CN115927452A - 一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法，涉及分子生物学技术和基因工程领域；根据栽培大豆果荚成熟后易开裂表型以及通过分析鉴定出大豆可能是qPDH1基因表达造成的成熟果荚干燥后易开裂，以此构建了基因qPDH1的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及通过大豆的遗传转化技术，成功得到qPDH1被编辑的大豆植株，并获得了T1代的编辑苗，通过对T1代的大豆果荚干燥处理，发现被编辑的材料大豆果荚易开裂性状消失，有效地解决了大豆果荚易开裂的表型，对大豆规模化机械生产具有重要的意义。

Description

一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术和基因工程领域，特别涉及一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法。

背景技术

果荚开裂是豆类和十字花科作物种子传播的关键性状，在果荚类农作物生产过程中可导致显着的产量损失。一般果荚干燥后，导致果荚壁开裂的主要原因有：果荚壁结合强度的降低；果荚壁产生的开裂力。在大豆规模化机械生产过程中，果荚开裂是不可忽视的性状，在干旱和半干旱地区抗大豆果荚开裂性状至关重要。

果荚开裂的本质是由细胞分离现象造成的，细胞分离必然牵涉到细胞壁的软化和降解，而纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶通过调控纤维素、半纤维素和果胶的降解来影响细胞壁的组成，参与果荚的开裂。

现有技术中，文献《Dehiscence-related expression of an Arabidopsisthaliana gene encoding a polygalacturonase in transgenic plants of Brassicanapus》(Jenkins ES,Paul W,Craze M,et al)中公开了在甘蓝型油菜中的果胶酶RDPG1和与之同源的拟南芥ADPG1基因参与了花药和果荚开裂；文献《Apple SVP family MADS-boxproteins and the tomato pedicel abscission zone regulator JOINTLESS havesimilar molecular activities》(Nakano T,Kato H,Shima Y,et al)公开了INDEHISCENT(IND),HECATE3(HEc3)以及MADS-box类的转录因子，通过调控ADPG1和ADPG2的在果荚开裂区域表达来调控果荚的开裂；文献《Molecular basis of a shattering resistanceboosting global dissemination of soybean》(Funatsuki H，Suzuki M，Hirose A，etal.)公开了Pdh1基因编码一种参与木质化的dirigent(DIR)家族蛋白，它通过促进干豆荚壁的扭转来增加开裂力，在栽培大豆中存在qpdh1突变体，是qPDH1基因的第31个氨基酸由AAG突变为TAG导致提前终止，出现抗裂荚性状。由此可见，虽然现有文献中已经公开了qPDH1基因与大豆炸荚有一定的关系，但是采用何种手段调控qPDH1基因以准确改良大豆炸荚的问题，目前还未有人进行深入体验。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，具体通过CRISPR-Cas9基因编辑技术和大豆遗传转化技术实现。

本发明提供的利用基因编辑改良大豆炸荚的方法包括以下步骤：

S1、针对qPDH1基因表现型为裂荚的大豆品种，设计CRISPR/Cas9系统靶点，为gcatgttgtggcctcttcactgg；

S2、构建大豆qPDH1基因编辑载体；

S3、利用遗传转化技术将所述大豆qPDH1基因编辑载体导入到大豆种子材料的基因组中，筛选获得qPDH1基因功能丧失的大豆品种。

优选的，所述大豆的品种为中豆40。

进一步地，所述步骤S2具体为，使用pEGCas9PM4-B空载、引物qPDH1-TF和引物qPDH1-TR构建大豆qPDH1基因编辑载体，引物qPDH1-TF和引物qPDH1-TR的核苷酸序列为：

qPDH1-TF:attgcatgttgtggcctcttcac(如SEQ ID NO.4所示)；

qPDH1-TR:aaactgaagaggccacaacatgc(如SEQ ID NO.5所示)；

组装的具体方式为：取引物1μL qPDH1-TF、1μL qPDH1-TR、8μL无菌水，放入EP管中混匀，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到qPDH1引物混合液；再取1μLqPDH1引物混合液，与30ng pEGCas9PM4-B空载、1μL 10×CutSmart Buffer、35U T4 DNA连接酶、10U Bsal限制性内切酶和无菌水组成10μL混合体系，37℃培养1h；

连接完成的混合液转化进入DH5a大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成pEGCas9PM4-B-qPDH1序列。

进一步地，所述pEGCas9PM4-B空载的序列如SEQ ID NO.2所示，所述pEGCas9PM4-B-qPDH1载体的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，步骤S3中，所述大豆遗传转化技术包括大豆种子灭菌、农杆菌EHA105制备、大豆种子萌发、外植体准备、侵染和共培养、恢复培养、筛选和再生、生长培养。

一般情况下，在完成所述大豆遗传转化技术的步骤后，还可以提取经过基因编辑的大豆品种的基因组DNA进行测序，验证大豆品种是否经过基因改良，以及基因的具体突变类型。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明研究出CRISPR-Cas基因编辑系统可以有效的改良因qPDH1裂荚基因型造成的大豆栽培品种“中豆40”的果荚开裂现象，解决在大豆大规模机械化生产应用中的关键问题，并探索出利用基因编辑技术进行大豆育种的可实施性。

附图说明

图1为实施例中步骤1中的凝胶电泳图；

图2为实施例中步骤3中所述载体pEGCas9PM4-B-qPDH1的图谱；

图3为实施例中步骤5中的凝胶电泳图：

图4为实施例中步骤5中的扩增Sanger测序峰图；

图5为实施例中步骤6中的T1代纯合植株的测序峰图；

图6为实施例中步骤6中的野生型(ZD40-WT)和突变型材料(ZD40-qpdh1(5-del))的果荚开裂结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例选取中豆40的qPDH1为基因编辑对象进行试验，所述中豆40由中国农业科学院油料作物研究所提供，具体试验步骤如下：

1、验证中豆40的qPDH1基因序列

根据大豆qPDH1(Glyma16g25580.1)基因序列设计引物qPDH1-F和qPDH1-R，设计的引物如下：

qPDH1-F:tccgtcttcttttcttcttctc(如SEQ ID NO.6所示)；

qPDH1-R:gacgaggctgtagacaaaacaa(如SEQ ID NO.7所示)；

使用引物qPDH1-F和qPDH1-R，扩增中豆40qPDH1基因，扩增体系如下：

PCR反应参数：

再用扩增结果进行凝胶电泳，得到目标条带为654bp，凝胶电泳图如图1所示；把图1中的扩增条带送去测序公司进行Sanger测序，得到的qPDH1基因验证结果测序结果如SEQID NO.1所示，将测序结果与Glyma16g25580.1基因序列比对分析发现中豆40的基因型第31个氨基酸为AAG，为qPDH1裂荚表型基因型，非qpdh1突变体抗裂荚表型，由此总结：中豆40裂荚很可能是qPDH1裂荚性状基因型造成的。

2、CRISPR/Cas9系统靶点设计；

根据上述验证结果，设计CRISPR/Cas9靶点进行敲除，使qPDH1基因丧失功能，模拟qpdh1突变体表型。

设计靶点序列为：gcatgttgtggcctcttcactgg。

3、组装构建大豆qPDH1基因编辑载体

本发明使用的大豆基因编辑载体空载由武汉艾迪晶科技有限公司提供pEGCas9PM4-B，空载序列如SEQ ID NO.2所示，空载体在DB3.1菌种(购买于北京擎科生物科技有限公司)中繁育，该载体的特点为使用PM4大豆生长因子基因启动子启动Cas9，使用大豆U6启动子启动sgRNA，再用Basta筛选抗性，可以在大豆基因编辑体系中实现较高编辑效率。

设计合成的靶点引物如下：

qPDH1-TF:attgcatgttgtggcctcttcac(如SEQ ID NO.4所示)；

qPDH1-TR:aaactgaagaggccacaacatgc(如SEQ ID NO.5所示)。

组装大豆qPDH1基因编辑载体的具体方式为：取引物1μL qPDH1-TF、1μLqPDH1-TR、8μL无菌水，放入EP管中混匀，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到qPDH1引物混合液；再取1μL qPDH1引物混合液，与30ng pEGCas9PM4-B空载、1μL 10×CutSmartBuffer、35U T4 DNA连接酶、10UBsal限制性内切酶和无菌水组成10μL混合体系，37℃培养1h。

连接完成的混合液转化进入DH5a大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成载体pEGCas9PM4-B-qPDH1序列如SEQ ID NO.3所示，所述载体pEGCas9PM4-B-qPDH1的图谱如图2

4、大豆遗传转化

利用农杆菌EHA105介导侵染大豆种子子叶的遗传转化方法，将基因编辑载体pEGCas9PM4-B-qPDH1导入到中豆40材料基因组中，使其发挥功能。中豆40由中国农业科学院油料作物研究所杨中路老师提供，大豆遗传转化过程由武汉艾迪晶生物科技有限公司完成。

大豆遗传转化详细过程如下：

(1)大豆种子灭菌；

挑选干燥的，表面光滑，无病斑的大豆种子置于培养皿中，将装有种子的培养皿放入干燥器中，利用次氯酸钠和浓盐酸反应生成的氯气进行过夜灭菌，灭菌过的种子2-3周挥发掉氯气，再进行播种。

(2)农杆菌EHA105的制备；

把上述构建好的植物表达载体pEGCas9PM4-B-qPDH1，通过电转仪转化到EHA105农杆菌感受肽细胞中，涂布在利福平和卡纳霉素的双抗LB固体培养基上，在28°恒温箱进行农杆菌的培养。侵染液的制备：收集上述菌板上的农杆菌细胞，悬浮在液体的侵染培养基中，悬浮液置于无菌的离心管中。涡旋离心管，直至农杆菌细胞均匀的分散在悬浮液中，用分光光度计测量农杆菌的悬浮液，光吸收值A660约为0.60+0.15左右。

(3)大豆种子萌发；

侵染前一天，播种无菌的种子在萌发培养基上,播种时注意半粒种子插入培养基中，尽量种脐接触培养基。黑暗24-26oC培养16-36小时。检查每粒种子是否有污染或者表面病斑，如果发现这种种子需要做好记录或者直接剔除。

(4)外植体准备；

挑选正常萌发的大豆种子，用镊子夹住种子，用解剖刀切去伸长的下胚轴，留下约2毫米。弃去种皮，露出子叶。用镊子固定住种子，用解剖刀除去一个子叶，使带有两片原叶的茎尖暴露出来。在解剖镜下，用解剖刀钝端弃去两片原叶，以暴露顶端的分生组织。用刀片锋利的末端轻轻伤害茎尖，得到外植体。

(5)侵染和共培养；

将步骤(4)中的外植体放入培养皿中，通常50-100个外植体接种50毫升的农杆菌悬浮液，侵染至少30分钟至一夜之间。侵染后，将农杆菌悬浮液从培养皿中吸出弃去，然后将外植体轴面向上放到覆盖滤纸的共培养培养基上，在黑暗中进行共培养3-5天。

(6)恢复培养

共培养后，修剪外植体伸长的下胚轴，将外植体移植到无筛选剂的恢复培养基中，此培养基中添加适当的抗生素可以抑制农杆菌生长。子叶节插入到培养基中，7-14个外植体通常转移到一个培养皿，在24-26℃、60-80μEm-2S-1光强度和光周期(16/8小时光明/黑暗)的条件下培养4-7天。

(7)筛选和再生

恢复培养后，将外植体移入再生培养基中，所述再生培养基中含有适当的筛选剂和抗生素，在24-26℃、60-80μEm-2S-1光强度和光周期(16/8小时光明/黑暗)的条件下培养2-3周。

(8)伸长培养

从再生培养基上取下外植体，切下坏死组织及各外植体附着的子叶。将外植体插入到伸长培养基中。在24-26℃、60-80μEm-2S-1光强度和光周期(16/8小时光明/黑暗)的条件下培养。每3周进行一次继代培养，每次继代时切下坏死的组织，把细长的嫩芽移入较深的无菌培养瓶中，当重新生成的芽长得足够长并有足够的叶片时，进行阳性苗检测分析，得到转基因苗。

5、大豆基因突变类型验证：

从步骤4中获得的转基因苗中取少量叶片，提取基因组DNA，在目标位点设计引物，通过PCR扩增出目标位点条带，进行Sanger测序，通过使用Sanger测序峰值，使用解码软件DSDecodeM分析出基因的具体突变类型。

具体步骤如下：

(1)设计的qPHD1检测引物如下：

qPDH1-F:tccgtcttcttttcttcttctc(如SEQ ID NO.6所示)；

qPDH1-R:gacgaggctgtagacaaaacaa(如SEQ ID NO.7所示)；

(2)扩增目的片段：

PCR反应体系如下：

体系成分	反应体积50μl
		2x Taq Mix	25μl
qPDH1-F	1μl
		qPDH1-R	1μl
DNA	1μl
		ddH2O	22μl

PCR反应条件：

再用扩增结果进行凝胶电泳，凝胶电泳图如图3所示；把图3中的扩增条带送去测序公司进行Sanger测序，测序交付样品测序数据，使用解码软件DSDecodeM分析，参考野生型序列分析出基因的具体突变类型。扩增Sanger测序峰图如图4所示，解码结果如下：

Allele1:atggtgcatgttgtggcc-----actgggaagggtgaa(5bp-deletion)；

Allele2:atggtgcatgttgtggcctcttcactgggaagggtgaa(WT)。

大豆材料根据上图4的Sanger测序峰图，经过峰图解码软件DSDecodeM解码分析得出一下，该转基因苗的T0代样本为杂合突变，突变解码为距离PAM位点3-7bp碱基缺失，缺失5bp，造成qPDH1基因阅读框移码突变。

6、大豆繁种育种

把上述转基因苗的T0代样本，委托武汉艾迪晶生物有限公司在西双版纳育种基地繁育1代，获得T0代的种子，鉴定出4株T1代纯合植株。T1代纯合植株的测序峰图如图5所示：其中40-0为野生型，40-1和40-2为T1代纯合植株，40-1和40-2的靶序列中间缺失“AAGAG”5个碱基，使qPDH1基因功能丧失。

把T1代的中豆40编辑材料和野生型果荚种植成熟，待枯黄后收取材料果荚，在37度烘箱烘2天后，对比野生型(WT)和突变型材料(qpdh1(5-del))的果荚开裂情况，野生型(WT)和突变型材料(qpdh1(5-del))的果荚开裂结果图如图6所示，图6的结果显示利用CRISPR/Cas9技术，编辑qPDH1(Glyma16g25580.1)裂荚基因型的材料，可以有效的解决大豆在干燥后的果荚开裂现象。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、针对qPDH1基因表现型为裂荚的大豆品种，设计CRISPR/Cas9系统靶点，为gcatgttgtggcctcttcactgg；

S2、构建大豆qPDH1基因编辑载体；

S3、利用遗传转化技术将所述大豆qPDH1基因编辑载体导入到大豆种子材料的基因组中，筛选获得qPDH1基因功能丧失的大豆品种。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述大豆的品种为中豆40。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤S2具体为，使用pEGCas9PM4-B空载、引物qPDH1-TF和引物qPDH1-TR构建大豆qPDH1基因编辑载体，所述引物qPDH1-TF和引物qPDH1-TR的核苷酸序列为：

qPDH1-TF:attgcatgttgtggcctcttcac；

qPDH1-TR:aaactgaagaggccacaacatgc；

组装的具体方式为：取引物1μL qPDH1-TF、1μL qPDH1-TR、8μL无菌水，放入EP管中混匀，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到qPDH1引物混合液；再取1μLqPDH1引物混合液，与30ng pEGCas9PM4-B空载、1μL 10×CutSmart Buffer、35U T4 DNA连接酶、10U Bsal限制性内切酶和无菌水组成10μL混合体系，37℃培养1h；

连接完成的混合液转化进入DH5a大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成pEGCas9PM4-B-qPDH1载体。

4.根据权利要求3所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述pEGCas9PM4-B空载的序列如SEQ ID NO.2所示，所述pEGCas9PM4-B-qPDH1载体的序列如SEQID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤S3中，所述大豆遗传转化技术包括大豆种子灭菌、农杆菌EHA105制备、大豆种子萌发、外植体准备、侵染和共培养、恢复培养、筛选和再生、生长培养。

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