CN115943206A

CN115943206A - 利用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的方法

Info

Publication number: CN115943206A
Application number: CN202180044370.3A
Authority: CN
Inventors: 金成镇; 金相龙; E·金; K·金; 金水晶
Original assignee: Kolon Life Science Inc
Current assignee: Kolon Life Science Inc
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2023-04-07
Also published as: JP2023531934A; EP4170023A1; CA3183701A1; WO2021261892A1; AU2021297631A1; US20230242888A1; KR20230027070A; BR112022026319A2

Abstract

本发明涉及使用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的方法。尽管在相关技术中使用贴壁细胞生产痘苗病毒的方法由于贴壁细胞的特性而具有不适于大量生产病毒的局限性，但是本申请发明人已经开发了一种使用悬浮细胞时即使在生物反应器中使用低的适当细胞数、MOI、培养FBS浓度和培养基也能够生产病毒的技术，并且还证实了本发明具有与使用贴壁细胞的情况类似的高病毒生产能力。因此，使用根据本发明的悬浮细胞生产痘苗病毒的技术能够高产率地大量生产痘苗病毒。由于可以降低使用悬浮细胞的生产成本和时间、人力等，预期该技术将有效地用于需要大量生产痘苗病毒的临床和商业生产领域。

Description

利用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的方法

技术领域

本发明涉及使用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的方法。

背景技术

痘苗病毒也称为牛痘病毒，属于痘病毒科(Poxviridae)，并且是具有约180kb的双链线性DNA基因组的包膜DNA病毒，其编码约250个独立的基因。痘苗病毒具有广泛的宿主，例如哺乳动物和鸟类，并且在各种培养的细胞中增殖以形成白叉，该白叉类似于但大于天花病毒。痘苗病毒的感染通常是非常轻微的并且可以诱导皮疹和发热，但是在健康个体中不会引起症状。由于痘苗病毒感染引起的免疫应答保护人体免受致命的天花感染，所以痘苗病毒已经被用作抵抗天花的活病毒疫苗。

痘苗病毒不仅作为天花疫苗而且作为疫苗递送系统受到关注，而且具有相对较大的线性DNA基因组，因此可以携带各种抗原基因。此外，痘苗病毒具有强的诱导免疫的能力，因此可以用作难以开发的用于治疗和预防传染病的疫苗，抗癌疫苗等的疫苗递送系统，并且通过将外源基因插入减毒的痘苗病毒，可以产生更安全和副作用更少的重组疫苗。

此外，最近开发了使用痘苗病毒作为溶瘤病毒的癌症治疗技术。例如，尽管由SillaJen,Inc.开发的溶瘤痘苗病毒载体是进入临床III期的唯一一个，最近通过接受数据监测委员会(DMC)的拒绝建议中止了相应的临床试验，并且正在进行与免疫检查点抑制剂组合的临床试验。

同时，可用于上述各种目的的大多数痘苗病毒在贴壁细胞中产生。SillaJen,Inc.提交了一种使用贴壁细胞和滚瓶生产痘苗病毒的方法的申请，其中HeLa细胞是子宫癌细胞，用MOI为0.01-0.05pfu/细胞的痘苗病毒感染，并培养以确认生产能力为50pfu，结论是当使用HeLaS3生产痘苗病毒时，HeLaS3是一种悬浮细胞，由于痘苗病毒的低产率，不适合作为生产上述病毒的细胞系(美国专利公开号：US2014/0162342)。在另一项专利中，已经提交了在MRC-5中生产痘苗病毒NYCBOH株的方法，所述MRC-5是人成纤维细胞，并且另一篇文章报道了使用HeLaS3和痘苗病毒WR株生产温度依赖性蛋白而不是痘苗病毒的方法。

如上所述，在相应技术和已报道的相关技术的大多数相关公司中，使用贴壁细胞如Vero,MRC-5和HeLa生产痘苗病毒的方法是已知和使用的。然而，由于粘附细胞的特性，这种现有的生产方法增加了人力、成本和因放大的局限性而引起的时间，因此现有的生产方法不适于病毒的大量生产。

发明公开内容

技术问题

因此，本申请的发明人通过探索和评价从使用悬浮细胞的初始培养到病毒感染和生产的相关条件，以建立能够大量生产痘苗病毒的合适的生产方法，确保了使用表现出高水平病毒生产能力的悬浮细胞生产痘苗病毒的技术。

因此，本申请发明人的一个目的是提供一种使用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的方法。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可以从以下描述清楚地理解未提及的其他问题。

技术方案

为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供了一种大规模生产痘苗病毒的方法，该方法包括以下步骤：

(a)初始培养悬浮的HeLaS3或Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞；

(b)传代培养初始培养的细胞，以5.00E+04至1.00E+05细胞/mL的密度接种传代培养的细胞，然后以0.01至0.1TCID50/细胞的感染复数(MOI)用痘苗病毒感染细胞并培养感染的细胞；和

(c)从细胞培养物中收获病毒。

作为本发明的示例性实施方案，步骤(a)中的初始培养可以是培养细胞直到传2至4代。

作为本发明的另一个示例性实施方案，步骤(a)中的初始培养可以是培养细胞直到传2代。

作为本发明的另一个示例性实施方案，在步骤(a)中，每代中的细胞可以培养3至5天。

作为本发明的另一个示例性实施方案，在初始培养中，可以以1.00E+05至3.00E+05细胞/mL的密度接种1代中的细胞，并且可以以5.00E+04至1.00E+05细胞/mL的密度接种2代中的细胞。

作为本发明的另一个示例性实施方案，细胞可以在补充有胎牛血清(FBS)的培养基中培养。

作为本发明的另一个示例性实施方案，培养基可以是血清样改良Eagle氏培养基(SMEM)或RPMI1640培养基。

作为本发明的另一个示例性实施方案，可以以5％至10％的浓度添加胎牛血清。

作为本发明的另一个示例性实施方案，步骤(c)中的收获可以在用病毒感染细胞后4至6天进行。

作为本发明的另一个示例性实施方案，痘苗病毒可以是选自以下的任一株：WesternReserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、纽约市健康理事会(Wyeth)、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、国际卫生司-J(IHD-J)、国际卫生司-White(IHD-W)、其变体、以及以上的组合。

有益效果

在相关技术中使用贴壁细胞生产痘苗病毒的方法由于贴壁细胞的特性而具有不适于大量生产病毒的局限性。然而，本申请发明人开发了一种使用悬浮细胞时即使在生物反应器中使用低的适当细胞数、MOI、培养物FBS浓度和培养基也能够产生病毒的技术，并且还证实了本发明具有与使用贴壁细胞的情况类似的高病毒产率。因此，使用根据本发明的悬浮细胞生产痘苗病毒的技术能够高产率地大量生产痘苗病毒。由于可以降低使用悬浮细胞的生产成本和时间，人力等，预期该技术将有效地用于需要大量生产痘苗病毒的临床和商业生产领域。

附图说明

图1A举例说明了当分别以3.00E+05、5.00E+05和1.00E+06细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每天测量活细胞数获得的结果，以便选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图1B举例说明了当分别以3.00E+05、5.00E+05和1.00E+06细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每天测量细胞存活力而获得的结果，以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图1C举例说明了当分别以3.00E+05、5.00E+05和1.00E+06细胞/mL的密度接种和培养细胞时，通过每天测量细胞扩增倍数而获得的结果，以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图2A举例说明分别以1.00E+05、3.00E+05和5.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时，通过每天测量活细胞数而获得的结果，以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图2B说明分别以1.00E+05、3.00E+05和5.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时，通过每天测量细胞存活力而获得的结果以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图2C举例说明分别以1.00E+05、3.00E+05和5.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每天测量细胞扩增倍数，而获得的结果，以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+1)培养条件。

图3A举例说明了在步骤P+2中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每天测量活细胞数而获得的结果，以选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+2)培养条件。

图3B举例说明了在步骤P+2中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每天测量细胞存活力获得的结果，以便选择悬浮HeLaS3细胞的初始(P+2)培养条件。

图3C举例说明了在步骤P+2中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时通过每日测量细胞扩增倍数获得的结果，以便选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+2)培养条件。

图4A举例说明了在P+3中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种并培养细胞时通过每天测量活细胞数而获得的结果，以便选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+3)培养条件。

图4B举例说明了在P+3中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时，通过每天测量细胞存活力而获得的结果，以便选择悬浮的HeLaS3细胞的初始(P+3)培养条件。

图4C举例说明了通过在P+3中分别以5.00E+04、1.00E+05和2.00E+05细胞/mL的密度接种和培养细胞时，每天测量细胞扩增倍数而获得的结果，以便选择悬浮HeLaS3细胞的初始(P+3)培养条件。

图5举例说明了在P+3时的细胞接种密度和FBS浓度条件的细胞培养方法，以便在用痘苗病毒感染悬浮的HeLaS3细胞期间和之后测定FBS浓度。

图6A-6H举例说明通过改变P+3时细胞接种密度和FBS浓度的条件，在根据图5的方法培养HeLaS3细胞后测量活细胞数(图6A-6C)和细胞存活力(图6D-6H)获得的结果。

图7举例说明了HeLaS3细胞的细胞培养和病毒生产过程，以便在用痘苗病毒感染期间和之后根据FBS浓度条件分析P+3时的细胞接种密度和病毒产率。

图8A举例说明通过改变P+3的细胞接种密度和FBS浓度的条件，根据图7的方法测量HeLaS3细胞培养和病毒产生后的细胞数获得的结果。

图8B举例说明通过改变P+3时细胞接种密度和FBS浓度的条件，根据图7的方法测量HeLaS3细胞培养和病毒产生后的存活力而获得的结果。

图8C举例说明通过改变P+3时的细胞接种密度和FBS浓度的条件，在根据图7的方法的HeLaS3细胞培养和病毒产生之后测量病毒产率(TCID50/细胞)而获得的结果。

图9举例说明了根据痘苗病毒感染MOI，收获日和HeLaS3细胞在P+3的细胞接种密度条件进行细胞生长和病毒生产分析的细胞培养和病毒生产过程(初步实验)。

图10A举例说明了在P+3的细胞接种密度为1.00E+05时，通过改变感染MOI，在根据图9的方法进行实验之后，收获样品并测量每个收获日的活细胞数的结果。

图10B举例说明了在P+3的细胞接种密度为1.00E+05时，通过改变感染MOI，在根据图9的方法进行实验后的每个收获日收获样品和测量细胞存活力的结果。

图10C举例说明了在P+3的细胞接种密度为5.00E+05(图10B)时，通过改变感染MOI，在根据图9的方法进行实验之后，收获样品并测量每个收获日的活细胞数的结果。

图10D举例说明了在P+3的细胞接种密度为5.00E+05(图10B)时，通过改变感染MOI，在根据图9的方法进行实验之后，在每个收获日收获样品并测量细胞存活力的结果。

图11A举例说明确认图10中收获的每个样品的总病毒产量的结果，以便分析病毒产率。

图11B举例说明确认图10中收集的每个样品产生每细胞的病毒(TCID50/细胞)的能力以分析病毒产率的结果。

图12A举例说明了通过进行第二次实验来确定HeLaS3细胞的痘苗病毒感染MOI，收获日和在P+3的细胞接种密度条件而确认活细胞数的结果，其中通过将接种密度设定为5.00E+04细胞/mL并改变收获日条件，并在每个收获日收获样品来进行实验。

图12B举例说明了通过进行第二次实验来确定HeLaS3细胞的痘苗病毒感染MOI，收获日和在P+3的细胞接种密度条件而确认存活力的结果，其中通过将接种密度设定为5.00E+04细胞/mL并改变收获日条件，并在每个收获日收获样品来进行实验。

图12C举例说明了通过进行第二次实验来确定HeLaS3细胞的痘苗病毒感染MOI，收获日和在P+3的细胞接种密度条件确认活细胞数的结果，其中通过将接种密度设定为1.00E+05细胞/mL并改变收获日条件，并在每个收获日收获样品来进行实验。

图12D举例说明了通过进行二次实验来确定HeLaS3细胞的痘苗病毒感染MOI，收获日和在P+3的细胞接种密度条件来确认存活力的结果，其中通过将接种密度设定为1.00E+05细胞/mL并改变收获日条件，并在每个收获日收获样品来进行实验。

图13A举例说明确认图12A至12D中收获的样品的总病毒产量的结果，以便分析病毒产率。

图13B举例说明确认在图12A至12D中收获的样品产生每细胞的病毒(TCID50/细胞)以分析病毒产率的能力的结果。

图14A举例说明通过在细胞接种密度和感染MOI固定的条件下进行实验，然后分别在第3,4,5,6和7天收获所有样品，以另外选择收获病毒感染后的细胞和培养液的日期，来分析活细胞数的结果。

图14B举例说明通过在细胞接种密度和感染MOI固定的条件下进行实验，然后分别在第3,4,5,6和7天收获所有样品，以另外选择收获病毒感染后的细胞和培养液的日期，来分析细胞存活力的结果。

图15A举例说明了使用图14A和14B中收获的样品确认总病毒产生量的结果。

图15B举例说明了利用图14A和14B中收获的样品确认每个细胞产生病毒的能力的结果。

图16举例说明了病毒生产放大的方法，其中通过实施例应用为HeLaS3细胞的初始培养条件，病毒感染的细胞接种密度，MOI和收获日选择条件。

图17A举例说明了在根据图16的方法进行实验之后放大之前和之后确认细胞数目和存活力的结果。

图17B举例说明了在根据图16的方法进行实验之前和之后的放大实验之前和之后确认病毒产率的结果。

图18举例说明了用于选择HeLaS3细胞的培养基的实验方法。

图19A举例说明了在进行实验后通过根据图18的方法将HeLaS3细胞的培养基改变为P+1至P+3的SMEM,JMEM或RPMI1640来确认活细胞数的结果。

图19B举例说明了在进行实验后通过根据图18的方法将HeLaS3细胞的培养基改变为P+1至P+3的SMEM,JMEM或RPMI1640来确认细胞存活力的结果。

图20举例说明了在根据图18的方法通过将HeLaS3细胞的培养基在P+1至P+3处改变而进行实验之后比较分析病毒产率的结果。

发明模式

本申请发明人通过探索和评价从使用悬浮细胞的初始培养到病毒感染和生产的相关条件，以建立能够大量生产痘苗病毒的生产方法，从而确保了使用表现出高水平病毒生产能力的悬浮细胞生产痘苗病毒的技术。

在下文中，将详细描述本发明。

因此，本发明提供了一种大规模生产痘苗病毒的方法，该方法包括：(a)最初培养悬浮的HeLaS3或Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞；(b)传代培养初始培养的细胞，以5.00E+04至1.00E+05细胞/mL的密度接种传代培养的细胞，然后以0.01至0.1TCID50/细胞的感染复数(MOI)用痘苗病毒感染细胞并培养感染的细胞；以及(c)从细胞培养物中收获病毒。

在本发明中，“痘苗病毒”包括痘苗病毒和含有该病毒的痘苗病毒溶液，除非另有说明。痘苗病毒溶液不受特别限制，只要它含有痘苗病毒，并且包括，例如，培养感染痘苗病毒的宿主细胞后的培养上清液和从培养上清液中除去杂质后的病毒悬浮液。

痘苗病毒可以是选自以下的任一株：WesternReserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、纽约市健康理事会(Wyeth)、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、国际卫生司-J(IHD-J)、国际卫生司-White(IHD-W)、其变体、以及以上的组合，并且可以优选地是IHD-W，但不限于此。

如本文所用，术语“悬浮细胞”是指在细胞培养过程中在培养基中以悬浮状态增殖而不粘附到培养板上的细胞，并且在传代培养时，在不更换培养基的情况下进行稀释培养。在本发明中可用于产生痘苗病毒的悬浮HeLaS3和MDCK细胞是具有贴壁细胞特征，但可调节以在悬浮液中生长的细胞。HeLaS3是亲本HeLa谱系的克隆衍生物，其是人子宫癌细胞，并且是适于转染的细胞系，MDCK是犬肾来源的细胞，并且在本领域中被称为能够增殖各种病毒的细胞系。

在本发明中，研究并建立了可以使用悬浮细胞大量生产痘苗病毒的最佳生产方法。

在本发明中，步骤(a)是最初培养悬浮的HeLaS3或MDCK细胞的步骤。

初始培养可以通过解冻冷冻的悬浮细胞，接种解冻的悬浮细胞，并培养接种的悬浮细胞直到传代2至4代，优选直到传2代(P+2)来进行。对于初始培养，优选在细胞接种后培养每代的细胞3-5天，更优选在培养4天后进行传代培养。

此外，在初始培养直到传2代(P+2)的情况下，优选以1.00E+05至3.00E+05细胞/mL的密度接种1代的细胞和以5.00E+04至1.00E+05细胞/mL的密度接种2代的细胞，并且更优选地，当1代的细胞和2代的细胞以1.00E+05细胞/mL和5.00E+04细胞/mL分别接种时，可以诱导最佳细胞生长。

在本发明的一个具体的示例性实施方案中，证实了通过在各种条件下培养细胞并分析活细胞数和细胞存活力以便在用病毒感染悬浮的HeLa S3细胞之前选择初始培养条件，特别是细胞的接种密度和培养周期，上述条件是批量生产痘苗病毒的最佳初始培养条件(参见实施例1)。

细胞可以在补充有胎牛血清(FBS)的培养基中培养，并且优选地，作为细胞的培养基，可以使用血清样改良Eagle氏培养基(SMEM)或RPMI1640培养基，并且更优选地，在细胞的培养效率和经济可行性方面使用RPMI1640，但是该培养基不限于此。在这种情况下，可以以5％至10％的浓度添加胎牛血清，并且在步骤(a)的初始培养期间可以优选以10％的浓度包含胎牛血清。

除了选择用于初始培养的条件外，培养温度、二氧化碳浓度和悬浮细胞的传代培养方法没有特别限制，并且本领域技术人员可以根据相关领域中用于细胞培养的典型条件和方法适当地进行初始培养。

在本发明中，步骤(b)是在初始培养后用痘苗病毒感染接种的细胞的步骤。例如，在初始培养直至传2代(P+2)的情况下，步骤(b)是培养初始培养的细胞至传3代(P+3)并接种传代培养的细胞，然后用痘苗病毒感染接种的细胞的步骤。

在步骤(b)中，在病毒感染期间细胞的接种密度优选为5.00E+04至1.00E+05细胞/mL，更优选地，当细胞以5.00E+04细胞/mL接种时，可以诱导最佳的细胞生长和病毒产量。

此外，在病毒感染期间，感染复数(MOI)优选为0.01-0.1TCID50/细胞，更优选地，当细胞以0.01的MOI感染时，可以诱导最高的细胞生长和病毒产率。

如本文所用，术语“感染复数(MOI)”是指药剂(例如病毒)与感染靶标(例如宿主细胞)的比率。它是指病毒颗粒的数目与有限空间中存在的靶细胞的数目的比率。

此外，在步骤(b)中，作为用于培养病毒感染的悬浮细胞的培养基，可以使用补充有5％至10％FBS的SMEM或RPMI1640培养基，更具体地，优选使用补充有5％FBS的培养基。

本申请的发明人通过实施例证实上述步骤(b)中的条件是最佳大量生产条件。

也就是说，在本发明的另一个具体的示例性实施方案中，为了确定感染后用病毒感染悬浮的HeLaS3细胞和培养物期间添加的FBS的浓度，将细胞以不同的密度接种，并分别以0,2,5和10％FBS的浓度培养，然后比较分析痘苗病毒的细胞生长和产率，并如上所述选择病毒感染的最佳细胞接种密度和FBS浓度(参见实施例2)。

在本发明的另一个示例性实施方案中，进行实验以选择病毒感染MOI，细胞和培养基收获期，以及悬浮HeLaS3细胞中用于病毒感染的细胞接种密度条件。具体地，当以不同的密度和MOI接种细胞并改变收获周期时，比较细胞生长和痘苗病毒产量以选择如上所述的最佳条件(参见实施例3-1至3-3)。

在本发明中，痘苗病毒的产率通过总病毒产生量和每个细胞产生病毒的能力(TCID50/细胞)来评价。每个细胞产生病毒的能力与“滴度”同义，其在本领域中通常用作指示病毒感染滴度的单位。由于使用光学显微镜不能看见病毒，因此在显微镜下不能如生物细胞那样测量它们的密度(数量/体积)。因此，在病毒的情况下，使用针对宿主细胞的感染性的感染性滴度作为单位，并代替其量或浓度。例如，当将稀释至适当比例的病毒悬浮液加入到宿主细胞的单层中时，病毒的数目被检测为噬斑，感染滴度可以被测量为噬斑形成单位(pfu)/mL。或者，可通过稀释含有病毒的液体并设定产生宿主细胞阳性感染的百分比为50％时的浓度作为50％组织培养感染剂量(TCID50)/mL来测量感染滴度。在本实施例中，痘苗病毒的产率，即感染滴度，被测量为TCID50/mL，但本发明不限于此。

除了上述选择的条件外，培养悬浮细胞和用病毒感染细胞的方法没有特别限制，并且本领域技术人员可以适当地应用和实施本领域通常使用的方法。

在本发明中，步骤(c)是从细胞培养物中收获病毒以获得通过步骤(b)产生的病毒的步骤。

为了收获病毒，优选收获培养的细胞和培养物。病毒可以在病毒感染后4-6天收获，优选在病毒感染后5天收获。

从通过该步骤收集的样品中，本领域技术人员可以通过本领域使用的方法获得最终产生的病毒并分析产率。

在本发明的另一个示例性实施方案中，在1.8L规模上进行病毒生产放大实验，以检查本发明的痘苗病毒的生产条件是否可应用于病毒的实际大量生产过程，然后分别分析活细胞数、细胞活力和病毒产率。结果，证实了在两个规模(30mL和1800mL)中，细胞数目和存活力都显示相似，并且病毒产率也相似。通过这一点，证实了使用根据本发明的悬浮细胞的痘苗病毒的生产方法和建立的条件可应用于大规模生产规模(参见实施例3和4)。

在本发明的另一个示例性实施方案中，进行用于选择用于悬浮的HeLaS3细胞的培养基的另外的实验，以便进一步提高病毒产率或在选择的病毒生产过程中确保生产成本降低效果。结果，证实了RPMI1640与步骤中使用的SMEM相比也显示出类似的细胞生长和病毒产生效果，并且基于这些结果，确定了使用RPMI1640培养基是合适的，该培养基更容易供应并且可以降低成本(参见实施例4)。

通过本发明的生产方法最终产生的痘苗病毒可以不同地用于基础研究和临床领域，例如疫苗，用于治疗癌症的溶瘤病毒和作为递送系统的病毒载体。

在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.悬浮的HeLaS3细胞培养条件的选择

为了建立悬浮的HeLaS3细胞(该细胞是生产痘苗病毒的细胞系)的培养条件，本申请的发明人进行了实验，选择在细胞解冻后从P+1到P+3的初始培养条件。

1-1.P+1培养条件的选择

首先，为了选择P+1的培养条件，在下表1所示的条件下将细胞解冻并接种，然后在培养细胞的同时每天测量活细胞数、细胞存活力和细胞扩增倍数。

[表1]

作为在上述条件下培养细胞并进行实验的结果，如图1A至1C所示，发现在不更换培养基的情况下最大生长的细胞数为约2.00E+06个细胞/mL，并且细胞密度越高，可以在更快的时间内获得高细胞数。然而，作为证实细胞扩增倍数的结果，证实了当细胞以3.00E+05细胞/mL的最低密度接种时，细胞以最高效率培养。因此，可以看出，在细胞接种期间，当细胞密度低时，培养效率比当细胞密度高时更好。

基于上述结果，通过将细胞的接种密度改变为1.00E+05、3.00E+05和5.00E+05来比较分析细胞生长，如下表2中所示，在随后的实验中使用3.00E+05细胞/mL作为标准。

[表2]

细胞系	HeLaS3
		培养基	SMEM(10％FBS,1％AA)
培养规模	30mL，在125mLEMF中
		RPM	110rpm
培养箱条件	<![CDATA[37℃5％CO<sub>2</sub>]]>
		细胞接种密度	1.00E+05,3.00E+05,5.00E+05细胞/mL

作为在表2所示的条件下培养细胞的结果，如从图2A至2C中可见，证实了在培养期期间细胞的最大数目对于所有三种细胞密度条件都是相似的，但是当细胞以1.00E+05的最低密度接种时，存活力显示为最高。此外，在其他两种密度条件下，该图达到峰值并立即下降，使得难以设定传代培养循环，而在1.00E+05的情况下，由于第4天和第5天之间的时期显示为稳定期，因此确定了在培养的第4天适于传代培养细胞。

因此，在P+1培养期间，设定以1.00E+05细胞/mL接种细胞并在4天后传代培养细胞的条件。

1-2.P+2培养条件的选择

接着，为了选择P+2的培养条件，根据下表3中所示的条件培养细胞，并比较分析根据细胞接种密度条件的细胞培养效率。在这种情况下，观察到初始高细胞密度通过设定P+1的培养条件的方法更倾向于导致低的培养效率，并且在本实验中，进一步降低细胞接种密度以设定条件并培养细胞。

[表3]

细胞系	HeLaS3
		培养基	SMEM(10％FBS,1％AA)
培养规模	30mL，在125mLEMF中
		RPM	110rpm
培养箱条件	37℃5％CO2
		细胞接种密度	5.00E+04,1.00E+05,2.00E+05细胞/mL

作为实验的结果，如图3A至图3C所示，证实了达到最大细胞数的时间根据细胞的接种密度而不同，但是在所有情况下最终的细胞数显示为约2.00E+06个细胞/mL或更高，并且从显示细胞存活力和扩增倍数在最低密度下是最高的观察中，细胞效率在5.00E+04个细胞/mL的最低密度下是最佳的。当考虑细胞在选择P+2培养条件的对数期中传代培养时，确定当扩增倍数也高同时保持存活力时，适合以5.00E+04细胞/mL接种细胞并在第4天传代培养细胞。上述条件的优点在于培养效率如此之高，以致于将来在P+3时培养规模可扩大至约750mL，并且因为培养周期与P+1中相同，便捷性高。

1-3.P+3培养条件的选择

此外，为了选择P+3的条件，在通过实施例1-1和1-2选择的P+1和P+2条件下培养细胞，然后在下表4中的条件下进行P+3的培养。

[表4]

如图4A-4C所示，培养的结果证实观察到与P+2类似的生长曲线，细胞培养效率在5.00E+05细胞/mL时最高，这是低接种密度。此外，考虑到对数期状态下的培养效率和细胞存活力，确定在细胞以与P+2相同的方式培养后的第4天进行传代培养是合适的。

因此，直到在实施例中选择的P+1,P+2和P+3的初始培养条件总结在下表5中，并且在用于将来选择痘苗病毒生产条件的实验期间，在上述条件下培养HeLaS3细胞。

[表5]

细胞系	HeLaS3
		培养基	SMEM(10％FBS,1％AA)
培养规模	30mL，在125mLEMF中
		RPM	110rpm
培养箱条件	<![CDATA[37℃5％CO<sub>2</sub>]]>
		P+1细胞接种密度和传代培养周期	1.00E+05细胞/mL,第4天
P+2细胞接种密度和传代培养周期	5.00E+04细胞/mL,第4天
		P+3细胞接种密度和传代培养周期	5.00E+04细胞/mL,第4天

实施例2.悬浮的HeLaS3细胞培养过程中FBS浓度的选择

本申请发明人进行了以下实验以选择能够在悬浮的HeLaS3细胞的培养中表现出最佳细胞生长和痘苗病毒产率的FBS浓度。

2-1.根据FBS浓度观察细胞生长

首先，为了根据培养基中的FBS浓度观察HeLaS3的细胞生长，在如以下图5中通过实施例1选择的条件下培养细胞，然后将P+3下的细胞接种密度设定为5.00E+04、5.00E+05和1.00E+06细胞/mL，并且通过在在每种情况下四个条件(0、2％、5％和10％)下改变FBS浓度进行培养的同时分析细胞生长曲线。

作为在进行P+3培养时分别分析活细胞数和细胞存活力的结果，发现在0％FBS的条件下，如所预期的，细胞没有生长并且保持低存活力，如图6A至6H所示。尽管在2％FBS的条件下观察到细胞数的轻微增加，但没有观察到显著的生长效率，并且除了5.00E+04细胞/mL是最低的细胞密度的情况外，从培养的初始阶段观察到细胞活力的降低。在5％FBS的情况下，在所有细胞密度下直到培养第2天都出现与作为阳性对照的10％FBS的生长曲线相似的生长曲线，并且在低密度下对细胞观察到相似的存活力。通过上述结果，预期病毒产率也将是低的，因为在病毒感染和细胞培养期间，在0-2％FBS的条件下，细胞的状态对于痘苗病毒的产生是不好的。然而，为了确认取决于FBS浓度的实质性病毒产率，在与上述相同的FBS条件下进行病毒产率验证实验。

2-2.根据FBS浓度和条件的选择确认痘苗病毒(VACV)的产率

接着，为了证实根据FBS浓度在悬浮的HeLaS3细胞中痘苗病毒的产率，根据图7的方法进行实验。在这种情况下，以5.00E+05或1.00E+06细胞/mL的细胞接种密度，2,5或10％的FBS浓度和0.1TCID50/细胞的MOI用痘苗病毒感染细胞。随后，将细胞培养4天，收集细胞和培养基，并在每种条件下评价病毒产率。

作为在两种细胞密度条件的每一种下根据FBS浓度分析活细胞数和细胞存活力的结果，如图8A至8C所示，发现随着细胞培养和病毒产生，观察到细胞数和存活力的降低，并且在5.00E+05细胞/mL下，随着FBS浓度的增加，细胞数和存活力也稍微增加。相反，在1.00E+06细胞/mL的情况下，显示细胞数目和存活力与FBS浓度增加相似。通过这些结果，可以预期在5.00E+05细胞/mL下，病毒产率将根据FBS浓度而存在差异。实际上，作为通过TCID50评估痘苗病毒的产率的结果，该TCID50能够确认每个细胞产生病毒的能力，发现取决于在5.00E+05细胞/mL时每种FBS条件，病毒产率存在很大差异，并且确认在5％FBS的条件下产率最高。因此，为了以高滴度生产痘苗病毒，在细胞感染期间和之后最终选择5％的FBS浓度。

实施例3.悬浮的HeLaS3细胞中病毒感染和收获条件的选择

3-1.病毒感染MOI、收获日和细胞接种密度的初步试验

进行选择感染复数(MOI)、收获日和细胞接种密度条件的实验，以进一步提高病毒产率，同时使用通过实施例1和2中的实验选择的悬浮HeLa S3细胞的初始培养方法和牛痘病毒的感染和产生期间的FBS浓度条件。根据图9中所述的方法和条件进行实验，具体地，将病毒感染MOI设定为0.01,0.1和1TCID50/细胞的条件，并且在病毒感染后第2,3,4和5天，分别通过收获细胞和培养基来评价病毒产率。此外，将病毒感染的细胞的接种密度设定为1.00E+05细胞/mL和5.00E+05细胞/mL的两个条件。

首先，作为分别根据MOI和收获日分析活细胞数和细胞存活力的结果，在两种细胞密度条件下，如图10A至10D所示，在两种密度条件下，最低MOI为0.01，发现细胞数增加，然后保持或降低，并且观察到细胞存活力随着病毒感染浓度和孵育期的增加而降低。通过这种模式，可以预测病毒随后是通过病毒感染产生的。

此外，通过对培养开始后第2-5天收获的样品进行TCID50分析来分析病毒产率。结果，如图11A所示，在细胞以5.00E+05细胞/mL接种并以0.01的MOI感染并在3,4和5天后收获的条件下，总病毒产率显示最高。然而，如图11B所示，证实了当以1.00E+05细胞/mL的密度接种细胞，然后以0.01的MOI感染病毒，并在第3,4和5天后收获时，每个细胞产生病毒的实际能力是最高的。此外，考虑到当使用贴壁HeLa细胞作为内标物时痘苗病毒的产率为300TCID50/细胞或更高，可以证实，即使在本发明的上述条件下使用悬浮细胞的HeLaS3细胞，也可以产生300TCID50/细胞或更高的病毒。5.00E+05细胞/mL使用比1.00E5细胞/mL多5倍的细胞，但总产生量没有显著差异，显示出非常低的生产效率，因此细胞主要以1.00E+05细胞/mL的密度接种，以0.01的MOI感染病毒，然后在第3-5天收获以选择条件。此外，参照图11A和11B，可以观察到接种细胞的密度和MOI越低，病毒产量越高，因此在随后的二次实验中，尝试通过优先进一步降低细胞密度来进行实验。

3-2.用于选择病毒感染MOI、收获日和细胞接种密度的二次实验

基于实施例3-1的结果，进行用于选择痘苗病毒感染MOI，收获日和细胞接种密度的二次实验。整个过程与实施例3-1中进行的图9相同，条件是在P+3时，将细胞接种密度调节至5.00E+04和1.00E+05细胞/mL，并且在图11A和11B中，当在感染后第2天收获样品时，在感染后第3,4和5天分别收获细胞和培养基溶液，除了在收获条件下的第2天之外，因为在所有情况下的生产率都显示为低。

首先，作为在上述两种细胞密度条件下根据MOI和收获日期分析活细胞数和细胞存活力的结果，如图12A至12D所示，观察到细胞数增加并且存活力也保持直到培养的第4天。证实在1.00E+05细胞/mL的较高浓度下，细胞数目增加并维持存活力直到培养的第3天。

此外，作为通过用病毒感染细胞并对培养3-5天后收获的每个样品进行TCID50测定来分析病毒产率的结果，如图13A所示，证实病毒产率如所预期的在低细胞密度(5.00E+04细胞/mL)下较高，并且如图13B所示，证实病毒以300TCID50/细胞或更高产生，这是痘苗病毒在粘附的HeLa细胞中的产率，用作内标。特别地，0.01的MOI的感染状况显示出这样的模式，其中随着收获日从第3天增加至第5天，生产率继续增加而不下降。基于上述结果，细胞接种密度选择为5.00E+04细胞/mL，其低于实施例3-1的初步实验的密度，并且选择这样的条件，在该条件下，细胞以0.01TCID50/细胞的MOI感染病毒，并且在5天后收集细胞和培养基。

3-3.选择另外收获日的实验

由于产率随收获日延长而增加的模式如图13B所示，本申请发明人进行了用于验证痘苗病毒的产率是否通过延长收获日而增加的实验。进行与实施例3-1中进行的图9类似的总体实验过程，条件是在P+2，将SMEM培养基调节至80mL，并且基于上述实验结果，通过将病毒感染的细胞接种密度固定在5.00E+04细胞/mL和MOI固定在0.01TCID50/细胞，并且仅在第3、4、5、6和7天设置收获日，进行实验。

首先，如图14A和14B所示，作为分析细胞数目和存活力的结果，发现在病毒感染后3-5天细胞数目增加，然后降低，并且证实了从第4天存活力急剧降低。

此外，作为根据收获日分析痘苗病毒产率的结果，如图15A和15B所示，从第5天开始，发现在维持细胞生长的同时病毒产量不再增加。根据这些结果，最终选择用病毒感染细胞并在5天后收获病毒。

3-4.放大痘苗病毒生产

由于通过上述实施例的结果选择了用于生产痘苗病毒的条件，即初始细胞培养条件，用于感染的病毒接种密度，MOI和收获日条件，因此进行病毒生产放大实验以在搅拌罐反应器(STR)中以1.8L的规模生产痘苗病毒。具体地，根据图16中的方法进行实验，并将最终分析的病毒的生产率与上述实施例中的30mLEMF规模的结果进行比较。

具体地，如图17A所示，通过用病毒感染细胞并在4天后收集所有样品来分析活细胞数，细胞存活力和病毒产率中的每一个的结果，证实了在两个规模(30mL,1800mL)下观察到细胞数和存活力相似，并且如图17B所示，证实了病毒产率也相似。这样的结果表明，已经选择用于STR中痘苗病毒生产的条件可以在下文中使用，因为在30mLEMF规模的小规模上选择的上述工艺条件适合于在1.8LSTR规模上生产痘苗病毒的条件。因此，可以实现从EMF到STR的放大。

实施例4.悬浮的HeLaS3细胞培养基的选择

本申请发明人进行了选择HeLaS3细胞的培养基的实验，以进一步提高病毒产量或确保在实施例1至3中选择的条件下降低生产成本的效果。根据图18所示的条件和程序进行初始细胞培养和病毒生产，通过将细胞的培养基分别更换为SMEM,JMEM和RPMI1640来培养细胞，并通过在P+3用痘苗病毒感染细胞来确认病毒生产。此外，通过在第3-5天设置收获日以预期培养基引起的病毒产率的变化来进行实验。

4-1.按培养基类型分析细胞生长

首先，分析活细胞数和细胞存活力以研究培养基类型的变化如何影响悬浮的HeLaS3细胞的生长。

结果，如图19A和19B所示，当培养2天后使用三种培养基时，细胞数目和存活力没有显著差异。因此，确定改变培养基不会在培养HeLaS3细胞中引起任何主要问题，并且除了痘苗病毒的产率之外，确定更容易提供和更便宜的RPMI1640培养基在实际病毒生产方面是有利的。

4-2.按培养基类型分析病毒产率

本申请发明人观察到HeLaS3细胞被类似地培养，而与培养基的类型无关，并且基于这些结果，进行了用于研究培养基类型对实际病毒产率的影响的实验。为此目的，在培养细胞后，用病毒感染细胞，通过TCID50比较分析病毒产量。

结果，如图20所示，证实了除了JMEM培养基外，当使用已在相关技术中使用的SMEM和RPMI1640时，病毒产率优于300TCID50/细胞或更高的内标，并显示处于相似水平。通过这些结果，可以推断RPMI1640可以在痘苗病毒的生产过程中使用。总的来说，考虑到HeLaS3细胞的培养效率和痘苗病毒的生产能力，确定了使用RPMI1640培养基是合适的，该培养基易于供应并且可以降低成本，因此，最终选择RPMI1640作为细胞培养和病毒生产的培养基。

4-3.利用悬浮的HeLaS3细胞衍生痘苗病毒最终生产过程

通过实施例的结果，建立了能够在悬浮的HeLaS3细胞中高效生产痘苗病毒的最终工艺条件。最终的加工条件示于下表6中，可以看出，当在这样的条件下产生病毒时，可以产生等于或高于300TCID50/细胞的水平的病毒，300TCID50/细胞是在贴壁HeLa细胞中的痘苗病毒的产率，其通过使用悬浮的细胞用作内标。

[表6]

本发明的上述描述是为了说明的目的而提供的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改成其它特定形式。因此，应当理解，上述实施例仅在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。

工业实用性

本发明涉及一种使用悬浮的细胞大量生产痘苗病毒的方法，并且为了大量生产现有技术中不可能大量生产的痘苗病毒，通过特异性地建立合适的细胞数目、MOI、培养物FBS浓度和培养基条件来保证大量生产痘苗病毒的技术。因此，使用根据本发明的悬浮细胞生产痘苗病毒的技术能够高产率地大量生产痘苗病毒。由于可以降低使用悬浮细胞的生产成本和时间、人力等，预期该技术将有效地用于需要大量生产痘苗病毒的临床和商业生产领域。

Claims

1.大量生产痘苗病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)初始培养悬浮的HeLaS3或Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞；

(c)从细胞培养物中收获病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的初始培养是培养细胞直到2至4代。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中的初始培养是培养细胞直到2代。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在步骤(a)中，将每代中的细胞培养3至5天。

5.根据权利要求3所述的方法，其中在初始培养物中，将1代中的细胞以1.00E+05至3.00E+05细胞/mL的密度接种，2代中的细胞以5.00E+04至1.00E+05细胞/mL的密度接种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞在补充有胎牛血清(FBS)的培养基中培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基是血清样改良Eagle氏培养基(SMEM)或RPMI1640培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其中胎牛血清以5％至10％的浓度加入。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的收获在用病毒感染细胞后4至6天进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述痘苗病毒是选自以下的任一株：WesternReserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、纽约市健康理事会(Wyeth)、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、国际卫生司-J(IHD-J)、国际卫生司-White(IHD-W)、其变体、以及以上的组合。