CN115927549A - 基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体涉及一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂及其应用。该检测试剂包括：与待检测核酸杂交互补的引物a、引物b、DNA聚合酶和DNA内切酶。该检测试剂应用在核酸检测中，能够可靠地检测目标核酸，将克服传统EXPAR技术的关键局限性，灵敏度高，使其在分子诊断领域具有更广泛的实际应用。
Description
技术领域
本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体涉及一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂及其应用。
背景技术
核酸是生物的基本遗传物质，是基因表达的基础，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位。核酸检测是现代生物学、化学和医学中的重要研究领域，对疾病诊断、基因治疗和新型药物筛选等诸多方面产生非常重要的意义。目前几种类型的DNA等温扩增核酸检测方法得到了广泛的发展，其中，核酸序列扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、交叉引物扩增(COPIESA)等技术均采用专门设计或附加的引物组合实现目标核酸的等温扩增，目标核酸作为特殊引物进行滚环扩增(RCA)和指数扩增反应(EXPAR)。其中，EXPAR技术因其高的扩增效率和短的反应时间，过程相当简单颇受青睐。其通过DNA聚合酶和切割内切酶的活性靶核酸直接诱导双链指数放大DNA(dsDNA，但是传统EXPAR技术存在需要特殊的仪器设备进行温度的升降控制，反应过程以及操作较为复杂并且容易产生假阳性信号等缺陷。
所以，一种检测简单方便，且灵敏度高的核酸检测方法是必要的。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，该核酸检测试剂通过将待检测核酸含量转化成荧光信号，并逐渐放大荧光信号，从而进行核酸检测，检测灵敏度高；而且检测是在恒温条件下进行，不需要特殊的仪器设备，操作简单，对检测的目标物具有较高的选择性，可避免假阳性。
为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，包括：与待检测核酸杂交互补的引物a、引物b、DNA聚合酶和DNA内切酶。需要说明的是，该方法适用于任何核酸的检测，需要配套设计能特异性捕获靶核酸的引物a，引物b的设计原则是一方面能捕获到释放的短序列进而继续进行下面的扩增反应，另一方面是引物b通过延伸裂解和链置换能够生成Mg2+-DNA辅酶结构，为后续检测荧光信号提供条件。
具体地，在目标核酸存在下，通过相应的DNA聚合酶和DNA内切酶辅助，最后产生Mg2+-DNA酶。从而将目标核酸检测巧妙地转换为荧光信号；结合DNA聚合酶和DNA内切酶辅助的等温循环扩增策略和金属离子DNA酶的信号放大技术，实现目标核酸的高灵敏、特异性检测。
进一步地，上述核酸检测试剂还可以包括发夹DNA和Mg2+，在一些具体实施例中，发夹DNA还可以包含rA碱基且修饰有FAM和BHQ-1基团。
进一步地，上述核酸检测试剂中，引物a包含如SEQIDNO.1所示序列，引物b包含如SEQIDNO.2所示序列。具体地，该引物a和引物b适用于HIV-1免疫缺陷病毒基因的检测。
需要说明的是，上述核酸检测试剂中，还包括其他本领域所已知的常规辅助检测试剂，比如缓冲液等。
本发明另一方面提供一种检测试剂盒，其包含上述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂。具体地，上述检测试剂盒的组成为本领域所已知的常规形式，比如检测试剂盒会设置试剂盒说明书，比如会有盛装各种检测试剂的试剂瓶，比如会设置成若干小格子用来放置检测试剂瓶，比如会有滴管用来移取检测试剂等。
本发明再一方面提供一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法，包括：将待检测核酸与上述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂混合后，在35℃-40℃反应后进行荧光检测，根据荧光强度定量或定性检测待检测核酸。需要说明的是，在35℃-40℃反应的时间一般为1h左右，反应温度可以为36℃、37℃或38℃。
具体地，在聚合酶和切酶的辅助下，实现了信号的三级放大，具体为：目标核酸与特定的引物a杂交互补，通过DNA聚合酶扩增得到双链产物，切刻内切酶能识别双链产物的切刻位点并进行切刻，DNA聚合酶将继续正向延伸DNA链并释放DNA短序列1，产生的双链产物继续进行切刻、延伸和链置换过程，实现第一轮信号放大；释放的短序列1被引物b捕获，在聚合酶和切酶交替作用下，先生成DNA双链，再对其进行切刻，延伸和链置换，生成单链DNA产物2，实现第二轮的信号放大；释放的单链DNA产物2再与未反应的引物a杂交，启动了新的链置换扩增，聚合酶对其尾部进行延伸，得到双链产物，重复的切割、延伸和链置换导致短序列1的线性放大，实现第三轮的信号放大。
进一步地，上述基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法中，待检测核酸与上述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂反应结束后得反应液，将反应液与发夹DAN和Mg2+混合，在35℃-40℃反应后进行荧光检测，根据荧光强度定量或定性检测待检测核酸。同样地，在35℃-40℃反应的时间一般为1h左右，反应温度可以为36℃、37℃或38℃。
具体地，上述单链DNA产物2和引物a结合后每相邻的两端序列可以组装形成镁离子DNA酶，在镁离子存在下该酶切割溶液当中的分子信标(发夹DNA)，断开的分子信标释放下来并发出荧光，新的分子信标又与镁离子DNA酶结合、被切割，循环放大荧光信号，实现第四轮的信号放大，大大提高了检测效率和灵敏度。
进一步地，上述于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法中，发夹DNA包含rA碱基且修饰有FAM和BHQ-1基团。
进一步地，待检测核酸可以为HIV-1免疫缺陷病毒基因，此时引物a包含如SEQIDNO.1所示序列，引物b包含如SEQIDNO.2所示序列；在一些具体实施例中，HIV-1免疫缺陷病毒基因包含如SEQIDNO.3所示序列。
本发明再一方面提供一种基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测引物组，包括序列如SEQIDNO.1所示序列的引物a和序列如SEQIDNO.2所示序列的引物b。
本发明再一方面提供一种检测试剂或检测试剂盒，包括上述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测引物组。
具体地，上述检测试剂盒的组成为本领域所已知的常规形式，比如检测试剂盒会设置试剂盒说明书，比如会有盛装各种检测试剂的试剂瓶，比如会设置成若干小格子用来放置检测试剂瓶，比如会有滴管用来移取检测试剂等。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
本发明有益效果至少包括：
(1)本发明提供的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂应用在核酸检测中，能够可靠地检测目标核酸，将克服传统EXPAR技术的关键局限性，使其在分子诊断领域具有更广泛的实际应用；
(2)本发明提供的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂应用在核酸检测中，灵敏度高。
附图说明
图1为基于聚合酶和切刻酶辅助DNA等温循环扩增金属离子DNA酶信号放大策略检测核酸原理图；
图2为DNA等温循环扩增信号放大可行性荧光图；
图3为不同靶标浓度的荧光检测情况图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
以下实施例中，使用的主要装置包括：高速冷冻离心机(16R，珠海黑马医学仪器有限公司)、超纯水机(Sybergy UV，默克密理博)、荧光分光光度计(FL970，上海天美科技仪器有限公司)和丙烯酰胺水平电泳槽(JY-SCZ2+，北京君意)。
以下实施例中，使用的主要试剂包括：牛血清蛋白、10x NEBuffer 3.1、Klenowfragment exopolymerase(5000U/mL)、Nb.BbvCI nicking endonucleases(10000U/mL)、dNTP混合液和所有DNA序列由艾科瑞生物合成(其中发夹包含一个可以被离子酶识别的rA碱基且修饰有FAM、BHQ-1基团)；具体地，这些DNA序列如下表1所示。
表1实施例中使用到的DNA序列
实施例1：DNA等温循环扩增
首先，在50μL反应溶液中含20mMTris–HCl(pH7.48，100mMNaCl，10mMMgCl2)，12.5μLdNTP混合液(250μM)，5μLBSA(0.01mg/mL)，5μL1xNEBuffer3.1，1μLKlenowfragmen-texopolymerase(0.1U/μL),1LNb.BbvCInickingendonucleases(0.1U/μL)，2μL靶标T(0.4μM)，4μL引物链S1(0.8μM),4μL引物链S2(0.8μM)，然后，将2μL发夹结构H(0.4μM)，5μLMg2+(10mM)加入上述反应液中，37℃反应1小时。最后，取上述反应液稀释到100μL进行荧光信号检测，荧光检测验证DNA等温循环扩增可行性，结果如图2所示。
实施例2顺序自组装镁离子DNA酶和检测不同靶标浓度荧光信号
引物链S1(4μL,0.8μM)、S2(4μL,0.8μM)，靶标T(2μL，0.4μM)，1μLKlenowfragmentexopolymerase(0.1U/μL)，1μLNb.BbvCInickingendonucleases(0.1U/μL)，12.5μLdNTP混合液(250μM)，5μLBSA(0.01mg/mL)，5μL1xNEBuffer3.1，50μL反应溶液混匀后37℃反应1小时。DNA等温循环扩增反应后得到的产物中加入分子信标发夹结构H(2μL，0.4μM)、Mg2+(5μL，10mM)，混匀后37℃反应1小时。将上述反应液稀释到100μL，荧光检测可见520nm的信号峰；重复上述操作，检测该核酸扩增信号放大体系对不同浓度靶标的荧光响应，分别为：0、10aM、100aM、1fM、100fM、1pM、100pM、1nM和100nM(如图3所示)。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (10)
1.基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，其特征在于，包括：与待检测核酸杂交互补的引物a、引物b、DNA聚合酶和DNA内切酶。
2.根据权利要求1所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，其特征在于，还包括发夹DNA和Mg2+。
3.根据权利要求2所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，其特征在于，发夹DNA包含rA碱基且修饰有FAM和BHQ-1基团。
4.根据权利要求1至3中任一所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂，其特征在于，引物a包含如SEQ ID NO.1所示序列，引物b包含如SEQ ID NO.2所示序列。
5.检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4中任一所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂。
6.基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法，其特征在于，包括：将待检测核酸与权利要求1中所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂混合在35℃-40℃反应后进行荧光检测，根据荧光强度定量或定性检测待检测核酸。
7.根据权利要求6所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法，其特征在于，包括：待检测核酸与权利要求1中所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测试剂反应结束后得反应液，将反应液与发夹DNA和Mg2+混合，在35℃-40℃反应后进行荧光检测，根据荧光强度定量或定性检测待检测核酸。
8.根据权利要求6或7所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测方法，其特征在于，待检测核酸为HIV-1免疫缺陷病毒基因，引物a包含如SEQ ID NO.1所示序列，引物b包含如SEQ ID NO.2所示序列。
9.基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测引物组，其特征在于，包括序列如SEQID NO.1所示序列的引物a和序列如SEQ ID NO.2所示序列的引物b。
10.检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述的基于多重等温循环扩增信号放大的核酸检测引物组。
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