CN1159282C

CN1159282C - 一种制造手性二氯菊酸的方法

Info

Publication number: CN1159282C
Application number: CNB001100297A
Authority: CN
Inventors: 邵昌平; 刘韧; 潘桂芝; 韩梅; 郑卓
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: CN1303844A

Abstract

一种制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯为原料；以酯酶为催化剂，催化(±)-二氯菊酸酯不对称水解反应，反应在缓冲溶液中或水中常温搅拌或振荡下进行，其特征在于：水解反应中加入特定的添加物改变酶反应的微环境，特定添加物为寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种，其在反应体系中的重量浓度在0.001%-2%范围内。本发明方法所用的特定的改变酶反应微环境的添加物，可以明显地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度，同时可以提高对映体及非对映体的空间选择性。

Description

一种制造手性二氯菊酸的方法

本发明涉及手性二氯菊酸的制备方法，特别提供了一种以生物催化剂动力学拆分法制造。

二氯菊酸(又称DV菊酸，英文名称Permethrinic acid)是合成拟除虫菊酯农药的酸部分组成的重要中间化合物。二氯菊酸，即2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)环丙烷羧酸，如(I)所示

因它的环丙烷环上存在两个手性碳原子，因此有R(+)和S(-)两种构型，还有顺式和反式两种异构，共有四种异构体。作为拟除虫菊酯农药的酸部组成，不同异构体的二氯菊酸，其杀虫效力表现出显著的差异。其中手性R(+)二氯菊酸是有效体，而手性S(-)二氯菊酸是无效体；对顺式和反式结构，一般而言，R(+)-顺-二氯菊酸效力最高，而则次之，然而对于某些特殊拟除虫菊酯R(+)-反-二氯菊酸是不可或缺的。由手性催化剂催化环丙烷化虽然可以得到R(+)二氯菊酸，但尚难达到很高的光学活性。因此研究开发方便经济的生物催化剂拆分法制造R(+)二氯菊酸也成为一个重要途径。

目前已报道的生物催化剂拆分法制备R(+)-反-二氯菊酸的方法有：1.猪肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，23：64(1984))。2.球形节杆菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(光田贤等，(日)特开昭60-244296(1985)，63-251099(1988))。猪肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-二氯菊酸的光学活性(纯度)达90％，但是，猪肝酯酶价格偏高，供生产使用有一定的限制，需通过酶固定化来解决。球形节秆菌酯酶拆分法，水解率18.0％时，二氯菊酸的R(+)-反/R(+)-顺＝88.9/11.1，但是，此菌种难以得到，而且未经诱变或基因工程改造的菌株，活力比较低。

本发明的目的在于提供一种制造手性二氯菊酸的方法，其所生产出的手性二氯菊酸中R(+)-反-二氯菊酸具有较高的收率，并且方法简单，适于工业化应用。

本发明提供了一种制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯为原料；以酯酶为催化剂，催化(±)-二氯菊酸酯不对称水解反应，反应在溶液中或水中常温搅拌或振荡下进行，其特征在于：水解反应中加入特定的添加物改变酶反应的微环境，特定添加物为寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种，其在反应体系中的重量浓度在0.001～2％，最好在0.1～1％.围内。

所述多糖可以为蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、琼脂糖、糊精，非离子表面活性剂可以为蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。

本发明所用的原料为消旋的二氯菊酸酯，如(II)所示

R为C₁-C₄烷基及孟基，其顺式与反式比例在10～90/90～10范围内，二氯菊酸酯在反应溶液中重量浓度为0.1～40％，最好为1～10％。。

本发明所用的脂酶(EC.3.1.1.1)是由新鲜的哺乳动物(如猪、马、狗、兔等)的肝脏提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的产品，美国Sigma化学公司的产品和本实验室的提取物，或由细菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(国际单位)/mg范围内。酯酶可以固态或液态形态使用，可以吸附或共价键合方法固定于无机或有机载体上使用，固定化酶便于酶回收反复使用，酯酶的用量为底物二氯菊酸酯的0.1～10％，最好0.5～5％。。

水解反应的介质为磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐的无机盐缓冲溶液、蒸馏水或脱离子水；控制反应溶液pH在3～11范围内，最好为6～8；水解反应温度在20～70℃范围内，最好为30～50℃；水解反应时间，根据酶量添加物和反应温度等的不同，在6～96小时之间，最好8～72小时。

一般地为改进酶的功能，如提高酶反应速度和对映体选择性，有二种途径：改变酶反应的微环境或定位改变酶的某些氨基酸残基(蛋白质工程方法)。本发明通过加入特定的添加物寡糖及多糖化合物，可能经过化学诱导作用，提高了酯酶的对映体和非对映体的选择性，从而改变了酶反应的微环境，明显地提高了酶反应速度和对目的手性二氯菊酸的选择性，在生产上可以方便地实施。总之，本发明方法所用的特定的改变酶反应微环境的添加物，可以明显地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度，同时可以提高对映体及非对映体的空间选择性。对水解反应速度可加快一倍以上，对R(+)-反-二氯菊酸在四种异构体中的含量可提高20％以上。而且，这种通过添加物改变酶反应微环境以提高酶的功能的方法，比之通过化学键合改变酶的某些氨基酸残基以提高酶的功能的方法要简便得多，更适合工业上应用。下面通过实施例详述本发明。

实施例1：

取10ml0.1MNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(顺式/反式＝40/60)1.20g(5.04mM)，非离子型表面活性剂tween80，50mg，猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振荡(～200转/分)反应24小时，加36％盐酸，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml，2次)。萃取液用HPCL法(C₁₈柱，6.4×200mm，甲醇/水＝1∶1，PH3，1ml/min，254nm)，测定反应生成的二氯菊酸和未水解的二氯菊酸乙酯的含量，由之计算水解率为35.37％。之后，向萃取液中加入等体积1N NaOH，摇动分相，使水解生成的二氯菊酸形成钠盐进入水相。水相再用36％盐酸酸化，调到pH2以下，二氯菊酸逐渐析出。将结晶产品过滤，结晶用蒸馏水淋洗三次，干燥(-100℃)，得二氯菊酸0.300g，对水解率35.37％应得二氯菊酸(0.373g)计，收率80.43％。结晶二氯菊酸的四个异构体含量用GC法测定(10％QF-1柱，5m，氢焰鉴测器)。取二氯菊酸样品50mg，加等克分子的氯化亚砜、吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于100℃回流1小时衍生化后，进行测定，得到R(+)-反-二氯菊酸71.79％，S(-)-反-二氯菊酸26.69％，R(+)-顺-二氯菊酸1.12％，S(-)-顺-二氯菊酸0.40％。

实施例2：

取猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，20u/mg)100mg，右旋糖苷100mg，加入到10ml 0.1MNaH₂PO₄～Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，摇匀，放入4℃冰箱中过夜后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(顺式/反式＝40/60)1.20g(5.04mM)，升温至40℃，振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述方法，测定水解率30.34％，得二氯菊酸结晶0.200g，对水解率30.34％应得之二氯菊酸(0.320g)计，收率68.75％；测定二氯菊酸结晶的四种异构体的含量为：R(+)-反-二氯菊80.39％，S(-)-反-二氯菊酸19.61％，R(+)-顺-二氯菊酸0％，S(-)-顺-二氯菊酸0％。

实施例3：

取猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，20u/mg)10mg，乳糖50mg，Tween 80 50mg，加入到10ml 0.1MNa₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，摇匀后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(顺式/反式＝40/60)1.20g(5.04mM)，于40℃，振荡(～200转/分)反应24小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为21.70％，得二氯菊酸结晶0.216g，对此水解率下应得二氯菊酸(0.229g)计，收率为94.32％；测定二氯菊酸结晶的四个异构体的含量为：R(+)-反-二氯菊酸89.33％，S(-)-反-二氯菊酸10.67％，R(+)-顺-二氯菊酸～0％，S(-)-顺-二氯菊酸0％。

比较例1：

取10ml，0.1MNaH₂PO₄～Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(顺式/反式＝40/60)1.20g(5.04mM)，摇匀，再加入猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为31.55％，得二氯菊酸结晶0.220g，对此水解率下应得之二氯菊酸(0.241g)计，收率为91.29％；测定二氯菊酸结晶的四个异构体的含量为：R(+)-反-二氯菊酸67.43％，S(-)-反-二氯菊酸28.94％，R(+)-顺-二氯菊酸2.25％，S(-)-顺-二氯菊酸1.11％。

Claims

1、一种制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(+)-二氯菊酸酯为原料；以酯酶为催化剂，催化(±)-二氯菊酸酯不对称水解反应，反应在缓冲溶液中或水中常温搅拌或振荡下进行，其特征在于：水解反应中加入特定的添加物改变酶反应的微环境，特定添加物为寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种，其在反应体系中的重量浓度在0.001％-2％范围内。

2、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：所述多糖为蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、琼脂糖或糊精。

3、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：所述非离子表面活性剂为蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯。

4、按权利要求1、2或3所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：添加物在反应体系中的重量浓度为0.1～1％。

5、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：所述消旋的(±)-二氯菊酸酯中顺式与反式异构体比例在10～90/90～10范围之间，在反应溶液中重量浓度在1～40％范围中。

6、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：二氯菊酸酯在反应溶液中重量浓度为1～10％。

7、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：所述酯酶由新鲜猪肝、其他哺乳动物肝脏、细菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量为底物二氯菊酸酯的0.1～10％。

8、按权利要求7所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：酯酶的用量为底物二氯菊酸酯的0.5～5％。

9、按权利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：水解反应的介质为磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐的无机盐缓冲溶液、蒸馏水或脱离子水；控制反应溶液pH在3～11范围内；水解反应温度在20～70℃范围内；水解反应时间在6～96小时之间。

10、按权利要求9所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于：控制反应溶液pH在6～8；水解反应温度在30～50℃；水解反应时间8～72小时。