CN115927689A

CN115927689A - 一种fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法

Info

Publication number: CN115927689A
Application number: CN202310000892.4A
Authority: CN
Inventors: 张卫卫; 李亚; 阮逸珑
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2023-01-03
Filing date: 2023-01-03
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种fusA基因及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，特点是具有在细菌代谢状态指示剂方面的用途，fusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，指示灿烂弧菌进入持留状态的方法包括以下步骤：设计fusA基因的上下游扩增引物，结合实时荧光定量反转录PCR方法，若灿烂弧菌fusA基因表达量降低至活跃菌的40%及以下，即可认定灿烂弧菌进入低代谢的持留状态，其中fusA基因上游引物fusAF序列为：5'‑CATTCAAGAACAAGGGTG‑3'；fusA基因下游引物fusAR序列为：5'‑CGAACGAAAGTTAGAGCA‑3'，优点是简单快速、准确判断细菌是否进入低代谢状态。

Description

一种 fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，尤其是涉及一种 fusA基因的用途及指示灿烂弧菌进入持留状态的方法。

背景技术

持留菌是菌群中生长缓慢或暂时处于休眠状态的一小部分比例的亚群，这一小部分的菌体在宿主体内的存在是顽固性、传染性疾病复发的根源。在自然环境及生物体环境中，多种病原菌，包括结核分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等，均可有一小部分菌体转化为持留菌。持留菌极其容易复苏，在体内抗菌药物浓度降低或机体免疫力下降时极其容易复苏为代谢活跃并具有致病力的菌株，成为多种传染性疾病复发的基础]。许多慢性反复性细菌病的治疗失败和顽固复发，例如结核分枝杆菌引起的结核病、大肠埃希氏菌引起的慢性尿路感染、伤寒沙门氏菌引起的伤寒、幽门螺杆菌引起的消化性溃疡和葡萄球菌引起的心内膜炎、骨髓炎等等均是由于病原菌进入持留状态所引起的。因此，检测细菌的代谢状态，尤其是是否处于低代谢的持留菌状态对于病害的发生和复发感染具有重要的意义。

细菌在应对不利的环境因素时，通过降低代谢进入低代谢的持留菌形式得以存活，因此任何参与细菌物质合成和能量代谢的过程都可能与持留菌形成相关，因此该过程涉及机制和系统冗繁。抑制DNA、蛋白质、细胞壁或ATP能量等合成过程的相关基因，均参与菌体持留菌的形成过程。常见的持留菌的筛选方法为采用高浓度的抗生素，一般为10倍最小抑菌浓度（10×MIC）的抗生素杀死活跃菌，耐受高浓度的抗生素的即认为是持留菌，进而在再进行多抗生素耐受性检测和显微镜下单细胞复苏观察等验证。近年来，也偶有分子标记方法进行细菌进入持留状态的检测。结核分枝杆菌从生长繁殖期进入休眠持留期，原有的三羧酸循环会转向依赖乙醛酸循环支路的途径，在获取能量和碳源的同时降低代谢率，维持其在宿主细胞内长期生存的需要。因此，乙醛酸代谢途径的一个关键酶异柠檬酸裂合酶（Isocitrate cleavage synthase，ICL）是结核分枝杆菌胞内厌氧代谢的关键酶，其表达可用于指示结核分枝杆菌从活跃菌进行入了持留菌。

在细菌蛋白质翻译过程中，肽链延伸的移位过程需要延伸因子G（EF-G），EF-G与核糖体相互作用，以稳定其中间状态。EF-G的GTP酶活性在核糖体结合后被激活，利用GTP水解推动移位过程中的构象变化，促进蛋白质的合成。因此该过程是决定蛋白质合成肽键的关键过程，在灿烂弧菌中编码合成EF-G蛋白的基因为 fusA基因。

灿烂弧菌是海水养殖环境中常见的重要条件致病菌，可感染海参、扇贝、牡蛎、蛤和美国鱼类等多个海水养殖经济生物品种。灿烂弧菌可以通过进入持留菌状态，以避免抗生素和宿主免疫因子的杀灭，但是目前未见有关灿烂弧菌进入持留状态的指示基因的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速、准确判断细菌是否进入低代谢状态的 fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌代谢水平高低的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种 fusA基因在细菌代谢状态指示剂方面的用途，所述的 fusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述 fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，包括以下步骤：设计 fusA基因的上下游扩增引物，结合实时荧光定量PCR方法，若灿烂弧菌 fusA基因表达量降低至活跃菌的40%及以下，即可认定灿烂弧菌进入低代谢的持留状态，其中 fusA基因PCR扩增的上游引物fusAF序列为：5'-CATTCAAGAACAAGGGTG-3'； fusA基因PCR扩增的下游引物fusAR序列为：5'-CGAACGAAAGTTAGAGCA-3'。

进一步，具体步骤如下：

（1）收集OD₆₀₀=0.6-2.0的灿烂细菌菌液，均分成两份，一份作为活跃菌；另一份加入250 μg/mL的抗生素作用4小时，12,000 g 离心5分钟收集菌体，此部分菌体即为通过降低代谢水平耐受抗生素的持留菌，使用细菌RNA提取试剂盒，提取持留菌和活跃菌中的总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA中的mRNA反转录为cDNA；

（2）利用实时荧光定量PCR试剂盒中的试剂配制以下的反应混合液：SYBR 反应液，10 μL；10 μM fusAF引物，1 μL；10 μM fusAR引物，1 μL；cDNA模板，0.5 μL；内参染料ROX，0.5 μL；ddH₂O，7 μL；内参基因为16S rDNA，按照 fusA基因扩增的方法制备内参基因的扩增反应混合液；

（3）将配制的反应混合物置于实时荧光定量PCR仪进行扩增反应：①95 ℃，5分钟；② 95 ℃，30秒；③ 52 ℃，30秒，72 ℃，20秒，回到第二步进行40个循环；72 ℃，10分钟，获得样本的 fusA基因和内参基因的C_T值；

（4）计算基因的表达备注：采用2^-△△Ct的方法计算基因的相对表达水平：2^-△△CT=2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}，其中S为样本持留菌菌体，C为活跃菌菌体，将活跃菌中 fusA基因的表达量看作1，样品菌体中的 fusA基因相对表达量低于活跃菌表达量的40%即为阳性值，说明细菌的代谢状态进入了低代谢的持留状态。

优选的，步骤（1）中收集培养至稳定期OD₆₀₀=2.0的灿烂细菌菌液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种 fusA基因的用途及其指示细菌进入持留状态的方法，还公开了可用于检测灿烂弧菌菌体代谢状态的一对特异核酸标示序列为fusAF: 5'-CATTCAAGAACAAGGGTG-3'和fusAR: 5'-CGAACGAAAGTTAGAGCA-3'，该对特异的核酸标识序列应用于实时荧光定量反转录PCR反应，代谢状态相对一致的菌体中 fusA基因的mRNA的表达量相对活跃菌体中的表达量下降至40%以下，则为菌体状态进入了低代谢的持留状态。利用该方法可在3~5小时内判断灿烂弧菌的代谢状态，具有检测过程快速、检测结果易于分析且可定量等优点，为研究灿烂弧菌的代谢与生理功能提供了较为简单的判断方法。

综上所述，通过检测不同代谢状态菌体内的表达差异蛋白，筛选到 fusA基因作为标志分子，该基因编码的蛋白为翻译过程中延伸因子G。针对 fusA基因设计一对引物，检测该基因在特定条件下的mRNA水平，通过 fusA基因的表达水平可用于快速、灵敏判断细菌体内代谢水平是否发生了变化，是否进入了持留菌状态。

附图说明

图1为250 μg/mL（10×MIC）的四环素筛选前后灿烂弧菌菌落数检测。（A）为四环素加入前灿烂弧菌10倍梯度稀释，10 μL的稀释液滴盘的结果；（B）为250 μg/mL的四环素处理后，菌悬液10倍梯度稀释，10 μL的稀释液滴盘的结果；

图2为活跃菌和持留菌中ATP含量的测定。以活跃菌中ATP的含量为1，*表示 P<0.05；

图3为活跃菌和持留菌的转录组测序获得的差异表达基因下降的蛋白的GO富集分析；

图4为以灿烂弧菌基因组为模板，以fusAF和fusAR为正反引物，PCR扩增产物的电泳结果。泳道1，为DL2000的DNA分子量标准，自上而下分别为2000 bp、1000 bp、750 bp、500bp、250 bp和100 bp的分子量条带；泳道2、3和4，为fusAF和fusAR作为引物扩增结果；

图5为实时荧光定量反转录PCR检测 fusA基因的相对表达量。收集不同生长阶段未经过处理的灿烂弧菌，OD₆₀₀分别为0.6，1.2和2.0的菌体，作为对照（活跃菌Vs）。分别使用250 μg/mL的四环素处理不同菌体浓度的菌体，获得对高浓度抗生素具有耐受性的菌体，作为持留菌样品（VsP）。提取两种菌体的RNA，反转录，并进行实时荧光定量PCR。纵坐标为 fusA基因的相对表达量，以 fusA基因在各OD₆₀₀时的活跃菌的表达为“1”，横坐标分别为 OD₆₀₀分别为0.6，1.2和2.0。*表示P<0.05。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施一

持留菌的获取

取过夜培养的灿烂弧菌5 mL，12,000g离心5 分钟去上清，使用质量浓度0.8%NaCl溶液清洗两次并制备菌悬液，此时菌液分为两份，每份2 mL。一份保持此状态不变，一份加入终浓度为250 μg/mL的四环素作用4小时，12,000× g离心5分钟，使用质量浓度0.8%NaCl溶液清洗两次，并重悬至2 mL 质量浓度0.8% NaCl溶液中，此样品为对高浓度的抗生素具有耐受性的菌体。将高浓度抗生素处理前后的菌体分别进行10倍的梯度稀释，每个浓度梯度吸取10 μL滴至2216E固体培养基中，结果如图1所示。在未加入抗生素处理的菌体中，稀释10¹¹倍时仍然有约50个菌，而在加入抗生素的菌悬液中，仅在稀释10⁷倍时约有10个菌，因此对高浓度抗生素有抗性的菌体占总菌数的0.002%。此部分在高浓度抗生素作用下依然能存活的菌体定义为低代谢的持留菌。为了验证持留菌的代谢是否低于活跃菌，我们利用ATP测定试剂盒（南京建成，A095-1-1）对收集的菌体内的ATP含量进行了测定，结果如图2所示，在持留菌中ATP的含量明显降低为对照菌的50%左右。

具体实施例二

持留菌和活跃菌转录组测定及标志分子的筛选

取过夜培养的灿烂弧菌100 mL，12,000g离心5 min去上清，使用质量浓度0.8%NaCl溶液清洗两次并制备菌悬液，此时菌液分为两份，每份40 mL。一份保持状态不变，此活跃菌样品命名为Vs2_0，一份加入终浓度为250 μg/mL的四环素作用4小时，12,000× g离心5分钟，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次，并重悬至2 mL的质量浓度为质量浓度0.8%NaCl溶液中，此低代谢的持留菌样品命名为VsP2_0。将Vs2_0和VsP2_0两份样本送至诺禾致源生物技术有限公司，进行转录组测序分析，获得两类不同代谢状态菌体中的差异表达基因。将差异表达基因进行GO富集，结果如图3所示。酰胺生物合成、翻译过程是下调蛋白富集最多的生物学过程，核糖体、核糖核蛋白是下调蛋白富集最多的细胞组分，核糖体结构蛋白活性和结构分子活性是下调蛋白富集最多的分子功能。因此，在持留菌中，翻译相关过程、活性的下调是下调蛋白富集到的最为标志性的过程。通过对不同代谢状态菌体内与翻译过程相关的表达差异蛋白的筛选，获得了延伸因子G为富集到翻译过程的表达下降的标志性蛋白。

具体实施例三

根据转录组给出的差异表达 fusA基因信息（gene_id：DUN60_RS11105），参考基因组序列为 Vibrio splendidus strain Vibriosp. chromosome 1, complete sequence(NCBI Reference Sequence: NZ_CP031055.1，在灿烂弧菌基因组中筛选出了 fusA基因。灿烂弧菌中 fusA基因序列如SEQ ID NO：1所示：ATGGCAGATTTATCGAAATACAGAAACATTGGTATTTTCGCGCACGTTGATGCGGGTAAAACAACTACCACTGAGCGTATCCTTAAGCTAACTGGTCAGATCCACAAGACTGGTGAAGTACATGATGGCGAATCAACTACTGACTTCATGGAACAGGAAGCTGAGCGCGGAATTACTATCCAATCAGCAGCTGTAAGCTGTTTCTGGAACGGTCACCGTCTAAACGTTATCGATACTCCTGGACACGTTGACTTCACAGTTGAAGTATACCGTTCTCTTAAAGTACTTGATGGCGGTATCGGTGTATTCTGTGGTTCTGGTGGTGTTGAACCACAATCAGAAACTAACTGGCGCTACGCTAACGAATCAGAAGTATCTCGTCTGATCTTCGTTAACAAACTAGACCGTATGGGTGCAGATTTCTACAACGTTGTTGACCAAGTTAAAAACGTTCTAGGTGCAACTCCTCTAGTTATGGTTCTACCAATCGGCCGCGAAGATGAATTCGTGGGTGTTGTAGACCTTCTAAGCCGTAAAGCATACGTTTGGGATGACACTGGTCTTCCTGAAAACTACGAAATCCTAGATGTTCCTGCGGACATGGTAGATGACGTAGAGCAATACCGTGAAGAGCTAATCGAAACTGCTGTAGAGCAAGACGATGACCTAATGGAAGCTTACATGGAAGGTGAAGAGCCTTCTATCGAAGACATCAAGCGTTGTATCCGTAAAGGTACTCGTGACCTAGCGTTCTTCCCAACTTACTGTGGTTCTG CATTCAAGAACAAGGGTG TTCAAATCATCCTTGACGCTGTTGTAGATTACCTACCTTCTCCAACTGAAGTTGATCCTCAACCTCTAATGGATGAGAACGGTGAAGAAACTGGTAAGCACGCTATCGTTTCTACTGAAGAAACGTTTAAAGCTCTTGCATTCAAAATCATGGATGACCGTTTCGG TGCTCTAACTTTCGTTCG TATTTACTCTGGTAAATTGAACAAAGGCGACACGATTCTTAACTCATTCACAGGTAAAACTGAGCGTGTTGGCCGTATGGTTGAGATGCAAGCTGATGACCGTAACGAACTAACTAGCGCACAAGCTGGTGACATCATTGCGATCGTTGGTATGAAGAACGTGCAAACAGGTCACACTCTATGTGATCCTAAAGATCAAGTAACGCTTGAGCCAATGGTTTTCCCAACTCCAGTAATCTCTATCGCTGTATCTCCAAAAGATAAAGGCGGTTCTGAGAAAATGGGTATCGCTATCGGTAAAATGGTTGCAGAAGATCCATCTTTCCAAGTTGAAACTGACGAAGAAACTGGCGAAACTATCCTGAAAGGTATGGGTGAACTTCACCTAGACATCAAGGTAGATATCCTTAAGCGTACTTACGGCGTTGACCTAACAGTTGGTGCTCCTCAAGTTGCTTACCGTGAAACTATCACTCAAGCAATTGAAGATAGCTACACGCATAAGAAACAGTCTGGTGGTTCTGGTCAATTCGGTAAGATCGATTACCGTATCAAGCCTGGCGAACCTGGTTCTGGCTTTACGTTCTCTTCAAAAGTTGTTGGCGGTAACGTACCTAAAGAATTCTGGCCTGCTGTTGAGAAAGGCTTTGCTGGCATGATGGAAAACGGCGTACTAGCTGGCTTCCCTACGCTAGACGTTGAAGTTGAACTTTACGATGGTGGTTTCCACGCAGTCGATTCATCTGCAATCGCATTTGAAATCGCAGCGAAAGGTGCATTCCGTCAATCTATGCCTAAAGCTGGCGCGCAACTTCTTGAGCCAATCATGAACGTTGACGTATTTACTCCAGAAGATCACGTTGGTGATGTTATCGGTGACCTTAACCGTCGTCGTGGCATGATCAAAGATCAACAAGCTGGCGTAACTGGCGTTCGTATTAAAGCTGACGTACCACTTTCAGAAATGTTTGGTTACATCGGTCACCTACGTACAATTACTTCAGGCCGTGGCCAATTCTCTATGGAATTCGCACAGTACTCTCCATGTCCAATGAACGTGGCAGAAGAAGTAATCGCTAAAGTTAAAGCAGAAAAAGAAGCTGGTAAGTAA。其中ATG为其开放阅读框的起始密码子，TAA为其终止密码子，带下划线且黑体加粗斜体部分区域分别为前引物和后引物。该基因编码695个氨基酸残基的蛋白，分子量约为76 kDa。

2、根据基因序列，设计引物进行 fusA基因的特异扩增

将基因序列通过Primer 3.0进行引物设计，获得如下的引物序列fusAF: 5'-CATTCAAGAACAAGGGTG-3'和fusAR: 5'-CGAACGAAAGTTAGAGCA-3'，引物的Tm值为52度，扩增的目的片段为202 bp。

首先制备PCR混合液，体系如下：PCR缓冲液，2.5 μL；dNTP，2 μL；10 μM fusAF，0.5μL；10 μM fusAF，0.5 μL；模板，0.5 μL；Taq酶，0.5 μL；ddH₂O:18.5 μL。PCR程序为：95℃，5分钟；95 ℃，30秒；52 ℃，30分钟；72 ℃，20秒，回到第步，进行30 个循环；72 ℃，10分钟。PCR的结果如图4所示，扩增获得预期的202 bp左右的特异的DNA条带，表明引物可用于实时荧光定量PCR实验。

3、实时荧光定量PCR测定 fusA基因的mRNA表达水平

在菌体生长至不同的菌体密度，OD₆₀₀=0.6，1.2 和2.0时分别进行持留菌和活跃菌中 fusA基因的表达测定。

当菌体生长至OD₆₀₀=0.6时，取出20 mL，12,000g离心5 min去上清，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次并制备菌悬液，此时菌液分为两份，每份10 mL。一份保持此状态不变，此样品命名为活跃菌Vs0.6样品，一份加入终浓度为250 μg/mL的四环素作用4小时，12,000× g离心5分钟，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次，并重悬至2 mL的质量浓度0.8%NaCl溶液中，此样品命名为低代谢的持留菌VsP0.6样品；

当菌体生长至OD₆₀₀=1.2时，取出20 mL，12,000g离心5 min去上清，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次并制备菌悬液，此时菌液分为两份，每份10 mL。一份保持此状态不变，此样品命名为活跃菌Vs1.2样品，一份加入终浓度为250 μg/mL的四环素作用4小时，12,000× g离心5分钟，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次，并重悬至2 mL的质量浓度0.8%NaCl溶液中，此样品命名为低代谢的持留菌VsP1.2样品；

当菌体生长至OD₆₀₀=2.0时（此时为菌体生长稳定期），取出20 mL，12,000g离心5min去上清，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次并制备菌悬液，此时菌液分为两份，每份10 mL。一份保持此状态不变，此样品命名为活跃菌Vs2.0样品，一份加入终浓度为250 μg/mL的四环素作用4小时，12,000× g离心5分钟，使用质量浓度0.8% NaCl溶液清洗两次，并重悬至2 mL的质量浓度0.8% NaCl溶液中，此样品命名为低代谢的持留菌VsP2.0样品；菌体沉淀置于冰水混合物中终止代谢。菌体使用细菌RNA提取试剂盒（北京天根细菌总RNA提取试剂盒DP430），提取总RNA，进行A₂₆₀的浓度测定，使用反转录试剂盒（Takara反转录试剂盒RR037A）将mRNA反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR试剂盒（Takara荧光定量qPCR试剂盒RR430B）进行如下反应：

①配置实时荧光定量PCR的反应体系，其中内参基因16S和 fusA基因均采用如下的比例进行混合：SYBR 反应液，10 μL；10 μM fusAF引物，1 μL；10 μM fusAR引物，1 μL；cDNA模板，0.5 μL；ROX，0.5 μL；ddH₂O，7 μL。实时荧光定量PCR使用的内参为16S rDNA，引物序列为933F（5'-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3'）和16SRTR（5'-CGTGTGTAGCCCTGGTCGTA-3'）。

②将PCR反应缓冲液置于ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行PCR。反应程序为：95 ℃，5分钟； 95 ℃，30秒； 52 ℃，20秒；72 ℃，20秒回到第步进行40个循环；72 ℃，10分钟，按照说明书设定的最佳程序，于ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行PCR，获得样本的特定基因和内参基因的C_T值（PCR体系中的荧光值到达仪器的荧光阈值所需要的循环数）。

其中活跃菌样品Vs为未经过10×MIC四环素处理的菌体；持留菌VsP组样品为250μg/mL的四环素处理后获得的低代谢的持留菌样品。

以采用2^-△△Ct的方法计算基因的相对表达水平。2^-△△CT=2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]。}

在相同的OD₆₀₀时，以活跃菌Vs组样品中， fusA基因的表达看做1，那么，在持留菌VsP组样品中， fusA基因的表达计算如下：

在OD₆₀₀=0.6时，在持留菌VsP0.6组样品中， fusA基因的表达为：

①2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}=2^{-[(25.8-25.2)-(17.3-18.9)]}=2^-(2.2)=0.22

在OD₆₀₀=1.2时，在持留菌VsP1.2组样品中， fusA基因的表达为：

②2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}=2^{-[(26.9-24.1)-(17.6-16.4)]}=2^-(1.6)=0.33

在OD₆₀₀=2.0时，在持留菌VsP2.0组样品中， fusA基因的表达为：

2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}=2^{-[(26.9-24.8)-(18.0-17.3)]}=2^-(1.4)=0.38

在持留菌中 fusA基因的表达量降低至活跃菌中的表达量40%以下，即认为此时菌体代谢进入了低代谢的持留菌状态。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种fusA基因在细菌代谢状态指示剂方面的用途，其特征在于：所述的fusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于包括以下步骤：设计fusA基因的上下游扩增引物，结合实时荧光定量PCR方法，若灿烂弧菌fusA基因表达量降低至活跃菌的40%及以下，即可认定灿烂弧菌进入低代谢的持留状态，其中fusA基因PCR扩增的上游引物fusAF序列为：5'-CATTCAAGAACAAGGGTG-3'；fusA基因PCR扩增的下游引物fusAR序列为：5'-CGAACGAAAGTTAGAGCA-3'。

3.根据权利要求2所述的一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）收集OD₆₀₀=0.6-2.0的灿烂细菌菌液，均分成两份，一份作为活跃菌；另一份加入250μg/mL的抗生素作用4小时，12,000 g 离心5分钟收集菌体，此部分菌体即为通过降低代谢水平耐受抗生素的持留菌，使用细菌RNA提取试剂盒，提取持留菌和活跃菌中的总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA中的mRNA反转录为cDNA；

（2）利用实时荧光定量PCR试剂盒中的试剂配制以下的反应混合液：SYBR 反应液，10 μL；10 μM fusAF引物，1 μL；10 μM fusAR引物，1 μL；cDNA模板，0.5 μL；内参染料ROX，0.5 μL；ddH₂O，7 μL；内参基因为16S rDNA，按照fusA基因扩增的方法制备内参基因的扩增反应混合液；

（3）将配制的反应混合物置于实时荧光定量PCR仪进行扩增反应：反应程序为：（1）95℃，5分钟；（2）95 ℃，30秒；（3）52 ℃，20秒；（4）72 ℃，20秒回到第（2）步进行40个循环；（5）72 ℃，10分钟，获得样本的fusA基因和内参基因的C_T值；

（4）计算基因的表达备注：采用2^-△△Ct的方法计算基因的相对表达水平：2^-△△CT=2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}，其中S为样本菌体，C为活跃菌菌体，将活跃菌中fusA基因的表达量看作1，样本菌体中的fusA基因相对表达量低于活跃菌的40%即为阳性值，说明细菌的代谢状态进入了低代谢的持留状态。

4.根据权利要求3所述的一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于：步骤（1）中收集培养至稳定期OD₆₀₀=2.0的灿烂细菌菌液。