CN115944686A

CN115944686A - 一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115944686A
Application number: CN202310047266.0A
Authority: CN
Inventors: 李学刚; 叶小利; 李滟临
Original assignee: Chongqing Yishiteng Biological Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Yishiteng Biological Technology Co ltd
Priority date: 2023-01-31
Filing date: 2023-01-31
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明公开了一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物及其制备方法与应用，通过采用鲜黄精烘干脱水至水分含量为30‑80％或采用干黄精补水至水分含量为30‑80％为原料经过炮制(一蒸一干)的方式得到制黄精，并将制黄精经过回流提取并分离纯化得到黄精糖蛋白PSW‑26，具有预防老年痴呆、抗氧化、降糖、降血脂等生物活性，制备方法简单、操作方便、产物得率高。

Description

一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于黄精提取技术领域，具体涉及一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物及其制备方法与应用。

背景技术

黄精，又名：老虎姜、鸡爪参等，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功能，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等(《中国药典》)。“痴呆”的病名最早记载于汉代的《华佗神医秘传》，记忆力减退、遇事善忘为“痴呆”的核心症状。老年性痴呆病位在脑，与肾的关系较为密切。黄精具有“益肾”的作用，预防老年痴呆效果明显，尤其是九蒸九晒的制黄精疗效更为显著。

在文献“王秋丽.多花黄精生品及九蒸品粗多糖的抗炎及降糖作用研究。安徽中医药大学硕士论文，2020”中采用新鲜多花黄精切片连续蒸制并烘干至八成干，反复9次，得到九蒸品，在抗炎、降血糖方面与鲜多花黄精差异不大，但多花黄精在蒸制过程中会降低多糖含量，蒸制后提取的多糖含量低、提取率低；现有技术中关于黄精多糖增强记忆力和预防老年痴呆的研究文献资料较丰富，在公开号为CN115043957A，名为“一种黄精多糖及其制备方法和用途”的发明专利中采用干燥的黄精粉末经过水提醇沉得到黄精多糖浸膏，然后采用Sevage试剂除去黄精多糖浸膏中的蛋白得到黄精粗多糖，将黄精粗多糖依次经过纤维素柱、凝胶色谱柱分离纯化得到的均一化的黄精多糖，具有改善记忆功能、减少脑内β-淀粉样蛋白沉积、恢复宿主肠道菌群稳态、促进益生菌生长的功能，其不足之处在于：提取过程复杂、成分单一、提取率低、活性低、功能单一。

发明内容

针对上述的不足，本发明的目的是提供一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物及其制备方法与应用，黄精在通过蒸制处理后在依次经过水提、分离纯化获得的黄精糖蛋白PSW-26应用在制备增强记忆力、预防老年痴呆、抗氧化、降糖、降血脂药物方面具有显著的效果。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物，所述黄精提取物是由78.5％的多糖和21.5％的蛋白质组成的黄精糖蛋白PSW-26，所述黄精提取物的分子量为26kDa。

进一步地，所述多糖的单糖组成包括甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55:1.65:1.10:0.21:1.22:0.20，所述蛋白质由15种氨基酸组成。

进一步地，所述的一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物的制备方法，具体步骤如下：

1)原料前处理：先调节黄精水分含量为30-80％，然后置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制10-40h，蒸制好的黄精在温度为30-80℃的条件下烘干脱水到水分含量为20％，即得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取制黄精粉末5-10倍量的蒸馏水在温度为100℃的条件下回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I；

3)分离纯化：

取步骤2)中的提取物I用2-10倍量的蒸馏水溶解，选用分子量为1000Da的透析袋透析1-3天，期间每12h换水一次，得到透析物；

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入截留分子量为1000Da的透析袋，用10倍量的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入截留分子量为1000Da的透析袋，用10倍量的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26。

进一步地，步骤1)中所述调节黄精水分的方式为采用鲜黄精在80℃的条件下烘干脱水至水分含量为30-80％或采用干黄精补水至水分含量为30-80％。

进一步地，所述的黄精提取物在制备增强记忆力、预防老年痴呆、抗氧化、降糖、降血脂药物中的应用。

进一步地，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液体剂型、注射剂、软膏剂、栓剂、气雾剂、中药药剂。

采用以上方案，本发明具有如下优点：

1、黄精经本专利技术工艺炮制以后，其生物活性显著提高。与传统的九蒸九晒炮制工艺相比，本技术耗时少、能耗低、得率高，产品口感和质量均佳。

2、本发明得到的提取物，富含鲜黄精和生黄精中很少甚至没有的黄精糖蛋白(PSW-26)，该成分为黄精炮制过程中新生产的成分，其预防老年痴呆、抗氧化、降糖、降血脂等生物活性先与优于黄精多糖，是制黄精的主要活性成分。

3、本专利技术得到的制黄精及其提取物，可以直接以制黄精形式使用，也可以以提取物的形式开发为片剂和颗粒剂等多种剂型使用。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

说明书附图

图1为提取物I过DEAE-52纤维树脂得到的图谱。

图2为提取物II过Sephadex G-100柱得到的图谱。

图3为GPC测定黄精糖蛋白分子量的图谱。

图4为GC法分析PSW-26的单糖组成图谱。

图5为KM小鼠海马区切片以后的解破图。

图6为PSW-26的SDS-PAGE凝胶电泳实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述，但实施例并不对本发明作任何形式的限定，除非特别说明，本发明所涉及的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：先取5Kg鲜黄精在80℃下条件下烘干脱水到水分含量为30％，然后置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制10h，蒸制好的黄精在30℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用10倍量的蒸馏水在温度为100℃的条件下回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(750g)；

3)分离纯化：

取100g步骤2)中的提取物I用2倍体积(V/W)的蒸馏水溶解，选用分子量为1000Da的透析袋透析1天，得到透析物；

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(6.1g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(3.19g)。

实施例2：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为80％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制40h，蒸制好的黄精在80℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用5倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(850g)；

3)分离纯化：

取100g步骤2)中的提取物I用10倍体积(V/W)的蒸馏水溶解，选用分子量为1000Da的透析袋透析3天，得到透析物；

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(6.8g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(3.75g)。

实施例3：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为50％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制25h，蒸制好的黄精在50℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(800g)；

3)分离纯化：

取100g步骤2)中的提取物I用5倍体积(V/W)的蒸馏水溶解，选用分子量为1000Da的透析袋透析2天，得到透析物；

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖(图1)，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(6.8g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖(图2)，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(3.62g)。

实施例4：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精作为对照；

2)粗提取：取步骤1)中的干黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g干黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(700g)；

3)分离纯化：

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(0.2g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(0.1g)。

实施例5：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为50％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制5h，蒸制好的黄精在60℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(730g)；

3)分离纯化：

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(3.1g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(1.61g)。

实施例6：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为50％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制60h，蒸制好的黄精在70℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(860g)；

3)分离纯化：

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(5.6g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(2.97g)。

实施例7：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为10％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制25h，蒸制好的黄精在40℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(760g)；

3)分离纯化：

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(1.6g)。

实施例8：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精补充水到水分含量为90％，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制25h，蒸制好的黄精在60℃条件下烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精粉末用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I；

3)分离纯化：

取100g步骤2)中的提取物I用5倍体积(V/W)的蒸馏水溶解，选用分子量为10000Da的透析袋透析2天，得到透析物；

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(5.4g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(2.82g)。

实施例9：黄精提取物的制备

具体步骤如下：

1)原料前处理：取1Kg干黄精(含水分约5％)，置于蒸制容器内在常压条件下蒸汽100℃蒸制4h，然后于80℃下烘干5h(为一蒸一晒)，重复此过程9次(九蒸九晒)；蒸制好的黄精烘干脱水到水分含量20％，得到制黄精；

2)粗提取：取步骤1)中的制黄精切制、粉碎过2目筛，取1000g制黄精用8倍量的蒸馏水回流提取1h，过滤，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得到提取物I(750g)；

3)分离纯化：

将透析物上样于放置在4℃层析柜子的DEAE-52纤维素离子交换层析柱(50mm×1500mm)中，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.5mol/L的NaHCO₃洗脱，洗脱速度为10mL/min，每管收集50mL，直到洗脱完毕，使用紫外分光光度计对收集的每管逐步使用硫酸-蒽酮法在490nm处检测多糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，并绘制曲线，收集多糖与蛋白质同时检出的峰，总计得到5个同时出峰的收集液，将其中峰值最高的收集液I装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到提取物II(2.8g)；

将提取物II用2mmol/L Tris-HCl缓冲溶液溶解，其pH值为7.2，然后上样于放置在4℃层析柜子的Sephadex G-100C层析柱，用2.0mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，洗脱的时候流速控制在0.5mL/min，每一管收集10mL洗脱液，然后逐管用硫酸-蒽酮法在490nm处检测糖，使用考马斯亮蓝法在540nm处检测蛋白质，收集多糖与蛋白质同时出峰的管，并进行合并，得到洗脱液II，将洗脱液II装入分子量为1000Da的透析袋，用10倍体积的蒸馏水透析1d，每隔3h换一次水，然后冷冻干燥，得到了黄精提取物，即黄精糖蛋白PSW-26(1.41g)。

实施例10：黄精糖蛋白分析

1、实验材料

以实施例3条件下制得的黄精糖蛋白PSW-26。

2、实验方法及结果

PSW-26纯度的确定：PSW-26进行SDS-PAGE凝胶电泳，只有一条带，表明纯度较高，PSW-26进行GPC实验也只出现一个峰，表明得到的PSW-26为纯品，如图3和6所示。

PSW-26分子量的确定：利用GPC测定PSW-26分子量，如图3所示。

PSW-26分子中单糖组成的确定：通过硫酸蒽酮比色法测量PSW-26的总糖含量，结果显示糖含量约为78.5％。PSW-26的单糖类型多达6种，由甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55:1.65:1.10:0.21:1.22:0.20组成，如图4所示(1甘露糖；2葡萄糖醛酸；3半乳糖醛酸；4木糖；5半乳糖；6阿拉伯糖)。

PSW-26分子中氨基酸的确定：用考马斯亮蓝法测定PSW-26中蛋白质的总含量约为21.5％。通过自动氨基酸分析仪的分析确定PSW-26中氨基酸的含量和组成，其主要由15种氨基酸组成，其中精氨酸含量最高达18.69％。PSW-26的氨基酸组成见表1。

表1PSW-26氨基酸组成分析以及其相对含量

实施例11：不同炮制工艺黄精糖蛋白得率

根据实施例1-实施例9中的方法制备得到各黄精糖蛋白PSW-26，实施例1-实施例9中的黄精糖蛋白PSW-26的量与各实施例实验的参数如表1所示；

从表2中可以看到，实施例4中的方法所制备的PSW-26的含量非常少(0.1％左右，几乎没有)，实施例9中黄精蒸制(九蒸九晒)所制备的PSW-26的含量明显增加但是增加的量远远不及本发明中方法所制备的效果，采用本发明的制备方法后，所得到的PSW-26的含量大幅度增加，表明炮制(蒸制)过程中，PSW-26可能是由其他成分尤其是黄精中的蛋白质与黄精多糖发生了反应转化而来有关，这与黄精在九蒸九晒炮制过程中多糖和皂苷等成分发生了显著变化类似；

实验结果还证明，随着蒸制的时间增加，黄精中PSW-26的量增加，尤其是前10h，PSW-26增加的幅度非常明显(实施例1、3、4、5等比较)；当蒸制时间超过40h以后，PSW-26的含量增加不明显，反而有下降的趋势(实施例1、2、3、6等比较)，因此，蒸制的时间以10-40h为宜；

控制蒸制前黄精的水分也有很大的关系，当黄精的水分太少的时候(低于30％)，PSW-26的含量明显不足(实施例3、7、9等比较)，可能与水分太少不利于反应或者传热不均匀有关；当水分太高的时候(超过80％)，PSW-26的含量也有下降的趋势(实施例3、9等比较)，这可能与蒸制过程中大量甜味物质(包括黄精糖蛋白)流失有关(当黄精含水量超过80％以后，蒸锅水中甜味物质明显增加)。

表2含水量和蒸制时间对PSW-262的影响

实施例12：黄精提取物增强记忆力和预防老年痴呆提取物及增加记忆力和预防老年痴呆实验

1、实验材料

试验药物1：按实施例3条件制备的提取物I；

试验药物2：按实施例3条件制备的提取物II；

试验药物3：按实施例3条件制备的PSW-26；

对照药物1：按专利技术(申请号202210621078.X)制备的黄精多糖；

对照药物2：未经蒸制的鲜黄精原料，按照实施例4制备的提取物I；

实验动物：70只雄性6周龄，SPF级KM小鼠，体质量27～29g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，所有小鼠均在温度(22±1)℃，相对湿度：40％～60％，光照：12h/12h明暗交替的环境中饲养。

2、实验方法

3、将药物充分搅拌至完全溶解，于4℃冰箱中保存。KM小鼠每天自由饮水饮食，适应性喂养一周后，随机分为7组，每组10只，分别为空白组、模型组、黄精提取物I组(1800mg/Kg)、黄精提取物II组(122mg/Kg)、PSW-26组(65mg/Kg)、对照组1(65mg/Kg)、对照药物2(1800mg/Kg)。

4、模型组和药物组KM小鼠每天腹腔注射D-gal(150mg/kg)，空白组腹腔注射等量生理盐水，持续1周；1周以后，药物组每天下午在固定时间段16：00-17：00之间灌胃药物，空白组与模型组灌胃等体积的生理盐水，连续给药，共10周。在造模第4周通过小鼠新物体识别实验检测D-gal诱导的认知功能障碍模型是否成功(根据辨别指数是否明显下降)。每周给KM小鼠称量体重并记录。

5、Morris水迷宫实验：采用Morris水迷宫检测KM小鼠空间记忆能力，包括定位航行、空间探索及对位探索实验。Morris水迷宫的宫体是一个直径120cm，高50cm的圆形水池，水装约40cm高，按照东西南北的方向将水池划分为4个象限，分别命名为I、II、III、IV象限，并依次设置四个入水点(东南点、东北点、西北点、西南点)。平台为圆形，直径10cm，高约30cm放置于水面下，平台表面设计粗糙，以便于KM小鼠站稳，且能保持10s左右。实验中保持水温(25±1)℃，由于KM小鼠为白色，所以使用可食用墨汁将水池染成黑色，以便于录像系统实时追踪KM小鼠的游泳轨迹。实验环境全程保持安静，参照物的设计全部符合实验的标准且稳定不变。实验过程尽量由同一个实验人员操作完成，减少因实验人员引起的不必要的误差。

6、实验前4天为适应期训练。随机选择池壁上某一象限内的一个点，轻托KM小鼠，抓住背部及尾部，以免KM小鼠受到惊吓产生应激行为，使KM小鼠整体面向Morris水迷宫宫体的池壁，将KM小鼠缓缓放入水中，暗处观察KM小鼠的运动情况，实验人员应该待在KM小鼠的视线范围以外，以免影响KM小鼠的游泳速度及范围，60s内找不到平台则用捕鱼网做恰当的引导，使KM小鼠找到平台，并保证KM小鼠在平台上面的停留时间为10s，每天重复四次，每次随机从不同象限的入水点依次放入，每只KM小鼠训练结束后，用布小心擦拭毛发上的水珠，放入饲养笼，进行下一只KM小鼠的训练。

7、实验第5天为空间探索实验，以评价小鼠的空间记忆能力。拆除平台，其余条件均不改变，将KM小鼠于随机入水点放入，详细记录60s内KM小鼠穿越平台象限的次数及穿过目标象限所停留的时间。本实验于随机点放入，重复两次(可以选择I、III象限，或者II、IV象限放入)。

8、第6到8天为对位训练，平台放在原象限对侧(进行获得性训练时所放位置的对角)，随机选择池壁上的某一固定点，轻托KM小鼠，使KM小鼠面向池壁放入水池中，每天训练4次，每次从随机入水点依次放入，引导KM小鼠找到平台，并保证在平台停留10s。

9、第9天为对位探索实验，为评价KM小鼠学习记忆能力。去除平台，其余实验条件不变，实验进行两次。

10、实验结束后，摘除KM小鼠的眼球取血，脱颈处死，快速取出大脑组织，从大脑纵裂处分为两半，一半于4％多聚甲醛中固定，用于后续的组织病理学检查。(1)石蜡切片：将固定好的小鼠海马组织用石蜡包埋并切成4μm大小的切片。(2)脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。(3)染色：首先用苏木素溶液染细胞核，然后用1％盐酸乙醇溶液分化，经过促蓝液返蓝处理后，再用伊红染液染色，自来水洗后，将切片置于烤箱烤干。(4)透明封片：将切片放入干净的二甲苯透明5min，用中性树胶封片。(5)显微镜镜检：在显微镜下观察并采集图像，分析结果。

3、实验结果

Morris水迷宫实验结果：

表3小鼠Morris水迷宫实验结果

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照药物比较，^ΔP＜0.05。

表3中的实验结果表明：模型组穿越目标象限次数和停留时间均显著下降(P＜

0.05)，表示造模成功。与模型组相比，各药物组均可以显著提高模型小鼠穿越想象次数和停留时间，表明均有增强小鼠学习的能力；

黄精糖蛋白(PSW-26)提高实验小鼠记忆力的能力极强，可以达到极显著水平(P

＜0.01)，黄精多糖(专利技术，申请号202210621078.X)提高实验小鼠记忆能力的水平明显，达到显著水平(P＜0.05)；黄精糖蛋白(PSW-26)与黄精多糖(专利技术，申请号202210621078.X)相比，PSW-26明显优于黄精多糖(P＜0.05)；

提取物I、II和PSW-26相比，虽然PSW-26的量是相同的，但是提取物I的效果最好，且明显优于提取物II和PSW-262，这可能与提取物I除含有PSW-262以外，还含有“黄精多糖”以及“其他黄精糖蛋白”等增强记忆力的功效成分相关；

比较制黄精(试验药物1)和干黄精(或鲜黄精)(对照药物2)的提取物I发现，制黄精提取物I的效果明显优于干黄精(或鲜黄精)，这可能与制黄精提取物中PSW-26含量明显高于干黄精或鲜黄精有关，也可能与黄精蒸制以后各种成分均发生了显著变化有关；

由图5可知，模型组实验小鼠大脑海马区出现大量的空泡，表明脑细胞明显减少，这可能是造成模型组实验小鼠“记忆力下降”和“出现老年痴呆”表现的重要原因；各药物组(提取物I、提取物II和PSW-262)均可以大幅度消除大脑的“空泡”，基本上恢复正常，表明显著增加脑细胞的数量，这可能是增强小鼠记忆力和预防老年痴呆的重要物质基；制黄精提取物I和干黄精提取物I相比，出现少量的空泡，表明制黄精提取物增加脑细胞数量的能力优于干黄精或鲜黄精；黄精糖蛋白与多糖组相比，黄精糖蛋白的效果明显优于多糖。

实施例13：黄精提取物抗氧化活性实验

1、实验材料

试验药物1：按实施例3条件制备的提取物I；

试验药物2：按实施例3条件制备的提取物II；

试验药物3：按实施例3条件制备的PSW-26；

对照药物2：未经蒸制的鲜黄精原料，按照实施例4制备的提取物I。

2、实验方法

(1)A549细胞培养和MTT实验：从液氮罐中取出1ml冻存细胞在37℃的水浴锅中迅速解冻，然后在超净工作台上将复苏的细胞液转移到10ml的离心管中，加4ml的细胞培养液，置于离心机中3000rmp离心10分钟，弃去上清，重新加入3ml的细胞培养液吹打混匀后转到细胞培养瓶中，在含有5％的CO2培养箱中培养，温度为37℃。A549细胞的基础培养液为DMEM(含10％FBS和1％青链霉素)。

(2)细胞中的ROS清除实验：首先将细胞接种到48孔板上，单层细胞贴壁24h，用浓度为0，1，10，50，100μg/ml的AAPH分别处理2、4、6、8h，每个浓度设3个重复孔，处理以后换成新鲜的无血清培养基加5mmol/L DCFH-DA2μl处理1h(37℃、5％ CO 2)，然后用PBS洗去残留的DCFH-DA，加入50μL细胞裂解液裂解30秒钟，加入800μL的缓冲液PBS重悬细胞，在荧光分光光度计上检测并拍照，其激发波长485nm，发射波长530nm。

确定AAPH的最佳造模浓度和时间后，根据这个模型来比较药物清除ROS的能力。具体操作是：细胞贴壁后加入无血清培养150μL和1，5，25μg/ml(通过MTT筛选出的浓度)的药物协同培养1h，然后加AAPH协同处理，去除含AAPH的培养基换成新鲜的无血清培养基继续培养到16h，每个浓度设3个重复，2次平行。最后加荧光探针5mmol/L DCFH-DA2μl孵育1h(37℃、5％ CO 2)，用PBS洗去残留的DCFH-DA，加入50μL细胞裂解液裂解后测荧光值。本实验还设有空白组、模型组、药物组，空白组不加药物和AAPH，模型组不加药物，其它操作相同。

3、实验结果

表4药物清除细胞内过氧化物实验结果

注：与空白组比较，#P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照药物1比较，^ΔP＜0.05。

体内过氧化物增多是衰老的重要原因，清除体内过氧化物有抗衰老的作用，表4中的实验结果表明：模型组过氧化物(ROS)显著高于空白组(##P＜0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各药物组的ROS值均有所下降；未炮制的黄精，虽然有所下降将，但直到25μg/mL任然未达显著水平，表明抗氧化作用不明显；按照本工艺炮制(蒸制)以后的黄精，抗氧化作用显著增加，到高剂量时已达显著水平(*P＜0.05)；随着PSW-26浓度的增加，抗氧化的能力不断增强，PSW-26抗氧化的能力最强(即抗衰老的能力最强)(对比试验药物I、试验药物II、PSW-26)；与专利技术提取的黄精多糖相比，本提取得到的黄精糖蛋白PSW-26抗衰老的作用显著优于多糖(ΔP＜0.05)。

黄精经过本工艺技术炮制以后，抗氧化能力显著增加，抗衰老能力显著增加；黄精糖蛋白PSW-262抗氧化作用非常强，远优于专利技术(申请号202210621078.X)提取的黄精多糖。

实施例14：黄精提取物降糖活性实验

1、实验材料

试验药物1：按实施例3条件制备的提取物I；

试验药物2：按实施例3条件制备的提取物II；

试验药物3：按实施例3条件制备的PSW-26；

2、实验方法

细胞中葡萄糖消耗实验：将消化并稀释好的HepG2细胞加入到96孔板中，待细胞铺满率达80％，换掉原培养基，用PBS缓冲液清洗1次，每孔加入250μL含药或不含药的培养液。空白组和每个实验组均重复三次。24h后利用酶法在505nm波长下检测培养液中葡萄糖剩余量。用空白中的葡萄糖残存量减去对照和各处理组的便得到各组的葡萄糖消耗量,GC表示。为了考虑细胞增殖的影响，葡萄糖消耗最终结果用GC/MTT表示。

3、实验结果

表5药物促进HepG2细胞消耗葡萄糖的实验结果

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照药物1比较，^ΔP＜0.05。

表5中的实验结果表明：与空白组相比，各药物组的GC/MTT均有提高。当试验药物1达到中浓度时，GC/MTT比值已有显著增加(*P＜0.05)，高浓度时达到极显著水平(**P＜0.01)，表明试验药物有很好的降糖效果(试验药物1)；随着PSW-26浓度的增加，降糖的能力不断增强，PSW-26的降糖能力最强(对比试验药物I、试验药物II、PSW-26)；与专利技术提取的黄精多糖相比，本提取得到的黄精糖蛋白PSW-26降糖作用的作用显著优于专利技术的多糖(ΔP＜0.05)；此外，还可以看到，黄精按照本工艺技术炮制以后得到的提取物1的降糖效果，明显优于未经炮制的黄精的效果。

实施例15：黄精提取物降血脂活性实验

1、实验材料

试验药物1：按实施例3条件制备的提取物I；

试验药物2：按实施例3条件制备的提取物II；

试验药物3：按实施例3条件制备的PSW-26；

2、实验方法

1)将适量HepG2细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后，加入FFA 0.4/0.2mM(油酸：棕榈酸＝2:1)诱导12h，12h后加入不同浓度的药物，继续培养24小时。胰酶消化收集细胞并计数。

2)每500万个细胞加入1mL的异丙醇，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3min)；然后10000g，4℃离心10min,取上清置于冰上待测。

3)标准溶液的稀释：将50μmol/mL胆固醇标准溶液用提取液进行稀释得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/mL的标准溶液备用。

4)标准曲线的建立：用96孔板进行检测，每孔20μL标准溶液，180μL工作液充分混匀(并设置空白管即20μL异丙醇加180μL工作液)，37℃静置15min，反应完成后测定500nm处吸光值，根据标准管的浓度(x，μmol/mL)和吸光度ΔA标准(ΔA标准＝A标准-A空白)(y，ΔA标准)，建立标准曲线。

5)样品检测：用96孔板进行检测，每孔20μL样品溶液，180μL工作液充分混匀，37℃静置15min，反应完成后测定500nm处吸光值，并根据标准曲线计算样品TC含量，随后计算细胞中总TC总含量。

3、实验结果

表6药物清除细胞内过氧化物实验结果

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照药物1比较，ΔP＜0.05。

表6中的实验结果表明：模型组胆固醇(TC)显著高于空白组(#P＜0.05)，表明造模成功。与模型组相比，各药物组的TC值均有所下降；未炮制的黄精，虽然有所下降将，但直到25μg/mL任然未达显著水平，表明降血脂作用不明显；按照本工艺炮制以后的黄精，降血脂作用显著增加，到高剂量时已达显著水平(*P＜0.05)；随着PSW-262浓度的增加，降血脂的能力不断增强，PSW-26降血脂作用最强(对比试验药物I、试验药物II、PSW-26)；与专利技术提取的黄精多糖相比，本提取得到的黄精糖蛋白PSW-26降血脂的作用显著优于多糖(ΔP＜0.05)。

最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物，其特征在于，所述黄精提取物是由78.5％的多糖和21.5％的蛋白质组成的黄精糖蛋白PSW-26，所述黄精提取物的分子量为26kDa。

2.根据权利要求1所述的一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物，其特征在于，所述多糖的单糖组成包括甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55:1.65:1.10:0.21:1.22:0.20，所述蛋白质由15种氨基酸组成。

3.根据权利要求1或2任一项所述的一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

3)分离纯化：

4.根据权利要求3所述的一种具有增强记忆力、预防老年痴呆作用的黄精提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述调节黄精水分的方式为采用鲜黄精在80℃的条件下烘干脱水至水分含量为30-80％或采用干黄精补水至水分含量为30-80％。

5.根据权利要求1-4任一项所述的黄精提取物在制备增强记忆力、预防老年痴呆、抗氧化、降糖、降血脂药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液体剂型、注射剂、软膏剂、栓剂、气雾剂、中药药剂。