CN115948412A - OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10基因及在培育理想株高水稻上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10基因及其在培育理想株高水稻品种上的应用，所述基因选自OsYTH03、OsYTH05或OsYTH10中的一个或多个，三个基因间存在冗余效应：单个基因敲除的转基因植株株高降低10％‑15％，而三个基因同时敲除的转基因植株株高降低超过30％，这一冗余作用机制可以为水稻育种提供基因资源，即根据所需要调节株高的程度，通过敲除一个或多个基因，培育具有理想株高的水稻品种，以适应我国不同地区的栽培需求，增加种植密度，提高水稻产量。

Description

OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10基因及在培育理想株高水稻上的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及三个水稻株高发育相关基因OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10及其编码蛋白质和应用。

背景技术

水稻(Oryzasativa L.)是我国主要的粮食作物，超过半数的人民以水稻为主食，因此，保证水稻的高产稳产对维护我国粮食安全具有重要意义。水稻的高产离不开良好的株型，株高是指从穗顶端到茎基部的长度，是水稻株型的重要组成部分，也是株型研究的重点。水稻株高是影响产量的重要因素，株高过高会导致茎秆脆弱易倒伏，不仅收割困难，对太阳能的利用效率也会降低；而株高过矮通常会导致一些重要农艺性状的恶化，如籽粒减小、叶片发育异常等，受上述因素限制，很多株高相关基因并不能在育种上广泛利用，SD1是绿色革命时期克隆的明星基因，但是其也存在基因单一和遗传背景狭窄等缺点，很容易造成遗传上的脆弱性和局限性。适宜的株高能提高光能利用率，加速田间CO₂的扩散，对提升水稻产量具有重要意义。因此，发掘水稻株高调控基因并实现株高的控制具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于公开三个水稻株高调控基因OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10及其编码蛋白质和应用。

本发明提供基因OsYTH03、OsYTH05和OsYTH10的编码序列，其中基因OsYTH03的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因OsYTH05的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因OsYTH10的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10编码的蛋白，其中基因OsYTH03的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因OsYTH05的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示；基因OsYTH10的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供基因OsYTH03、OsYTH05和OsYTH10的基因组序列，其中基因OsYTH03的基因组序列如SEQ ID NO.7所示；基因OsYTH05的基因组序列如SEQ ID NO.8所示；基因OsYTH10的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供基因OsYTH03、OsYTH05和/或OsYTH10的敲除引物。

在一些实例中，基因OsYTH03的敲除引物序列如下：

YTH03-CRISPR-F：5'-GGCACGTCGCGCCGCCTCAGGTCC-3'

YTH03-CRISPR-R：5'-AAACGGACCTGAGGCGGCGCGACG-3'。

在一些实例中，基因OsYTH05的敲除引物序列如下：

YTH05-CRISPR-F：5'-GGCAGTCGATCACTCCCCTGCTCC-3'

YTH05-CRISPR-R：5'-AAACGGAGCAGGGGAGTGATCGAC-3'。

在一些实例中，基因OsYTH10的敲除引物序列如下：

YTH10-CRISPR-F：5'-GGCATCCACATACCTGAGCCATGA-3'

YTH10-CRISPR-R：5'-AAACTCATGGCTCAGGTATGTGGA-3'。

在一些实例中，OsYTH03、OsYTH05和OsYTH10三基因的敲除引物序列如下：

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-F：5'-TAGGTCTCTGGCAACAAAGCACCAGTGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-R：5'-CGGGTCTCCGGCGGCGCGACGTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-F：5'-TAGGTCTCCCGCCTCAGGTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-R：5'-CGGGTCTCCGGAGTGATCGACTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-F：5'-TAGGTCTCCCTCCCCTGCTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-R：5'-TAGGTCTCAAAACTCATGGCTCAGGTATGTGGATGCACCAGCCGGG-3'。

本发明还提供基因OsYTH03、OsYTH05和/或OsYTH10的敲除载体、转基因细胞系或重组菌。

扩增所述基因OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明还提供本发明所述的基因OsYTH03、OsYTH05和OsYTH10在培养株高降低的水稻中的应用。

本发明所述的应用，是将水稻基因OsYTH03、OsYTH05或OsYTH10中的一个或多个进行沉默或敲除，获得株高降低的水稻。

本发明所述的沉默或者敲除可以按照本领域的常规方法，例如通过CRISPR/Cas9技术对OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10进行敲除，也可以采用本发明所述的敲除引物对进行敲除。

本发明的有益效果：

本发明发现了对水稻株高发育至关重要的三个基因OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10，且三个基因间存在冗余效应：单个基因敲除的转基因植株株高降低10％-15％，而三个基因同时敲除的转基因植株株高降低超过30％，这一冗余作用机制可以为水稻育种提供基因资源，即根据所需要调节株高的程度，通过敲除一个或多个基因，培育具有理想株高的水稻品种，以适应我国不同地区的栽培需求，增加种植密度，提高水稻产量。

附图说明

图1为OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10单基因敲除植株的敲除方式与测序峰图。

图2为野生型Dongjin与OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10单基因敲除植株的表型图与株高统计分析柱形图；“**”表示根据TTEST统计学分析差异极显著(p≤0.01)。

图3为OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10三基因敲除植株的敲除方式与测序峰图。

图4为野生型Dongjin与OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10三基因敲除植株的表型图与株高统计分析柱形图；“**”表示根据TTEST统计学分析差异极显著(p≤0.01)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

1.OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10单基因敲除载体的构建

利用http://CRISPR.hzau.edu.cn/CRISPR/网站设计OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10的敲除引物,引物序列为：

YTH03-CRISPR-F：5'-GGCACGTCGCGCCGCCTCAGGTCC-3'

YTH03-CRISPR-R：5'-AAACGGACCTGAGGCGGCGCGACG-3'

YTH05-CRISPR-F：5'-GGCAGTCGATCACTCCCCTGCTCC-3'

YTH05-CRISPR-R：5'-AAACGGAGCAGGGGAGTGATCGAC-3'

YTH10-CRISPR-F：5'-GGCATCCACATACCTGAGCCATGA-3'

YTH10-CRISPR-R：5'-AAACTCATGGCTCAGGTATGTGGA-3'

2、OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10三基因敲除载体的构建

利用了CRISPR-P在线网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10的敲除引物,引物序列为：

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-F：5'-TAGGTCTCTGGCAACAAAGCACCAGTGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-R：5'-CGGGTCTCCGGCGGCGCGACGTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-F：5'-TAGGTCTCCCGCCTCAGGTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-R：5'-CGGGTCTCCGGAGTGATCGACTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-F：5'-TAGGTCTCCCTCCCCTGCTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-R：5'-TAGGTCTCAAAACTCATGGCTCAGGTATGTGGATGCACCAGCCGGG-3'

以pUC57-gRNA-tRNA质粒为模板，PCR扩增每个tRNA-gRNA单元。扩增程序为94℃2min；98℃ 10s；55℃ 30s；68℃ 1min，转到第二个步骤34个循环；68℃ 10min；4℃10min，扩增完后使用琼脂糖检测条带并割胶回收。利用Golden gate反应(边酶切边连接)进行多个gRNA-tRNA单元的串联，反应体系如下：

上述引物扩增的PCR产物纯化回收后分别与对应的线性化载体重组。重组体系(10μL)：DNA 3μL，线性载体2μL，重组Mix 5μL(Takara)。

载体构建步骤：

a)将10μL混合物置于50℃水浴锅中重组20min。

b)将重组产物转移到100μL的大肠杆菌感受态(DH5α)中混匀，冰浴25min。然后在42℃水浴锅中热激60s后，置于冰上静置5min。

c)加入500μL大肠杆菌培养基在37℃摇床复苏1h。

d)加相应抗生素平板涂布，在37℃培养箱中倒置培养15h。

e)挑取单克隆菌株到含有1ml培养基的灭菌PE管中，在37℃条件培养6h，提取表达载体质粒并测序。

用冻融法分别将敲除载体转化农杆菌EHA105菌株，得到重组菌株。

二、转基因植物的获得

1、愈伤组织的侵染

a)28℃条件下培养转基因敲除菌株和功能互补菌株16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液。

b)敲除菌株侵染野生型Dongjin制备而成的愈伤组织，培养3天。

c)将侵染后的愈伤组织转移到含有相应抗性筛选化合物的N6固体培养基中筛选15天。

d)挑取健康愈伤用相应筛选培养基进行第二次筛选。

e)挑取抗性愈伤置于筛选分化培养基上分化。

2、转基因植株的鉴定。

转基因敲除植株的鉴定：在敲除靶点上下游200bp附近设计扩增引物，提取T₂代转基因植株DNA扩增，测序分析编辑方式，测序引物如下：

YTH03-F:5'-TCACGATCCCTCTCACCTTC-3'

YTH03-R:5'-ATTGCTTGCATCATTCCATT-3'

YTH05-F:5'-GTTTAGTTGCTCGCTTTTGA-3'

YTH05-R:5'-CCTATCGCAAAGTGATGAAC-3'

YTH10-F:5'-CATTGACCCCTTCACCATTC-3'

YTH10-R:5'-CCGTTGGAACCTGGTGTATT-3'

经过测序分析，获得了每个基因各两种编辑方式的纯合转基因植株，其中yth03-1的编码区插入了一个G碱基，yth03-2的编码区出现了大片段缺失；yth05-1的编码区插入了一个T碱基，yth05-2的编码区插入了一个G碱基；yth10-1的编码区插入了一个A碱基，yth10-2的编码区缺失了一个A碱基，以上突变方式均为移码突变，导致编码的蛋白质提前终止。

经过测序分析，获得了两种不同基因型的纯合三基因敲除植株。其中yth03/05/10-1在YTH03的编码区缺失了一个G碱基，在YTH05的编码区发生了1个A碱基的插入，而在YTH10的编码区缺失了CA两个碱基，三个靶点均发生了移码突变；yth03/05/10-2在YTH03的编码区缺失了一个G碱基，在YTH05基因编码区发生了1个T碱基的插入，而在YTH10基因编码区发生了1个C碱基的插入，三个靶点均发生了移码突变。因此，yth03/05/10-1和yth03/05/10-2都是同时敲除了YTH03、YTH05、YTH10的纯合转基因植株。

种植上述T₂代转基因植株至成熟期，测定突变体植株和野生型植株的株高、拍照，并利用TTEST进行统计学分析野生型和T₂代纯合的敲除突变体植株株高差异的显著性。

结果如图1～图4，显示单基因敲除植株的株高降低了约10-15％。而三基因同时敲除的植株株高降低了超过30％。同时测定了三基因敲除植株成熟期不同节间长度，结果显示转基因植株的所有节间长度均小于野生型水稻。

综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsYTH03、OsYTH05、OsYTH10基因进行单基因敲除与三基因共同敲除，获得了多个不同突变方式的突变体，其T₂代纯合突变的植株都表现为株高降低，但是三基因同时敲除的植株株高降低更加明显，说明上述三个基因在调控株高发育的过程中存在功能冗余现象，本发明方法可用于培育具有理想株高的水稻品种，提高水稻在不同区域的适应能力，最终提高水稻产量。

Claims (10)

1.与水稻株高有关的基因，其特征在于，所述基因选自OsYTH03、OsYTH05或OsYTH10中的一个或多个，其中基因OsYTH03的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，基因OsYTH05的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因OsYTH10的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于，基因OsYTH03的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，基因OsYTH05的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，基因OsYTH10的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1所述的基因的基因组序列，其特征在于，基因OsYTH03的基因组序列如SEQID NO.7所示，基因OsYTH05的基因组序列如SEQ ID NO.8所示，基因OsYTH10的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

4.敲除权利要求1所述基因的引物序列。

5.基因OsYTH03的敲除引物序列：

YTH03-CRISPR-F：5'-GGCACGTCGCGCCGCCTCAGGTCC-3'

YTH03-CRISPR-R：5'-AAACGGACCTGAGGCGGCGCGACG-3'。

6.基因OsYTH05的敲除引物序列：

YTH05-CRISPR-F：5'-GGCAGTCGATCACTCCCCTGCTCC-3'

YTH05-CRISPR-R：5'-AAACGGAGCAGGGGAGTGATCGAC-3'。

7.基因OsYTH10的敲除引物序列：

YTH10-CRISPR-F：5'-GGCATCCACATACCTGAGCCATGA-3'

YTH10-CRISPR-R：5'-AAACTCATGGCTCAGGTATGTGGA-3'。

8.OsYTH03、OsYTH05和OsYTH10三基因的敲除引物序列：

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-F：5'-TAGGTCTCTGGCAACAAAGCACCAGTGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth03-R：5'-CGGGTCTCCGGCGGCGCGACGTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-F：5'-TAGGTCTCCCGCCTCAGGTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth05-R：5'-CGGGTCTCCGGAGTGATCGACTGCACCAGCCGGG-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-F：5'-TAGGTCTCCCTCCCCTGCTCCGTTTTAGAGCTAGAA-3'

YTH03/05/10-CRISPR-yth10-R：5'-TAGGTCTCAAAACTCATGGCTCAGGTATGTGGATGCACCAGCCGGG-3'。

9.敲除权利要求1所述的基因的敲除载体、转基因细胞系或重组菌。

10.敲除权利要求1所述的基因、降低权利要求2所述的蛋白、敲除权利要求3所述的基因组、或者权利要求4～8任一项所述的引物序列在培养株高降低的水稻中的应用；优选的，所述应用将水稻基因OsYTH03、OsYTH05或OsYTH10中的一个或多个进行沉默或敲除，获得株高降低的水稻。

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