养过夜；常温3000g离心2min后，收集菌体，将其转接至BMMY培养基中，转接后的菌液OD600为0.5～1.0；30℃，250rpm条件下继续培养24～144h，期间每隔24h取样并向培养基中添加甲醇至1.0％v/v，培养完成后，固液分离获得发酵上清液，得到粗酶液。使用AKTA蛋白纯化系统对获得的发酵上清液进行Ni-NTA柱层析。用含有50mM咪唑的20mM Tris缓冲液洗脱，用超滤管(Millipore)浓缩收集目标蛋白溶液，通过SDS-PAGE分析表明可获得纯的果胶裂解酶PMGL-Ba目的蛋白，蛋白产量可达0.89g/L，所得蛋白的氨基酸序列NCBI数据库ID为WP_009329358.1。(图1)。
实施例2果胶裂解酶PMGL-Ba酶学性质测定
1、酶活力的测定
取适量实施例1得到的果胶裂解酶PMGL-Ba溶液于10000rpm离心5min，适当稀释上清液，取出10μL至2mL 50mM的pH 8.5 Tris-HCl反应体系(含0.5％甲基化果胶)中，60℃反应10分钟，加DNS沸水浴显色，测定540nm处吸收值；以灭活酶液作为空白对照组。酶活定义为：在最适条件下，以每分钟水解底物生成1μmoL半乳糖醛酸所需酶量定义为一个酶活性单位为U。
2、最适反应条件测定
按照步骤1的酶活测定方法，将果胶裂解酶PMGL-Ba酶液(0.0089g/L，以蛋白质量计)置于不同的pH(6.0～11.0，60℃)和不同温度(50～70℃，pH8.5)下测定果胶裂解酶PMGL-Ba的酶活，确定其最适反应pH和最适反应温度，结果如图2A～B所示。
之后将酶液(0.0089g/L)置于不同pH(5.0～11.0)的缓冲液中，室温下处理12h，参照步骤1的方法测定残余酶活性，以研究果胶裂解酶PMGL-Ba的pH稳定性。将酶液(0.0089g/L)分别置于不同温度(30℃～90℃)中保温1h后，参照步骤1的方法测定其残余酶活力，确定其温度稳定性，结果如图2C～D所示。上述实验所用缓冲液pH 5.0～6.0采用50mM乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 7.0～9.0范围内采用50mM Tris-HCl缓冲液，pH 10.0～11.0采用50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
结果表明，果胶裂解酶PMGL-Ba的最适反应pH为8.5(图2A)；在pH 5.0～11.0范围内处理12h，能保持80％以上的酶活力(图2B)；最适反应温度为60℃(图2C)；在温度小于60℃时处理1h，重组果胶裂解酶PMGL-Ba能保持80％以上的酶活力(图2D)。因此，本发明的果胶裂解酶PMGL-Ba适配于造纸工艺环境。
3、金属离子、造纸助剂对酶活的影响
按照上述酶活测定方法，研究了2mM/5mM金属离子、表面活性剂SDS、金属离子螯合剂EDTA以及0.01％,0.001％的不同造纸助剂对重组果胶裂解酶PMGL-Ba酶催化活性的影响；参照步骤2的方法，在酶液(0.0089g/L)中分别加入2mM/5mM不同金属离子/造纸助剂，室温下处理12h，参照步骤1的方法测定残余酶活性。其中金属离子包括Ca2+、K+、Na+、Cu2+、Fe3+、Mg2+；8种常见造纸助剂及作用分别是：
CPAM，阳离子聚丙烯酰胺：纸张增强剂、助留助滤剂；
POE，聚氧乙烯：助留助滤剂，分散剂；
APAM，阴离子聚丙烯酰胺：助留助滤剂；
NPAM，非离子聚丙烯酰胺：助率剂；
CS，阴离子淀粉：助留助滤剂；
OS，氧化淀粉：胶粘剂，施胶剂；
PAE，聚酰胺环氧氯丙烷树脂：湿强剂；
AKD，聚烷基烯酮：施胶剂。
上述助剂的使用浓度一般为8～10KG/吨(绝干浆)。
结果如图3所示，实验数据表明，5mM浓度下的Ca2+,Fe3+,SDS明显抑制酶活，其中Fe3 +可降低85％酶活；Na+，2mM的Ca2+可促进酶活，其中Ca2+可使酶活增强至116％，其它金属离子或试剂对果胶裂解酶PMGL-Ba有轻微的促进作用或者基本无影响(图3A)。8种造纸助剂均不会损伤酶活，并且0.01％浓度下的CPAM、POE、APAM均可显著增强酶活(图3B)。因此，本发明制备的果胶裂解酶PMGL-Ba在常用的造纸助剂存在下是具有活性的和稳定的。
4、底物特异性分析
按照上述酶活测定方法，在50mM的Tris-HCl缓冲液条件下，将不同来源的0.5％(w/v)的包含聚半乳糖醛酸的物质作为底物，如不同来源植物果胶、聚半乳糖醛酸(PGA)、甲基化果胶、不同再生浆等，在60℃、pH 8.5条件下持续10分钟的反应，测试重组果胶裂解酶PMGL-Ba的底物特异性(0.0089g/L)。结果表明，果胶裂解酶PMGL-Ba可降解不同的果胶，也可降解甲基化果胶，对不同的再生浆也有一定的活性，因此，本发明的果胶裂解酶PMGL-Ba适合于再生浆生产过程中使用。
表1果胶裂解酶PMGL-Ba的底物特异性分析结果
0.5％底物 酶活(U/mL) 相对酶活(％)
PGA 15.24 3.04
苹果果胶 18.56 3.71
柑橘果胶 42.51 8.49
酯化果胶 500.47 100.00
果胶 1220.41 243.85
旧报纸 0.02 -
瓦楞纸箱-芯纸 142.25 28.42
瓦楞纸箱-内面纸 88.22 17.66
实施例3生物酶单独使用对胶黏物的处理
本实施例中再生浆料为回收的OCC箱板纸制备的再生浆料，称取绝干重量为20g的OCC浆板，加去离子水稀释浆浓至2％，分别添加不同使用量的生物酶如下：果胶裂解酶PMGL-Ba 44U/g(相对于绝干浆质量)；果胶酸裂解酶PEL 3U/g；内切纤维素酶EG1 3U/g；木聚糖酶XYN 175U/g；漆酶LacTT 0.05U/g；甾醇酯酶CHE 20U/g；淀粉酶Amy-K 300U/g。在各酶最佳的温度和pH值的条件下反应3小时，转速300rpm。具体的温度与pH如下：果胶裂解酶PMGL-Ba为温度60℃、pH 8.5；果胶酸裂解酶PEL为温度80℃、pH 10.0；内切纤维素酶EG1为温度60℃、pH 5.0；木聚糖酶XYN为温度70℃、pH 9.0；漆酶LacTT为温度90℃、pH 7.0；甾醇酯酶CHE为温度50℃、pH 7.0；淀粉酶Amy-K为温度50℃、pH 6.0。反应结束后收集浆料，平衡水分，利用凯塞抄纸系统抄纸，纸张定量80g/m2，采用白水循环模式，每个浆样3组平行样，最后一组平行样处收集白水，通过白水的浊度、阳离子需求量(CD)和电导率间接表征微细胶黏物的含量。实施例采用L&W抗张强度仪、L&W耐破度测定仪、L&W压溃测试仪、L&W撕裂度仪分别按照国家标准GB/T 12914-2008、GB/T 454-2002、TAPPI T810om-98、TAPPI T414om-12测定纸张的抗张强度、耐破强度、环压强度和撕裂强度，各试验的结果都是四组平行样的平均值。胶黏物检测分别用浊度仪测定白水的浊度，电导率仪测定粒径，PCD-03 PH颗粒电荷分析仪测得阳离子需求量，以此来间接表征微细胶黏物的含量。其中浊度能够间接的反映测试样品中的CS(胶体物质Colloid substances)含量；阳离子需求量/电导率可以反映胶体物质和溶解物质所带负电量的强弱，从而推断白水样品中的DS(溶解物)含量情况。在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为原料组。
结果图4表明，将单一酶应用在再生浆的处理中，除淀粉酶、甾醇酶处理后，纸张撕裂强度有明显下降外，其他纸张性能相较空白对照均有所提升；对于胶黏物去除效果，果胶裂解酶PMGL-Ba、果胶酸裂解酶、甾醇酶和淀粉酶处理后，白水中微细胶黏物含量均有明显降低。与果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)相比，果胶裂解酶PMGL-Ba应用在纸浆上，通过特异性降解甲基化的聚半乳糖醛酸，可大幅度提高纸张的撕裂强度，并且更少的降低了微细胶黏物的含量。因此，本发明的果胶裂解酶PMGL-Ba具有良好的制浆造纸应用潜力。
实施例4果胶裂解酶PMGL-Ba对工厂浆的胶黏物处理
本实施例中再生浆取自东莞某造纸厂的贮浆池，该废纸浆己经经过了碎浆、浮选工序，但尚未加入任何湿部添加剂。称取绝干重量为20g的工厂浆，加去离子水控制浆浓为2％，添加10U/g的果胶裂解酶PMGL-Ba酶液，处理温度为60℃，pH为7.2，处理时间1小时，搅拌转速为200rpm。完成反应之后，沸水中放置5分钟使酶失活，使用200目浆袋清洗纸浆，过滤，保持24h的均衡湿度备用。使用凯赛法自动抄纸机抄造定量为80g/m2的手抄片，成型后90℃下干燥10min。将手抄片在恒温恒湿实验室(温度(23±1)℃、相对湿度(50±2)％)放置12h后进行成纸强度检测。同时在凯赛法自动抄纸机分别取不同生物酶处理抄纸的白水，并以4℃保存。
按照实施例3的测定方法测定各项指标。结果表明，与原浆相比，果胶裂解酶PMGL-Ba应用后可增强纸张的各种物理性能，其中抗张强度可增强125％，撕裂强度可增强124％，环压强度可增强157％，耐破强度可增强132％；果胶裂解酶PMGL-Ba的使用同时也降低了微细胶黏物的含量，其中浊度可降低至47％，电导率可降低至97％。因此，本发明的果胶裂解酶PMGL-Ba单一使用也可处理再生浆中胶黏物，且增强纸张质量。
实施例5
本实施例中所用浆料与实施例4来源相同，称取绝干重量为20g的工厂浆，加去离子水控制浆浓为2％，添加5U/g的果胶裂解酶PMGL-Ba和5U/g的木聚糖酶共同反应，处理温度为60℃，pH为7.2，处理时间1小时，搅拌转速为200rpm。随后按照实施例3检测各项数值。
结果表明，与原浆相比，复合酶处理也可提高纸张物理性能，其中抗张强度可增强113％，撕裂强度可增强107％，环压强度可增强130％，耐破强度可增强106％；同时也降低了微细胶黏物的含量，其中浊度可降低至74％，与单一使用果胶裂解酶PMGL-Ba相比，复配使用生物酶可显著降低白水的电导率至84％。
因此本发明提供的果胶裂解酶PMGL-Ba可与木聚糖酶联用于工厂浆，可显著提高纸张物理性能，更好降低白水电导率。
实施例6生物酶联合使用对胶黏物的处理
本实施例中再生浆料为回收的OCC箱板纸，与实施例3来源相同。称取绝干重量为20g的OCC浆板，加去离子水稀释浆浓至2％，添加不同酶液进行复配处理，具体的：果胶裂解酶PMGL-Ba添加量为44U/g(相对于绝干浆质量)，脂肪酶ARL(EC 3.1.1.3)26.2U/g，果胶酸裂解酶PEL(GenBank Accession No.AB428424.1)3U/g，淀粉酶Amy-K(EC 3.2.1.1)300U/g，甾醇酶CHE(GenBank:AKZ66521.1)20U/g。处理温度为50℃，pH为7.2，处理时间3小时，搅拌转速为200rpm。后续检测指标及方法按实施例3进行表征。多酶联合使用控制胶黏物结果如图5所示。
其中，复配酶配方A指：脂肪酶ARL，果胶酸裂解酶PEL，淀粉酶Amy-K；
复配酶配方B指：脂肪酶ARL，果胶酸裂解酶PEL，甾醇酶CHE；
复配酶配方C指：脂肪酶ARL，果胶酸裂解酶PEL，果胶裂解酶PMGL-Ba；
复配酶配方D指：果胶酸裂解酶PEL，淀粉酶Amy-K,甾醇酶CHE；
复配酶配方E指：果胶酸裂解酶PEL，淀粉酶Amy-K，果胶裂解酶PMGL-Ba；
复配酶配方F指：脂肪酶ARL，果胶酸裂解酶PEL，淀粉酶Amy-K，甾醇酶CHE；
复配酶配方G指：脂肪酶ARL，果胶酸裂解酶PEL，淀粉酶Amy-K，甾醇酶CHE，果胶裂解酶PMGL-Ba。
综合结果表明，在多酶联合处理再生浆中，在电导率处理方面，复配酶B效果最好，其次C、D和E也可降低电导率；浊度处理方面，复配酶C效果最好，其次D和F复配也有一定效果(图5A)。图5B为纸张抗张与撕裂强度分析，结果显示，在抗张强度方面，复配酶处理均降低了该指标；对撕裂强度，除E外，其余酶处理均增强该指标，其中F，G复配效果最好。图5C为环压与耐破强度分析，复配酶E，F，G处理均可轻微提高环压强度；A，B，C酶处理轻微降低了耐破强度。对比来看，果胶裂解酶PMGL-Ba复配脂肪酶、果胶酸裂解酶适用于胶黏物处理，果胶裂解酶PMGL-Ba复配脂肪酶、果胶酸裂解酶、淀粉酶、甾醇酯酶可用于增强纸张物理性能。因此，本发明的果胶裂解酶PMGL-Ba适用于与多种酶共同使用处理再生浆，降低胶黏物的含量同时也提升了纸张性能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法，其特征在于包括以下步骤：
在再生浆中加入酶，处理后得到低胶黏物的纸浆；
所述的酶包括果胶裂解酶PMGL-Ba，其氨基酸序列的NCBI数据库登记号为WP_009329358.1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的酶还包括脂肪酶、果胶酸裂解酶、淀粉酶、甾醇酶、木聚糖酶、酯酶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶与果胶裂解酶PMGL-Ba按酶活比20～30:2～4: 2～50复配得到。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的酶为果胶酸裂解酶、淀粉酶与果胶裂解酶PMGL-Ba按酶活比2～4:200～400: 2～50复配得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶、淀粉酶、甾醇酶与果胶裂解酶PMGL-Ba按酶活比20～30:2～4:200～400:10～30: 2～50复配得到。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的再生浆为旧瓦楞纸箱、书刊杂志纸、旧报纸、纸箱厂的边角料、印刷厂的白纸切边、水泥袋、混合废纸及杂废纸中的至少一种为原料制备的再生浆；
所述的再生浆的纸浆浓度为2～6%；
所述的处理的条件为pH5.0～11.0，温度30～90℃；
所述的处理的时间为1～3h；
所述的处理为搅拌处理，转速为100～300rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba的加入量为2～50U/g，以再生浆的绝干质量计。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的果胶裂解酶PMGL-Ba为密码子优化后的编码基因核苷酸序列经构建真核重组表达载体转入毕赤酵母发酵后的上清液经层析后得到。
10.权利要求1～9任一所述的果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法在造纸中的应用。
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