CN115944709A

CN115944709A - 一种三肽在制备用于黏膜或皮肤损伤修复的药物中的应用

Info

Publication number: CN115944709A
Application number: CN202111682213.3A
Authority: CN
Inventors: 耿福能; 沈咏梅; 马秀英; 邓金根; 姜顺日; 刘彬; 吴桃清
Original assignee: Sichuan Gooddoctor Panxi Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Sichuan Gooddoctor Panxi Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种三肽在制备用于黏膜或皮肤损伤修复的药物中的应用。本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸‑缬氨酸‑脯氨酸的肽或其盐在制备治疗和/或预防黏膜损伤或皮肤损伤所致疾病的药物中的应用。本发明所述的肽能够有效促进消化道黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展。药理实验结果证明，本发明所述的肽对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有显著的治疗作用，本发明的应用为临床上黏膜损伤或皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

Description

一种三肽在制备用于黏膜或皮肤损伤修复的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种三肽在制备用于黏膜或皮肤损伤修复的药物中的应用。

背景技术

黏膜损伤在生活中较为常见，感染性疾病、变态反应性疾病、局部刺激等均能够造成口腔黏膜损伤；化学因素(吸烟、喝酒、饮茶、咖啡及刺激性的药品如阿司匹林、消炎痛等)、物理因素(过冷、过烫、过于粗糙的食物或暴饮暴食等)、细菌或其毒素刺激等因素均可能造成胃黏膜损伤；便秘等因素可能导致肠道损伤。

胃黏膜是存在于胃部内壁的一层很薄、很脆弱的黏膜组织，如同一堵天然“屏障”保护胃壁的安全。它具有一个损伤与自我修复的动态平衡机制，保护着胃部的正常运作。一旦外界给予胃的负担过重或刺激过强，动态平衡就会被打破，胃酸便开始对胃壁“自我消化”，继而形成凹入表面的破损。胃黏膜一旦受损，就很难再恢复如初。随之而来的就是上腹部不适或疼痛、恶心、呕吐、腹泻、食欲不振等一系列胃部不适的症状。

慢性胃炎是一种胃黏膜慢性炎症，是消化内科的常见病和多发病，临床上将不同原因引起的胃黏膜慢性炎症(即在病理上表现为单核细胞和淋巴细胞浸润)和(或)腺体萎缩性病变称为慢性胃炎。黏膜组织的损伤临床上会导致慢性胃炎和消化道溃疡等胃肠道疾病，临床上急慢性胃炎、消化道溃疡的治疗药物主要有胃酸抑制剂、胃黏膜保护剂、抗生素等小分子化合物。现有的胃黏膜保护药在临床应用过程中存在治疗效果有限，有效性差，疗程长、复发率高等问题，尚不能满足各种原因引起的急慢性胃炎及消化道溃疡的临床治疗需求。

皮肤创伤或皮肤损伤是指正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。皮肤损伤常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。也称为伤口或者创伤。目前有包括碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子及生长激素等蛋白质/多肽药物具有明显的修复创面、护肤、抗皱和防衰老作用，但这些蛋白质/多肽药物的氨基酸序列较长导致制备成本高、稳定性较差等缺点，因而其应用受到了一定的限制。因此，研发对消化道系统膜损伤修复或皮肤损伤修复方面的药物非常有必要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的目的在于提供一种三肽在制备用于黏膜或皮肤损伤修复的药物中的应用。

本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽或其盐在制备治疗和/或预防黏膜损伤或皮肤损伤所致疾病的药物中的应用。

进一步地，所述黏膜损伤为消化系统黏膜损伤。

消化系统黏膜损伤是由刺激性物质或药物引起的或应激状态引起的。所述刺激性物质例如盐酸、乙醇等。所述药物例如非类固醇类抗炎药阿司匹林或吲哚美辛等。

本发明氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽或其盐能够对消化系统黏膜起到保护作用，或修复消化系统黏膜的损伤，从而起到预防、减轻或治疗胃肠疾病的作用。

进一步地，所述黏膜损伤所致的疾病包括急性胃炎、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃十二指肠溃疡、功能性胃肠道疾病、消化不良、癌前病变、消化系统肿瘤、胃肠道出血、胃食管返流疾病、口腔溃疡、口腔炎、牙龈炎、牙周炎、食管炎、食管溃疡、急慢性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病和放化疗引起的黏膜损伤疾病。

进一步地，所述皮肤损伤所致的疾病包括表皮炎症、机械及手术创面、烧伤及烫伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗引起的皮肤损伤疾病。

进一步地，所述氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽是通过化学合成方法制备得到。通过链接树脂、链接氨基酸、切割、纯化、换盐和冻干步骤制备得到。

进一步地，所述的药物是以氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽或其盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为口服制剂或外用制剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供了氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸(PVP)的肽或其盐在制备治疗和/或预防黏膜损伤或皮肤损伤所致疾病的药物中的应用。通过建立体内模型，结果证明本发明的肽(PVP)对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有显著的治疗作用，证实了本发明所述的肽(PVP)能够有效促进消化道黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展，可以预防和治疗黏膜损伤所致的疾病，本发明的应用为临床上黏膜损伤或皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

具体实施方式

实施例1肽PVP的化学合成

1、链接树脂

(1)溶胀：称取8.16g的2-氯三苯甲基氯树脂(取代度S＝0.75mmol/g)，加入多肽固相合成管中，加入150mL二氯甲烷氮气鼓泡溶胀30分钟。

(2)链接：依次加入3.25g的Fmoc-L-Pro-OH、1.32g N,N-二异丙基乙胺，氮气鼓泡室温反应110分钟，加入15mL甲醇，反应40分钟，抽干；然后分别用75mLN,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，抽干树脂。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入75mL的20％哌啶-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应20min，抽干；然后用100mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，100mL的二氯甲烷洗涤1次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性。

2、链接氨基酸

2.1链接2位Val：

(1)氨基酸预活化：在反应瓶中依次加入6.11g的Fmoc-L-Val-OH、3.01g的1-羟基苯并三唑，然后加入75mL的N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)，溶解，-5～0℃搅拌下加入2.45g的N,N-二异丙基乙胺、2.44g的N,N'-二异丙基碳二亚胺，反应30分钟。

(2)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液加入合成管中，补加适量的二氯甲烷清洗用具。室温下氮气鼓泡反应70分钟，茚三酮法检测，阴性。抽干，树脂用100mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟。

2.2链接1位Pro：

(1)氨基酸预活化：在反应瓶中依次加入6.43g的Fmoc-L-Pro-OH、3.18g的1-羟基苯并三唑，然后加入80mL的N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)，溶解，-5～0℃搅拌下加入2.39g的N,N-二异丙基乙胺、4.94g的N,N'-二异丙基碳二亚胺，反应11分钟。

(2)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液加入合成管中，补加适量的二氯甲烷清洗用具。室温下氮气鼓泡反应2小时15分钟，茚三酮法检测，阴性。抽干，树脂用100mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次3-5分钟。

(3)脱除Fmoc保护基：室温下向合成管中加入80mL的20％哌啶-N,N-二甲基甲酰胺(v/v)溶液，氮气鼓泡反应20min，抽干；然后用100mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，100mL的二氯甲烷洗涤6次，每次3-5分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果，阳性，抽干进行下一步切割。

3、切割

在合成管中依次加入100mL的三氟乙酸、3mL的H₂O、3mL的三异丙基硅烷，氮气鼓泡反应2小时。抽滤，用25mL的三氟乙酸洗涤树脂一次，合并滤液，35℃减压下浓缩掉三氟乙酸，加入20mL的甲基叔丁基醚，80mL的正己烷沉淀得油状物，倾倒上清液，重复沉淀一次，油状物35℃减压干燥得固体,未计重量。固体送检LCMS，纯度为93.46％，[M+H]+312.20，结果正确。

4、纯化、换盐和冻干

色谱参数：

色谱柱：YMC-Actus Triart C₁₈ 250x30 mm(S-5um,12nm)

洗脱液A1：0.1M乙酸

洗脱液A2：0.025M乙酸—0.1M乙酸铵

洗脱液B：乙腈

流速：25mL/min

紫外检测波长：220nm

操作步骤

a)95％洗脱液A1+5％洗脱液B平衡色谱柱；

b)进样，样品量0.4368g，4mL纯化水溶解并经孔径0.45um滤器过滤；

c)95％洗脱液A2+5％洗脱液B平衡色谱柱；

d)A1和B梯度洗脱，梯度如下：

表1洗脱液A1和洗脱液B的梯度洗脱程序

时间/min	洗脱液A1(0.1M乙酸)/％	洗脱液B(乙腈)/％
			0	97	3
40	70	30

e)收集目的肽洗脱液；

f)旋蒸浓缩:水浴温度40℃；

g)冷冻干燥。

得纯品0.1447g，纯度：100％，收率：33.12％，MS(ESI)，m/z:312.30([M+H]+)。

肽Pro-Val-Pro的鉴定结果如下：

1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.15(d,J＝9.1Hz,1H),4.36(dd,J＝9.1,7.1Hz,1H),4.21(dd,J＝8.6,4.9Hz,1H),3.72–3.59(m,2H),3.59–3.53(m,1H),2.93(dq,J＝10.2,6.7Hz,1H),2.79(dt,J＝10.3,6.4Hz,1H),2.16–2.06(m,1H),2.04–1.77(m,9H,AcOH),1.76–1.54(m,4H),0.90(d,J＝6.7Hz,3H),0.81(d,J＝6.7Hz,3H)。

实施例2实施例1获得的肽样品对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的抗溃疡作用

实验动物：5周SPF级C57BL/6JGPt雄性小鼠，来源于成都药康生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(川)2020-034。

实验方法：实验动物适应性喂养后，实验前1天给药后所有动物开始禁食不禁水24h。造模前实验小鼠随机分组：空白组5只、模型组10只、替普瑞酮组10只、PVP给药组10只，除空白组及模型组分别灌胃给予200uL纯化水以外，替普瑞酮组按照160mg/kg灌胃，PVP给药组按照0.2mg/kg灌胃，给药1小时后，各组小鼠经口灌胃给予0.9ml/kg的无水乙醇造模，1h后利用脱颈法处死动物，结扎胃贲门和夹闭幽门，摘取全胃。向胃体内注入1％甲醛溶液1mL，结扎贲门，取出胃后即放入1％甲醛溶液中。浸泡30min后取出胃组织，沿胃大弯剪开，使用生理盐水冲洗干净胃内容物，平铺后观察并测定小鼠胃黏膜的损伤，计算溃疡指数和溃疡抑制率。结果见表2。

溃疡指数计算方法：条索状损伤长度大于1mm者，测量其长度，每毫米计1分；若其宽度大于1mm，将计分按宽度的毫米数加倍；长度小于1mm计0.5分，将计分相加得出该动物的溃疡指数。

溃疡抑制率％＝(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100％。

表2PVP对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的抗溃疡作用结果

样品名称	测试剂量/mg/kg	溃疡指数	溃疡抑制率/％
				PVP	0.2	17.70±1.90	47.94
替普瑞酮组	160	22.30±2.22	34.41
				模型组	-	34.00±7.25	-

综合上述结果，本发明所述的肽(PVP)对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有良好的治疗作用。说明本发明所述的肽(PVP)能够有效地促进黏膜的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展，可以预防和治疗黏膜损伤所致的疾病，本发明的应用为临床上黏膜损伤或皮肤损伤所致的疾病提供了一种新的思路和策略。

Claims

1.氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽或其盐在制备治疗和/或预防黏膜损伤或皮肤损伤所致疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黏膜损伤为消化系统黏膜损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黏膜损伤所致的疾病包括急性胃炎、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃十二指肠溃疡、功能性胃肠道疾病、消化不良、癌前病变、消化系统肿瘤、胃肠道出血、胃食管返流疾病、口腔溃疡、口腔炎、牙龈炎、牙周炎、食管炎、食管溃疡、急慢性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病和放化疗引起的黏膜损伤疾病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述消化系统黏膜损伤是由刺激性物质或药物引起的或应激状态引起的。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述皮肤损伤所致的疾病包括表皮炎症、机械及手术创面、烧伤及烫伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗引起的皮肤损伤疾病。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肽是通过化学合成方法制备得到。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以氨基酸序列为脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸的肽或其盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的制剂为口服制剂或外用制剂。