CN115948483B - 一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1‑6μmol/L的所述信号分子溶液混匀，得到混合液；将所述混合液在30‑35℃，200‑400转/分钟的条件下培养，培养结束后，得到所述聚羟基脂肪酸酯(PHA)。利用该方法生成的PHA产量高，有利于降低合成成本；且生成的PHA产物纯度高，最终PHA的干重可到60％以上，产物纯度高，大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。

Description

一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的 方法

技术领域

本发明涉及聚羟基脂肪酸酯合成领域，特别涉及一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法。

背景技术

传统的石油基塑料因其降解能力差，已经造成了严重的环境污染，因此，可生物降解塑料作为石油基塑料的环保替代品具有良好的应用前景。作为可生物降解塑料中的一种，聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是细菌合成的一种胞内聚酯，在细菌体内主要作为碳源和能源的贮藏性物质而存在，PHA具有类似于合成塑料的物化特性，以及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。PHA在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景，目前成为了塑料新材料领域的研究热点。

与传统的石油基塑料相比，目前广泛使用的细菌合成PHA的方法中底物成本高，PHA合成产量偏低；较低的产量使得后续提纯PHA的成本较高。因此，高昂的生产成本是制约PHA大规模生产应用的限制性因素。为了提高PHA的产量，利用基因工程改造现有的底盘菌又存在着基因泄露等安全风险。

因此，亟需寻找一种更安全有效、使细菌产生尽可能多地合成PHA的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，利用该方法生成的PHA产量高，有利于降低合成成本；且生成的PHA产物纯度高，最终PHA的干重可到60％以上，产物纯度高，大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1-6μmol/L的所述信号分子溶液混匀，得到混合液；将所述混合液在30-35℃，200-400转/分钟的条件下培养，培养结束后，得到所述聚羟基脂肪酸酯。

通过上述技术方案，由于群体感应是微生物中普遍存在的现象，群体感应作为细菌间交流的“语言”，通过分泌信号分子来感知细菌密度的变化，进而调控基因的表达，从而控制细菌的群体行为。因此群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制，细菌的群体感应具有增强微生物合成PHA的潜力。

具体表现为：微生物的群体感应系统通过分泌自诱导的信号分子调控微生物的代谢活动。微生物通过扩散性信号小分子(又称为自诱导物)与转录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子从细菌细胞扩散到环境中，一旦达到一个临界浓度(或者说达到某一特定的群体密度)，这些信号分子就可诱导调节一系列目标基因的表达，从而调控微生物的代谢活动。

进一步地，所述无机盐培养基的配方为1L去离子水加入NH₄Cl 0.5-0.6g，KNO₃2.1-2.17g，葡萄糖10.0-11.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 11.56-11.74g，KH₂PO₄2-2.5mg，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g，微量元素液0.1mL。

其中，所述微量元素液的配方(g/L)为乙二胺四乙酸二钠7-7.5，FeSO₄·7H₂O 2.5-3，MnCl₂·4H₂O 0.02-0.04，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3，CuCl₂·2H₂O0.1-0.1，ZnCl₂ 0.3-0.5。

进一步地，所述信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯。

进一步地，所述N-酰基高丝氨酸内酯为C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C16-HSL中的任意一种。

优选的，所述N-酰基高丝氨酸内酯为C16-HSL。

进一步地，所述细菌是属于副球菌属。

进一步地，所述属于副球菌属的细菌为脱氮副球菌，所述脱氮副球菌的菌种来自美国菌种保藏中心，编号为ATCC19367。

通过上述技术方案，脱氮副球菌相比于其他细菌的优势在于其PHA的积累能力强，并且兼具合成PHA和反硝化的功能，群体感应会对其PHA的合成和反硝化功能共同产生调节作用。

进一步地，所述细菌的菌种在使用前需要进行活化处理。

进一步地，所述活化处理步骤为，将所述菌种接种至TSB培养基中培养，得到OD值为1.0的菌悬液。

进一步地，所述菌种按照1-1.2％的接种量接种至TSB培养基。

进一步地，所述TSB培养基的配方(g/L)为胰酪胨17.0-18.0，氯化钠4.5-5.3，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0-5.0，磷酸氢二钾2.0-3.0，葡萄糖2.3-2.6。

进一步地，所述TSB培养基用蒸馏水配制而成，之后调节pH为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

进一步地，所述菌悬液按照1-1.2％的接种量接种至无机盐培养基。

进一步地，所述信号分子溶液所用的溶剂为二甲基亚砜或乙腈。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本申请中生成的PHA产量高，特别是当C16-HSL溶液的浓度为2μmol/L时，在48小时的摇瓶实验中，能达到1.1mg/mL产量，相比于未添加信号分子C16-HSL的空白组增产22％以上，有利于降低合成成本；

2、本申请中生成的PHA产物纯度高。本申请中提供的微生物方法合成PHA，最终PHA的干重可到60％以上，产物纯度高，这就大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。

3、信号分子C16-HSL可以促进PHA合成关键基因phaC的表达，因此可以大幅度促进脱氮副球菌PHA的合成。

4、信号分子C16-HSL可以提升能量载体ATP和电子供体NADPH的含量，促进微生物的合成代谢，进而增产PHA。

5、信号分子C16-HSL可以调节碳源的分配，使更少的碳源用于反硝化，更多的碳源用于合成PHA，从而促进PHA的合成。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为菌液中硝态氮的含量。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

另外，全文中的“和/或”包括三个方案，以A和/或B为例，包括A技术方案、B技术方案，以及A和B同时满足的技术方案；另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本申请实施例与对比例中所使用的菌株为脱氮副球菌，来自美国菌种保藏中心，编号ATCC19367，购买自北纳生物(北京)。

本申请中所用的到的TSB培养基、无机盐培养基、PBS溶液的配方如下：

TSB培养基配方(g/L)：胰酪胨17.0，氯化钠5.0，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0，磷酸氢二钾2.5，葡萄糖2.3。TSB培养基用蒸馏水配制而成，之后调节pH为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

无机盐培养基配方：1L去离子水加入NH₄Cl 0.58g，KNO₃ 2.17g，葡萄糖10.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 11.74g，KH₂PO₄ 2.44mg，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素液0.1mL。

其中，微量元素液配方(g/L)：乙二胺四乙酸二钠7.3，FeSO₄·7H₂O 2.5，MnCl₂·4H₂O 0.02，Na₂MoO₄·2H₂O 0.242，CuCl₂·2H₂O 0.135，ZnCl₂ 0.34。

PBS溶液配方(g/L)：KH₂PO₄ 0.24，Na₂HPO₄ 1.44，NaCl 8，KCl 0.2。

脱氮副球菌菌株在使用前需要进行活化处理，菌株活化步骤为：

以每100mL培养基中添加1mL脱氮副球菌菌株为标准，将保存在-20℃的脱氮副球菌菌株接种到灭菌后的TSB培养基之中，在30℃，200转/分钟的摇床中培养约12小时后，脱氮副球菌的OD值长到了1.0附近；之后用PBS溶液清洗两次之后，再用PBS溶液重悬，最终得到OD值为1.0的菌悬液。

实施例1

S1、将20mL的无机盐培养基置于50mL的三角瓶中，在110℃的条件下高温湿热灭菌20min，冷却至室温；

S2、将菌株活化后的菌悬液以每100mL无机盐培养基中添加1mL菌悬液的标准进行接种，接种之后将三角瓶摇晃均匀；

S3、取放置于-20℃冰箱中浓度为2μmol/L信号分子C16-HSL溶液(溶剂为二甲基亚砜)在冰上融化，之后吸取4μL的C16-HSL溶液加入到三角瓶中混匀；将三角瓶置于30℃，200转/分钟的恒温空气摇床中培养48小时。

整个实验过程需要在无菌操作台上进行。

实施例2与实施例1的区别在于，C16-HSL溶液的浓度为1μmol/L。

实施例3与实施例1的区别在于，C16-HSL溶液的浓度为4μmol/L。

实施例4与实施例1的区别在于，C16-HSL溶液的浓度为6μmol/L。

实施例5与实施例1的区别在于，4μL的C4-HSL溶液代替4μL的C16-HSL溶液。

实施例6与实施例1的区别在于，4μL的C8-HSL溶液代替4μL的C16-HSL溶液。

实施例7与实施例1的区别在于，4μL的C14-HSL溶液代替4μL的C16-HSL溶液。

对比例1与实施例1的区别在于，4μL的无菌二甲基亚砜代替4μL的C16-HSL溶液。

对比例2与实施例1的区别在于，C16-HSL溶液的浓度为0.5μmol/L。

对比例3与实施例1的区别在于，C16-HSL溶液的浓度为10μmol/L。

48小时摇瓶实验结束后，测算各实施例以及对比例所得到的菌液混合液中的PHA含量、phaC基因表达量、能量载体ATP、电子供体NADPH实验结果如表1所示，硝态氮的含量如图1所示。

表1实施例1-7、对比例1-3的试验结果

从表1和图1可以看出：

1、本申请中生成的PHA产量高，特别是当C16-HSL溶液的浓度为2μmol/L时，在48小时的摇瓶实验中，能达到1.1mg/mL产量，相比于未添加信号分子C16-HSL的空白组增产22％以上，有利于降低合成成本；

2、本申请中生成的PHA产物纯度高。本申请中提供的微生物方法合成PHA，最终PHA的干重可到60％以上(PHA的干重计算方法为：用液相色谱检测出PHA含量，再除以总干重)，产物纯度高，这就大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。

3、信号分子C16-HSL可以促进PHA合成关键基因phaC的表达，因此可以大幅度促进脱氮副球菌PHA的合成。

3、信号分子C16-HSL可以促进PHA合成关键基因phaC的表达，使得微生物体内PHA聚合酶的含量增加，促使更多的PHA前体物质聚合为PHA，因此可以大幅度促进脱氮副球菌PHA的合成。

4、信号分子C16-HSL可以提升能量载体ATP和电子供体NADPH的含量，促进微生物的合成代谢，进而增产PHA。

5、信号分子C16-HSL可以调节碳源的分配，使更少的碳源用于反硝化，在总的碳源摄取量不变的情况下，有更多的碳源用于合成PHA，从而促进PHA的合成。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1-6μmol/L的所述信号分子溶液混匀，得到混合液；将所述混合液在30-35℃，200-400转/分钟的条件下培养，培养结束后，得到所述聚羟基脂肪酸酯；

所述细菌为脱氮副球菌，所述脱氮副球菌的菌种来自美国菌种保藏中心，编号为ATCC19367；

所述信号分子为C16-HSL。

2.根据权利要求1所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述细菌的菌种在使用前需要进行活化处理。

3.根据权利要求2所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述活化处理步骤为，将所述菌种接种至TSB培养基中培养，得到OD值为1.0的菌悬液。

4.根据权利要求3所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述菌种按照1-1.2％的接种量接种至TSB培养基。

5.根据权利要求4所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述菌悬液按照1-1.2％的接种量接种至无机盐培养基。

6.根据权利要求1所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述信号分子溶液所用的溶剂为二甲基亚砜或乙腈。