CN115933152A - 一种实时多面自动对焦系统及对焦方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实时多面自动对焦系统及对焦方法，包括对焦光源、激光衰减片、小孔光阑、第一二向色镜、第一管镜、第二二向色镜、通过电机驱动移动的物镜，对焦光源发出的光线依次经过激光衰减片和小孔光阑后从第一二向色镜透射出并依次经过第一管镜和第二二向色镜的透射进入物镜；第一二向色镜反射照明系统的光线并与对焦光源过来的光线合束成共轴光路，第二二向色镜透射合束的光线并反射通过物镜的荧光至成像系统，电机和成像系统分别与一控制主机电性连接，同时公开了利用该自动对焦系统进行对焦的方法。该发明操作简单，对生物芯片的多层实行自动对焦，提升测序设备的通量，避免生物试剂的浪费，降低试验成本。

Description

一种实时多面自动对焦系统及对焦方法

技术领域

本发明涉及荧光显微成像领域，尤其是一种实时多面自动对焦系统及对焦方法。

背景技术

荧光显微成像在生物医学研究领域有着重要作用，而荧光显微镜的自动对焦方法是荧光显微成像的关键。目前的自动对焦系统，自动对焦调节需要专业的人员进行专业培训之后才能掌握装调方法，调节过程中需要反复多次试错调节，而且现有的自动对焦系统只能够实现对单一目标面进行自动对焦，不能够对生物芯片的多个面实现多面自动对焦，不仅会造成测序设备通量的降低，还会造成生物试剂的浪费，生物芯片自身具有一定的厚度，中间具备流体，呈现一个三明治结构，这样光线经过生物芯片时就会经过多个面的反射，每个面的反射都需要对焦；而且对被拍摄的目标物具备特殊性要求，对于三明治结构的生物芯片在拍摄下层生物荧光基团的时候，能量值非常的低，对焦稳定性差，同时受生物试剂杂质、光学镜片灰尘的影响非常严重，轻微的散射信号便会造成对焦位置的变化。对设备运行环境和生物芯片质量的要求苛刻，不利于成本的降低，也不利于设备的大批量推广应用。

发明内容

针对现有的不足，本发明提供一种实时多面自动对焦系统及对焦方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种实时多面自动对焦系统，包括对焦光源、激光衰减片、小孔光阑、第一二向色镜、第一管镜、第二二向色镜、通过电机驱动相对对焦光源移动的物镜，所述对焦光源发出的光线依次经过激光衰减片和小孔光阑后从第一二向色镜透射出并依次经过第一管镜和第二二向色镜的透射进入物镜；所述第一二向色镜反射照明系统的光线并与对焦光源过来的光线合束成共轴光路，所述第二二向色镜透射合束的光线并反射通过物镜的荧光至成像系统，所述电机和成像系统分别与一能分析物镜所处位置并操控电机动作的控制主机电性连接。

作为优选，所述小孔光阑调节主光线角度的范围是0-45度。

作为优选，所述照明系统包括照明光源、在照明光源所发射光线光路上依次设置的聚光准直透镜、复眼透镜、第三二向色镜、积分聚焦透镜、激发滤光片和消杂光光阑，所述照明光源发射的光线通过消杂光光阑后射向第一二向色镜并被第一二向色镜反射。

作为优选，所述成像系统包括在第二二向色镜反射光路上依次设置的出射滤光片、第二管镜和工业相机。

作为优选，所述对焦光源是半导体激光二极管、固体激光器中的任意一种。

作为优选，所述控制主机依据自动对焦曲线对样品测试时物镜和成像系统记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机的反馈值指导电机驱动物镜移动到最佳焦面。

一种实时多面自动对焦方法，采用如前任意一项所述对焦系统，步骤如下：

S1，将生物芯片在荧光显微系统物镜的后焦面上手动对焦；

S2，手动对焦完成后通过自动对焦系统依据对焦光源照射生物芯片后在相机端对焦光斑的形态确定物镜在最佳焦面时物镜的Z轴位置坐标；

S3，将物镜沿最佳焦面时的Z轴位置坐标上下移动，触发相机拍照形成原始模型库；

S4，将原始模型库中的图片依据物镜的Z轴位置变化量和相机端对焦光斑移动量的函数关系建立自动对焦曲线；

S5，依据自动对焦曲线对样品测试时物镜和相机记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机的反馈值指导电机驱动物镜移动到最佳焦面。

作为优选，所述步骤S4是通过与电机和相机电性连接的控制主机进行差异化分析并给出电机驱动指令的。

作为优选，所述自动对焦曲线的纵坐标是物镜的Z轴位置，横坐标是相机端对焦光斑移动量。

作为优选，所述对焦光斑包括生物芯片各个反射面反射对焦光线在相机端所形成的光斑。

本发明的有益效果在于：该发明装调方便快捷，对装调人员的专业性没有特殊的要求，能够对生物芯片的多层实现自动对焦，对每一个面都可以进行准确对焦拍摄，提升测序设备的通量，避免生物试剂的浪费，降低试验成本，对被拍摄的目标物没有特殊要求，在拍摄生物芯片的下层生物荧光基团的时候，可以保证自动对焦光斑良好的形态分布以及反射的能量值，对上下层自动对焦拍摄都能够保持很高的稳定性；对于生物试剂杂质，光学镜片灰尘散射的耐受性很高，基本不会对自动对焦光斑的形态和位移产生影响，提升生物碱基识别数据质量，保证设备稳定快速运行。

附图说明

图1是本发明实施例的对焦系统光路结构示意图；

图2是本发明实施例对焦系统和照明系统、成像系统组合的结构示意图；

图3是生物芯片反射光线的结构示意图；

图4是本发明实施例自动对焦光斑在相机端的成像示意图；

图中零部件名称及序号：1-红光LED灯2-聚光准直透镜3-复眼透镜4-第三二向色镜5-积分聚焦透镜6-激发滤光片7-消杂光光阑8-激光衰减片9-小孔光阑10-第一二向色镜11-第一管镜12-第二二向色镜13-物镜14-出射滤光片15-第二管镜16-工业相机17-绿光LED灯18-对焦光源19-电机20-生物芯片。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明中，如图1至图4中所示，一种实时多面自动对焦系统，包括对焦光源18、激光衰减片8、小孔光阑9、第一二向色镜10、第一管镜11、第二二向色镜12、通过电机19驱动相对对焦光源18移动的物镜13，所述对焦光源18发出的光线依次经过激光衰减片8和小孔光阑9后从第一二向色镜10透射出并依次经过第一管镜11和第二二向色镜12的透射进入物镜13；所述第一二向色镜10反射照明系统的光线并与对焦光源18过来的光线合束成共轴光路，所述第二二向色镜12透射合束的光线并反射通过物镜13的荧光至成像系统，所述电机19和成像系统分别与一能分析物镜13所处位置并操控电机19动作的控制主机电性连接。对焦光源18是半导体激光二极管、固体激光器中的任意一种，或者是其它在对焦光源端做聚焦微孔处理的LED灯等，对焦光源18通过激光衰减片8之后入射小孔光阑9，使得自动对焦光源18的轴上光束主光线角度发生变化，主光线角度的变化范围可以是0-45度，如从轴上主光线的0角度变成10度、15度、30度等，这样带有主光线角度偏移的自动对焦光线入射至第一二向色镜10之后透射和照明系统经过第一二向色镜10反射的光线进行合束形成照明系统和自动对焦系统的共轴光路，进入第一管镜11后形成无限远光束透过第二二向色镜12进入无限远显微物镜13后聚焦在物镜13的后焦面上，之后自动对焦光线会经过多次生物芯片的反射进入物镜13，生物芯片20的每一个面都是一个自动对焦的反射面，如图3所示，给出了四个反射面的反射光线的示意图，该自动对焦系统就可以对生物芯片20的多个面进行自动对焦，也就是说，无论生物芯片20在哪一个面上具备生物荧光基团，该自动对焦系统都可以进行准确的对焦。自动对焦的反射光线被物镜13收集后经第二二向色镜12反射进入成像系统的第二管镜15后聚焦在工业相机16的光电传感器Sensor上，生物芯片20有多少个反射面，在光电传感器Sensor上就会具备多少个光斑信号，之后经过控制主机处理后的位置信息会反馈给电机19驱动，将物镜13移动到最佳焦面。控制主机是依据自动对焦曲线对样品测试时物镜13和成像系统记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机19的反馈值指导电机19驱动物镜13移动到最佳焦面，利用该对焦光斑位置信息和自动对焦曲线就可以得出当前物镜13的Z轴坐标和物镜13处于最佳焦面位置时的偏差量，以此偏差量作为电机19的反馈值指导电机19驱动物镜13移动到最佳焦面位置，响应快速，这样的系统不需要反复多次的试错调节，装调方便快捷，能与荧光显微系统很好的兼容实现高度集成，体积小，利于实现设备的高通量小型化升级，对装调人员的专业性没有特殊的要求，能够对生物芯片20的多层实现自动对焦，对每一个面都可以进行准确对焦拍摄，提升测序设备的通量，避免生物试剂的浪费，降低试验成本，对被拍摄的目标物没有特殊要求，在拍摄生物芯片20的下层生物荧光基团的时候，可以保证自动对焦光斑良好的形态分布以及反射的能量值，对上下层自动对焦拍摄都能够保持很高的稳定性；对于生物试剂杂质，光学镜片灰尘散射的耐受性很高，基本不会对自动对焦光斑的形态和位移产生影响，提升生物碱基识别数据质量，保证设备稳定快速运行。

进一步的改进，如图2中所示，所述照明系统包括照明光源、在照明光源所发射光线光路上依次设置的聚光准直透镜2、复眼透镜3、第三二向色镜4、积分聚焦透镜5、激发滤光片6和消杂光光阑7，所述照明光源发射的光线通过消杂光光阑7后射向第一二向色镜10并被第一二向色镜10反射。照明光源可选择单色或双色光源，在选择双色光源时在每个光源和第三二向色镜4之间都设置有聚光准直透镜2和复眼透镜3，如选择照明光源为红光LED灯1和绿光LED灯17，红光LED灯1发出的光经过一个聚光准直透镜2和一个复眼透镜3后再经过第三二向色镜4透射，绿光LED灯17发出的光经过另一个聚光准直透镜2和另一个复眼透镜3后再经过第三二向色镜4反射，在相同原理下红光LED灯1和绿光LED灯17所处的光路位置可以进行互换，LED灯光源发射的光线经过聚光准直透镜2之后形成类准直光路，两个类准直光路分别入射到复眼透镜3后经过第三二向色镜4合成同一个光路，这样复眼透镜3对准直光线进行重新划分分布后再经过积分聚焦透镜5后形成光斑形状可调，大小可控的矩形光斑，对照明光斑做整形处理，提升光效的同时，降低背景噪音，通过积分聚焦透镜5后的光线就射向激发滤光片6，激发滤光片6则用于过滤红光LED灯1和绿光LED灯17光源的波长，只允许特定波长的光透过，利于激发特定的荧光染料；经过激发滤光片6的光线进入消杂光光阑7，消杂光光阑7用于抑制多余的杂散光，合束之后的红光和绿光经过消杂光光阑7之后通过第一二向色镜10反射进入第一管镜11后形成无限远光束透过第二二向色镜12进入无限远显微物镜后聚焦在物镜13的后焦面上激发荧光染料基团释放荧光信号。

进一步的改进，如图2中所示，所述成像系统包括在第二二向色镜12反射光路上依次设置的出射滤光片14、第二管镜15和工业相机16。出射滤光片14只允许特定的被激发的荧光波段的光通过，激发光以及其他的杂散光均被滤除在外，过滤之后的具备特定波段的荧光信号进入第二管镜15，亦即成像系统管镜，经过第二管镜15后聚焦在工业相机16的光电传感器Sensor上，生物芯片20有多少个反射面，在光电传感器Sensor上就会具备多少个光斑信号，它们经过自动对焦处理后的位置信息会反馈给电机19驱动物镜13的移动，使得对焦精度大幅改善，将物镜13移动到最佳焦面，由工业相机16拍摄物镜13下端的荧光基团形成图片后保存用于后期处理；在照明系统中采用双色光源时，工业相机16就在自动对焦完成后分别对各个照明光源进行拍照，在每一次照明光源打开之前都会先将自动对焦的对焦光源18打开并判断当前的物镜13位置是否在最佳焦面，如果在最佳焦面则打开照明光源，对两种激发光进行工业相机16拍照，如果判断当前物镜13位置不在最佳焦面，则通过控制主机对电机19操控，将物镜13移动至最佳焦面后进行拍照。在这样的系统中所使用的是工业相机16，没有采用传统的PSD位移传感器，传统的采用PSD位移传感器的自动对焦系统一般需要外置，生物成像和自动对焦系统是一种分离的结构，极大地占用了整台设备的空间，使得仪器显得笨重，采用生物芯片20成像和自动对焦系统共用一个工业相机16的集成化方案，极大的缩小了光机显微系统的体积，也解决了传统对焦系统中采用PSD位移传感器时，不能够直观的观察到自动对焦光斑的状态的问题，例如是否是旋转对称的圆形光斑，无法做出判断，最终会导致显微物镜无法到达准确的焦面，该系统在自动对焦过程中可以直观的看到自动对焦光斑的形态变化，能够确保自动对焦光斑的最佳状态即旋转对称的类高斯分布。

一种实时多面自动对焦方法，采用如前任意一项所述对焦系统，步骤如下：

S1，将生物芯片20在荧光显微系统物镜13的后焦面上手动对焦；首先将生物芯片20放置在荧光显微系统物镜13的后焦面上，先手动对焦，以拍摄第二个反射面即生物芯片盖玻片的下表面，同时也是流体的上表面为例进行说明，目的是使得工业相机16能够对生物芯片20的第二个面进行清晰拍摄；

S2，手动对焦完成后通过自动对焦系统依据对焦光源18照射生物芯片20后在相机端对焦光斑的形态确定物镜13在最佳焦面时物镜13的Z轴位置坐标；手动对焦完成后，此时自动对焦光源出射的光线会按照上面阐述的光路进行传播进入显微物镜13，最后入射到生物芯片20，自动对焦光源18的形式可以是激光二极管LD，固体激光器，波长可以是可见光也可以是近红外或者红外线，或者是其它在对焦光源端做聚焦微孔处理的LED灯等形式，，以生物芯片20的第二个反射面为例，此时自动对焦光线在盖玻片的下表面即和流体接触的那个表面发生反射进入显微物镜，最后在相机端成像，此时可以在相机端实时的观测到自动对焦光斑的形态，自动对焦光斑的形态随着我们的装调方向的变化而变化，与此同时，记录当前最佳焦面所对应的物镜13在Z轴位置坐标即Z_best；对焦光斑包括生物芯片20各个反射面反射对焦光线在相机端所形成的光斑，如图所示，是调试完毕的自动对焦光斑在相机端的成像示意图，从左至右分别是第一反射面光斑、第二反射面光斑、第三反射面光斑、第四反射面光斑，或者说是盖玻片的上表面反射光斑、流体的上表面反射光斑、流体的下表面反射光斑、载玻片的下表面光斑，箭头指示光斑的移动方向，其和相机装配或者图像输出有关；

S3，将物镜13沿最佳焦面时的Z轴位置坐标上下移动，触发相机16拍照形成原始模型库；将物镜13以最佳焦面位置Z_best上下移动，例如上下移动范围是200um，步长为2um，则物镜13上下移动的范围是Z_best±0.1mm，电机19带动物镜13从上往下移动，步长假如是2um的话，则意味着物镜13需要移动100次，电机19带动物镜13每移动一次都会触发相机端进行拍照，也就是一共拍摄100张自动对焦的照片，将照片进行保存即完成了自动对焦原始模型库的建立；

S4，将原始模型库中的图片依据物镜的Z轴位置变化量和相机端对焦光斑移动量的函数关系建立自动对焦曲线；对原始模型库中保存的图片进行批量处理，每张图片都对应了一个Z轴坐标位置，建立物镜13移动的Z轴位置变化量和相机端自动对焦光斑移动量之间的函数关系，100张的自动对焦图片，意味着有100个离散的二维空间坐标点，将这些离散的点进行拟合得到一条符合当前荧光显微系统的自动对焦曲线，将电机19移动Z轴坐标记为自动对焦曲线的纵坐标，以自动对焦光斑在相机端的位移量记为自动对焦曲线的横坐标，建立的自动对焦曲线就可以充分反映显微物镜离焦状态下自动对焦光斑位置信息；

S5，依据自动对焦曲线对样品测试时物镜和相机记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机19的反馈值指导电机19驱动物镜13移动到最佳焦面。在正常拍照之前，先打开自动对焦的对焦光源18，工业相机16记录自动对焦光斑位置信息，由于生物芯片20的一致性有差异，自身的不平整，或者荧光显微系统的装配误差等因素都有可能会导致物镜3处于离焦状态，将此离焦状态下的自动对焦光斑位置信息和显微物镜处于Z_best状态下的自动对焦光斑的位置信息进行差异化分析，根据建立的自动对焦曲线就可以得出当前显微物镜13的Z轴坐标Z_current和Z_best的偏差量，以此偏移量作为电机19的反馈值指导电机19移动到最佳焦面Z_best，整个自动对焦光斑位置以及反馈值的计算和电机19的驱动均由控制主机直接执行，如采用下位机直接执行，响应快速。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明进行详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种实时多面自动对焦系统，其特征在于:包括对焦光源、激光衰减片、小孔光阑、第一二向色镜、第一管镜、第二二向色镜、通过电机驱动相对对焦光源移动的物镜，所述对焦光源发出的光线依次经过激光衰减片和小孔光阑后从第一二向色镜透射出并依次经过第一管镜和第二二向色镜的透射进入物镜；所述第一二向色镜反射照明系统的光线并与对焦光源过来的光线合束成共轴光路，所述第二二向色镜透射合束的光线并反射通过物镜的荧光至成像系统，所述电机和成像系统分别与一能分析物镜所处位置并操控电机动作的控制主机电性连接。

2.根据权利要求1所述实时多面自动对焦系统，其特征在于:所述小孔光阑调节主光线角度的范围是0-45度。

3.根据权利要求1所述实时多面自动对焦系统，其特征在于:所述照明系统包括照明光源、在照明光源所发射光线光路上依次设置的聚光准直透镜、复眼透镜、第三二向色镜、积分聚焦透镜、激发滤光片和消杂光光阑，所述照明光源发射的光线通过消杂光光阑后射向第一二向色镜并被第一二向色镜反射。

4.根据权利要求1所述实时多面自动对焦系统，其特征在于:所述成像系统包括在第二二向色镜反射光路上依次设置的出射滤光片、第二管镜和工业相机。

5.根据权利要求1所述实时多面自动对焦系统,其特征在于:所述对焦光源是半导体激光二极管、固体激光器中的任意一种。

6.根据权利要求1所述实时多面自动对焦系统，其特征在于:所述控制主机依据自动对焦曲线对样品测试时物镜和成像系统记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机的反馈值指导电机驱动物镜移动到最佳焦面。

7.一种实时多面自动对焦方法，其特征在于:采用如权利要求1至6任意一项所述对焦系统，步骤如下：

S1，将生物芯片在荧光显微系统物镜的后焦面上手动对焦；

S2，手动对焦完成后通过自动对焦系统依据对焦光源照射生物芯片后在相机端对焦光斑的形态确定物镜在最佳焦面时物镜的Z轴位置坐标；

S3，将物镜沿最佳焦面时的Z轴位置坐标上下移动，触发相机拍照形成原始模型库；

S4，将原始模型库中的图片依据物镜的Z轴位置变化量和相机端对焦光斑移动量的函数关系建立自动对焦曲线；

S5，依据自动对焦曲线对样品测试时物镜和相机记录的对焦光斑的位置信息进行差异化分析得出偏差量，并以偏差量作为电机的反馈值指导电机驱动物镜移动到最佳焦面。

8.根据权利要求7所述实时多面自动对焦方法，其特征在于:所述步骤S4是通过与电机和相机电性连接的控制主机进行差异化分析并给出电机驱动指令的。

9.根据权利要求7所述实时多面自动对焦方法，其特征在于:所述自动对焦曲线的纵坐标是物镜的Z轴位置，横坐标是相机端对焦光斑移动量。

10.根据权利要求7所述实时多面自动对焦方法，其特征在于:所述对焦光斑包括生物芯片各个反射面反射对焦光线在相机端所形成的光斑。

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