CN115944711A - 四肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及四肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸‑缬氨酸‑脯氨酸‑亮氨酸的肽或其盐在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。实验证明，本发明的肽对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有显著的治疗作用，能够有效促进消化系统黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展；对乙酸造成的大鼠口腔溃疡模型体现出较好的治疗作用，可以有效治疗口腔溃疡、口腔炎等；对细胞具有促增殖作用，可以治疗皮肤损伤疾病。本发明的应用为临床上黏膜损伤、皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

Description

四肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及四肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。

背景技术

黏膜损伤在生活中较为常见，感染性疾病、变态反应性疾病、局部刺激等均能够造成口腔黏膜损伤；化学因素(吸烟、喝酒、饮茶、咖啡及刺激性的药品如阿司匹林、消炎痛等)、物理因素(过冷、过烫、过于粗糙的食物或暴饮暴食等)、细菌或其毒素刺激等因素均可能造成胃黏膜损伤；便秘等因素可能导致肠道损伤。

胃黏膜是存在于胃部内壁的一层很薄、很脆弱的黏膜组织，如同一堵天然“屏障”保护胃壁的安全。它具有一个损伤与自我修复的动态平衡机制，保护着胃部的正常运作。一旦外界给予胃的负担过重或刺激过强，动态平衡就会被打破，胃酸便开始对胃壁“自我消化”，继而形成凹入表面的破损。胃黏膜一旦受损，就很难再恢复如初。随之而来的就是上腹部不适或疼痛、恶心、呕吐、腹泻、食欲不振等一系列胃部不适的症状。

慢性胃炎是一种胃黏膜慢性炎症，是消化内科的常见病和多发病，临床上将不同原因引起的胃黏膜慢性炎症(即在病理上表现为单核细胞和淋巴细胞浸润)和(或)腺体萎缩性病变称为慢性胃炎。黏膜组织的损伤临床上会导致慢性胃炎和消化道溃疡等胃肠道疾病，临床上急慢性胃炎、消化道溃疡的治疗药物主要有胃酸抑制剂、胃黏膜保护剂、抗生素等小分子化合物。现有的胃黏膜保护药在临床应用过程中存在治疗效果有限，有效性差，疗程长、复发率高等问题，尚不能满足各种原因引起的急慢性胃炎及消化道溃疡的临床治疗需求。

皮肤损伤是指正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。皮肤损伤常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损，也称为伤口或者创伤。目前有包括碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子及生长激素等蛋白质/多肽药物具有明显的修复创面、护肤、抗皱和防衰老作用，但这些蛋白质/多肽药物的氨基酸序列较长导致制备成本高、稳定性较差等缺点，因而其应用受到了一定的限制。因此，研发对黏膜损伤修复或皮肤损伤修复方面的药物非常有必要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的目的在于提供了四肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。

本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。

进一步地，所述黏膜损伤为消化系统黏膜损伤。

消化系统黏膜损伤是由刺激性物质或药物引起的或应激状态引起的。所述刺激性物质例如盐酸、乙醇等。所述药物例如非类固醇类抗炎药阿司匹林或吲哚美辛等。

本发明氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽或其盐能够对消化系统黏膜等起到保护作用，或修复消化系统黏膜的损伤，从而起到预防、减轻或治疗胃肠疾病和口腔疾病的作用。

进一步地，所述消化系统黏膜损伤与急性胃炎、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃十二指肠溃疡、功能性胃肠道疾病、消化不良、癌前病变、消化系统肿瘤、胃肠道出血、胃食管返流疾病、口腔溃疡、口腔炎、牙龈炎、牙周炎、食管炎、食管溃疡、急慢性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病或放化疗引起的膜损伤疾病有关。

进一步地，氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽或其盐能够促进细胞增殖，可以治疗表皮炎症、机械及手术创面、烧伤及烫伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗等引起的皮肤损伤疾病。

进一步地，所述氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽是通过化学合成方法制备得到。通过链接树脂、链接氨基酸、切割、纯化、换盐和冻干步骤制备得到。

进一步地，所述的药物是以氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽或其盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为口服制剂或外用制剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸(PVPL)的肽或其盐在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。通过建立体内模型，结果证明本发明的肽(PVPL)对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有显著的治疗作用，溃疡抑制率明显高于替普瑞酮组，证实了本发明所述的肽(PVPL)能够有效促进消化系统黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展；对乙酸造成的大鼠口腔溃疡模型体现出较好的治疗作用，可以有效治疗口腔溃疡、口腔炎等；对HaCaT细胞具有促增殖作用，可以治疗表皮炎症、机械及手术创面、烧伤及烫伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗引起的皮肤损伤疾病。本发明的应用为临床上黏膜损伤、皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

附图说明

图1为肽PVPL对HaCaT细胞的促增殖作用。

具体实施方式

实施例1肽PVPL的化学合成

1、链接树脂

(1)溶胀：称取5.51g的2-氯三苯甲基氯树脂(取代度S＝0.75mmol/g)，加入多肽固相合成管中，加入85mL二氯甲烷氮气鼓泡溶胀10分钟。

(2)链接：依次加入1.20mL的N,N-二异丙基乙胺，2.16g的Fmoc-L-Leu-OH、氮气鼓泡室温反应2小时，加入6mL甲醇，反应30分钟，抽干；然后分别用50mL二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟，抽干树脂。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入45mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干；再次加入45mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干。然后用50mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤5次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性。

2、链接氨基酸

2.1链接3位Pro：

(1)氨基酸预活化：在反应瓶中依次加入4.27g的Fmoc-L-Pro-OH、2.00g的1-羟基苯并三唑，然后加入45mL的N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)，搅拌溶解，-5～0℃加入2060uL的N,N-二异丙基乙胺、2000uL的N,N'-二异丙基碳二亚胺，反应50分钟。

(2)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液加入合成管中，补加适量的二氯甲烷清洗用具。室温下氮气鼓泡反应80分钟，茚三酮法检测，阴性。抽干，树脂用45mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入45mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干；再次加入45mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干。然后用50mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤5次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性。

2.2链接2位Val：

(1)氨基酸预活化：在反应瓶中依次加入4.12g的Fmoc-L-Val-OH、2.01g的1-羟基苯并三唑，然后加入45mL的N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)，搅拌溶解，-5～0℃加入2060uL的N,N-二异丙基乙胺、2000uL的N,N'-二异丙基碳二亚胺，反应40分钟。

(2)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液加入合成管中，补加适量的二氯甲烷清洗用具。室温下氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测，阴性。抽干，树脂用45mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入50mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干；再次加入50mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干。然后用50mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤5次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性。

2.3链接1位Pro：

(1)氨基酸预活化：在反应瓶中依次加入4.30g的Fmoc-L-Pro-OH、2.00g的1-羟基苯并三唑，然后加入45mL的N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)，搅拌溶解，-5～0℃加入2060uL的N,N-二异丙基乙胺、4000uL的N,N'-二异丙基碳二亚胺，反应35分钟。

(2)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液加入合成管中，补加适量的二氯甲烷清洗用具。室温下氮气鼓泡反应2小时，茚三酮法检测，阴性。抽干，树脂用50mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入50mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干；再次加入50mL的20％1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应10min，抽干。然后用50mL的MeOH:N,N-二甲基甲酰胺(15:85)洗涤3次，50mL的二氯甲烷洗涤6次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性。抽干进行下一步切割。

3、切割

在合成管中依次加入60mL的三氟乙酸、2.5mL的H₂O、2.5mL的三异丙基硅烷，氮气鼓泡反应3小时。抽滤，用10mL的三氟乙酸洗涤树脂一次，合并滤液，35℃减压下浓缩掉三氟乙酸，加入100mL的甲基叔丁基醚，100mL的正己烷沉淀得胶状物，35℃减压干燥过夜得固体，未计重。送检LCMS，纯度为96.54％，[M+H]⁺425.40，结果正确。

4、纯化、换盐和冻干

色谱参数：

色谱柱：YMC-Actus Triart C₁₈ 250x30mm(S-5um,12nm)

洗脱液A1：0.1M乙酸

洗脱液A2：0.025M乙酸—0.1M乙酸铵

洗脱液B：乙腈

流速：25mL/min

紫外检测波长：220nm

操作步骤：

a)95％洗脱液A1+5％洗脱液B平衡色谱柱；

b)进样，样品量0.4722g，4.5mL纯化水溶解并经孔径0.45um滤器过滤；

c)95％洗脱液A2+5％洗脱液B平衡色谱柱；

d)A1和B梯度洗脱，梯度如下：

表1洗脱液A1和洗脱液B的梯度洗脱程序

时间/min	洗脱液A1(0.1M乙酸)/％	洗脱液B(乙腈)/％
			0	95	5
5	95	5
			35	70	30
40	50	50

e)收集目的肽洗脱液；

f)旋蒸浓缩:水浴温度40℃；

g)冷冻干燥得纯品0.2195g，纯度：100％，收率：46.48％，MS(ESI)，m/z:425.30([M+H]⁺)。

肽Pro-Val-Pro-Leu的鉴定结果如下：

1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),4.35(dt,J＝10.1,5.2Hz,2H),4.13(q,J＝7.6Hz,1H),3.67–3.59(m,2H),3.56(dd,J＝13.2,9.3Hz,1H),2.96–2.88(m,1H),2.86–2.76(m,1H),2.05–1.59(m,12H,AcOH),1.59–1.42(m,2H),0.87(dd,J＝11.2，6.7Hz,6H)，0.80(dd,J＝8.9，6.7Hz,6H)。

实施例2实施例1获得的肽PVPL样品对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的影响

实验动物：5周SPF级C57BL/6JGPt雄性小鼠，来源于成都药康生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(川)2020-034。

实验方法：实验动物适应性喂养后，实验前1天给药后所有动物开始禁食不禁水24h。造模前实验小鼠随机分组：空白组5只、模型组10只、替普瑞酮组10只、PVPL给药组10只，除空白组及模型组分别灌胃给予200uL纯化水以外，替普瑞酮组按照160mg/kg灌胃，PVPL给药组按照0.1mg/kg灌胃，给药1小时后，各组小鼠经口灌胃给予0.9ml/kg的无水乙醇造模，1h后利用脱颈法处死动物，结扎胃贲门和夹闭幽门，摘取全胃。向胃体内注入1％甲醛溶液1mL，结扎贲门，取出胃后即放入1％甲醛溶液中。浸泡30min后取出胃组织，沿胃大弯剪开，使用生理盐水冲洗干净胃内容物，平铺后观察并测定小鼠胃黏膜的损伤，计算溃疡指数和溃疡抑制率。结果见表2。

溃疡指数计算方法：条索状损伤长度大于1mm者，测量其长度，每毫米计1分；若其宽度大于1mm，将计分按宽度的毫米数加倍；长度小于1mm计0.5分，将计分相加得出该动物的溃疡指数。

溃疡抑制率％＝(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100％。

表2PVPL对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的抗溃疡作用结果

样品名称	测试剂量/mg/kg	溃疡指数	溃疡抑制率/％
				PVPL	0.1	10.80±0.57	68.24
替普瑞酮组	160	22.30±2.22	34.41
				模型组	-	34.00±7.25	-

实施例3实施例1获得的肽PVPL样品对大鼠化学性口腔溃疡模型的影响

实验动物：SPF级SD大鼠，来源于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008；合格证号：110322210102373824；全雄性；购入时体重为180～220g。

实验方法：适应期结束后，所有动物摄食、饮水、排便等均正常，未见明显异常活动或表现，动物造模：动物麻醉(1％戊巴比妥钠腹腔注射，剂量：50mg/kg)，口唇侧黏膜下注射20％乙酸0.05mL/只。造模后第二天选择形成口腔溃疡的大鼠40只，随机分为4组，每组10只，组别为模型组、PVPL高剂量组、PVPL低剂量组和康复新液组，模型组给予纯水，其余各组给予不同剂量的药物，首次给药当天为d1。具体信息详见表3。从d1起，每两天检测一次大鼠的体重增长情况、日摄食量、口腔溃疡面积和愈合情况，具体见表4-表6。

表3试验剂量设计表

表4大鼠体重增长情况

注：*P<0.05，与模型组比较。

表5大鼠摄食量情况

注：*P<0.05，与模型组比较。

表6大鼠口腔溃疡面积和愈合情况

注：*P<0.05，**P<0.01与模型组比较。

由表6可知，注射乙酸造模后给药第3天、第5天和第7天，各给药组口腔溃疡面积较模型组均有所减小。在口腔溃疡愈合天数方面PVPL高、低剂量组较模型组有明显减少(P<0.05或P<0.01)，能有效缩短口腔溃疡愈合周期。实验结果证明，本发明肽PVPL对乙酸造成的大鼠口腔溃疡模型体现出较好的治疗作用。

实施例4实施例1获得的肽PVPL样品对HaCAT细胞增殖的促进作用

实验方法：将人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)浓度调整为1.0×10⁵～5.0×10⁵/mL进行传代培养，于37℃，5％CO₂条件下培养24～36小时用于生物学活性检测。用0.25％胰酶消化细胞5min，加入胰酶体积1倍以上的1640全血培养基终止消化，收集细胞悬液，1000RPM离心3min，弃掉上清，加入2mL的1640全血培养基重悬细胞，取20uL细胞悬液，用AOPI染色，再用细胞计数仪检测悬液中细胞的浓度，用10％血清浓度的1640培养基配成浓度5×10⁴/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，即5000个细胞/孔，于37℃，5％CO₂条件下培养过夜。24h后弃掉原培养基，加入100μL 1％血清浓度的1640培养基配制的不同浓度的肽的溶液，采用实施例1获得的PVPL样品配制成浓度分别为0.05、0.2、0.8ug/mL；同时设置EGF对照组，即加入100μL用1％血清浓度的1640培养基配制的重组人表皮生长因子(EGF)溶液，终浓度为100ng/mL；模型对照组，即加入等体积的1％血清浓度的1640培养基。于37℃，5％CO₂条件下培养72小时，采用CCK8试剂盒检测HaCaT细胞株增殖情况。结果见图1。由图1可知，肽PVPL对HaCaT细胞具有促增殖作用，P＜0.05，具有显著性差异，说明肽PVPL在皮肤相关疾病方面具有潜在的应用价值。

综上所述，本发明所述的肽(PVPL)对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有良好的预防和治疗作用，溃疡抑制率明显高于替普瑞酮组；对乙酸造成的大鼠口腔溃疡模型体现出良好的治疗作用；可以有效治疗口腔溃疡、口腔炎等；对HaCaT细胞具有促增殖作用，可以治疗皮肤相关疾病。本发明的应用为临床上黏膜损伤、皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

Claims (9)

1.氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽或其盐在制备用于黏膜损伤或皮肤损伤修复的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黏膜损伤为消化系统黏膜损伤。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述消化系统黏膜损伤与急性胃炎、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃十二指肠溃疡、功能性胃肠道疾病、消化不良、癌前病变、消化系统肿瘤、胃肠道出血、胃食管返流疾病、口腔溃疡、口腔炎、牙龈炎、牙周炎、食管炎、食管溃疡、急慢性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病或放化疗引起的黏膜损伤疾病有关。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述消化系统黏膜损伤是由刺激性物质或药物引起的或应激状态引起的。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述皮肤损伤与表皮炎症、机械及手术创面、烧伤及烫伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗引起的皮肤损伤疾病相关。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽促进细胞增殖。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肽是通过化学合成方法制备得到。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸的肽或其盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的制剂为口服制剂或外用制剂。

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