CN115927339B - 一种提高侏儒蛤生长速度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高侏儒蛤生长速度的方法，该方法通过抑制生长抑制素MSTN基因的表达。该方法具体包括下述步骤：筛查侏儒蛤中的MSTN基因，得到MSTN1和MSTN2两个基因的序列；选择RNA干扰片段；设计干扰引物；对MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段进行扩增及测序验证；构建RNA干扰质粒：诱导表达dsRNA；通过饲喂法进行侏儒蛤MSTN基因的RNA干扰。本发明验证了侏儒蛤两个MSTN基因均具有抑制肌肉甚至整体生长的作用，并且两个MSTN基因负调控生长的作用是叠加的。因此，可通过抑制双壳贝类MSTN基因获得快速生长的个体，本发明可为速生高产贝类良种的培育提供理论支持。

Description

一种提高侏儒蛤生长速度的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过RNA干扰技术抑制MSTN基因的表达从而提高双壳贝类生长速度的方法。

背景技术

贝类养殖业是我国重要的海水养殖支柱产业，海洋贝类以味道鲜美、营养丰富为特色，是经济价值较高的海珍品。其中，扇贝具有发达的闭壳肌，所制成的干贝又称瑶柱，被称为海产八珍之一，具有较高的营养价值。因此，提高生长速度、获得高出肉率的贝类新品种一直是贝类养殖业的育种目标，这在一定程度上推动了对于贝类生长的分子基础研究。筛查和鉴定在贝类肌肉乃至整体生长中可能发挥作用的基因，既有利于贝类的繁育，也有利于我们了解双壳贝类生长差异的遗传机制。

肌肉生长抑制素基因(myostatin，MSTN)是转化生长因子β超家族的成员，在哺乳动物骨骼肌的发育和生长中发挥负调控作用。在小鼠、狗、牛和人类中，MSTN基因的突变或功能丧失导致肌肉质量的增加，产生双肌表型，具体表现为肌纤维数目的增多和纤维面积的增大。由于MSTN基因在控制肌肉质量方面的关键作用，MSTN基因已成为养殖动物遗传改良的重要位点。到目前为止，MSTN已经从包括哺乳动物、鸟类和鱼类在内的多种脊椎动物以及海洋双壳贝类、虾蟹等无脊椎动物中克隆和鉴定出来。所有已鉴定到的MSTN都具有很保守的氨基酸序列，表明MSTN基因在进化中具有调节肌肉生长的保守功能。

与脊椎动物相比，海洋软体动物MSTN基因的研究相对薄弱。许多学者对于双壳贝类MSTN的结构、表达与调控开展了相关研究，并取得了显著的成果。在虾夷扇贝、栉孔扇贝、海湾扇贝、紫贻贝、缢蛏、牡蛎等多种双壳贝类均筛查到单一的MSTN基因，并发现该基因不仅在肌肉中表达，具有不同于哺乳动物的表达模式。在牡蛎中，研究人员通过基因编辑成功对MSTN基因实现了敲除，但并没有观察到表型性状。MSTN基因对于双壳贝类组织和整体生长的具体作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高双壳贝类-侏儒蛤生长速度的方法，以弥补现有技术的不足。

本发明发现在侏儒蛤中具有两个MSTN基因，并且均在胚胎发育和成体各组织中均有表达。由于MSTN是关键的生长负调控基因，因此对该基因生长调控机制的研究对于贝类优良品种的遗传选育具有一定的理论支持。

为了实现上述目的，基于上述研究，本发明采取如下具体技术方案：

一种提高侏儒蛤生长速度的方法，该方法基于RNA干扰来抑制侏儒蛤中MSTN1和MSTN2两个基因表达。

上述方法具体包括下述步骤：

(1)筛查侏儒蛤中的MSTN基因，得到MSTN1和MSTN2两个基因序列，并选择MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段，具体序列见序列表SEQ NO.1和SEQ NO.2；

(2)分别设计MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段的干扰引物；

(3)对MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段进行扩增及测序验证；

(4)构建RNA干扰质粒：

(5)诱导表达dsRNA；

(6)通过饲喂法进行侏儒蛤MSTN基因的RNA干扰。

进一步的，所述步骤(1)中：将其他物种的MSTN的序列作为参考序列比对侏儒蛤的基因组，筛查得到侏儒蛤的两个MSTN基因，MSTN1和MSTN2基因；并选择MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段，分别为SEQ NO.1和SEQ NO.2，具体序列见序列表。

更进一步的，所述MSTN1基因的全长为18,769bp，有三个外显子组成，其中ORF全长1,425bp，编码蛋白长度为474个氨基酸；所述MSTN2基因全长8,461bp，由五个外显子组成，其中ORF全长1,362bp，编码453个氨基酸。

进一步的，所述步骤(2)中，将干扰片段SEQ NO.1和SEQ NO.2的cDNA序列利用在线网站预测siRNA，随后选择400-600bp左右的干扰片段，设计带酶切位点的干扰引物。

更进一步的，所述引物序列如下：

MulMSTN1-dsRNA-F CGAGCTCATGACTGGGAAAACGATACCAAAGA；

MulMSTN1-dsRNA-R CCGCTCGAGCCAATGATGAACAATATGGGAAAAT；

MulMSTN2-dsRNA-F CCGCTCGAGTGACGGACATACCGTCTGT；

MulMSTN2-dsRNA-R CGAGCTCATGTCTTTCCCGAATACGAAGATT。

进一步的，所述步骤(3)中，利用高保真酶扩增MSTN1和MSTN2基因的干扰片段，切胶进行纯化回收；再将干扰片段连接到blunt载体上，并转化到DH5α感受态细胞中；并通过挑取阳性克隆送测验证序列准确性。

进一步的，所述步骤(4)中，将测序合格的单克隆菌株进行质粒提取，随后将含目的基因片段的质粒和L4440质粒进行双酶切反应，随后利用DNA连接酶将目的基因干扰片段与L4440质粒进行连接；再转化到HT115(DE3)感受态细胞中。

进一步的，所述步骤(5)中，在L4440质粒载体上，目的基因插入片段两侧具有两个T7启动子，双向合成dsRNA；质粒上带有的Lac乳糖操纵子使得通过外源添加IPTG来诱导dsRNA的产生。

进一步的，所述步骤(6)中，收集诱导dsRNA后的细菌与小球藻混合，对侏儒蛤进行投喂。

上述方法还包括验证步骤：目的基因敲降效率的验证：经过一定时间的持续干扰投喂后，对侏儒蛤的各组织进行取样，利用RT-PCR的方法检测各组中目的基因的表达水平。再检测分析表型性状：在持续干扰一段时间，对不同组的侏儒蛤个体进行生长性状的测定，如壳高、壳长、壳宽、全湿重、壳加肉重以及壳重，并可以通过计算获得软体重和肌肉重。通过比较不同实验组与对照组侏儒蛤的生长性状差异和基因表达量反映干扰MSTN基因对于侏儒蛤生长的影响。

上述方法能够应用到其他双壳贝类生长调控的研究中。

该应用具体为：首先筛选双壳贝类中与生长相关的调控基因，如MSTN基因；再通过RNA干扰方进行调控双壳贝类生长。

本发明的优点及积极效果为：

本发明提供了一种提高双壳贝类-侏儒蛤生长速度的方法，通过饲喂法对侏儒蛤MSTN基因进行RNA干扰，以抑制该基因的表达后促进侏儒蛤的生长。本发明通过持续对侏儒蛤MSTN基因进行干扰30天，发现MSTN1和MSTN2基因分别进行干扰后侏儒蛤的表型性状显著高于对照组，而且两个基因同时干扰后侏儒蛤的表型性状均高于以上三组。本发明验证了侏儒蛤两个MSTN基因均具有抑制肌肉甚至整体生长的作用，并且两个MSTN基因负调控生长的作用是叠加的。因此，可通过抑制双壳贝类MSTN基因获得快速生长的个体，本发明可为优质高产的经济贝类的选择育种提供理论支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术面熟中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1侏儒蛤MSTN基因RNA干扰质粒的构建图。

图2侏儒蛤MSTN基因dsRNA提取的凝胶电泳检测图。

图3侏儒蛤MSTN基因干扰15天的目的基因定量结果图。

图4侏儒蛤MSTN基因干扰30天的目的基因定量结果图。

图5MSTN基因干扰15天后四个组的侏儒蛤表型变化。

图6MSTN基因干扰15天后四个组的侏儒蛤生长性状的统计分析。

图7MSTN基因干扰30天后四个组的侏儒蛤表型变化。

图8MSTN基因干扰30天后四个组的侏儒蛤生长性状的统计分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及要点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以揭示本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：侏儒蛤MSTN的RNA干扰质粒的构建

(1)目的基因的筛查及序列分析：MSTN1基因的全长为18,769bp，有三个外显子组成，其中ORF全长1,425bp，编码蛋白长度为474个氨基酸；MSTN2基因全长8,461bp，由五个外显子组成，其中ORF全长1,362bp，编码453个氨基酸。两个蛋白序列的同源性为22.57％。

(2)反义RNA靶位点的分析和干扰引物的设计：使用在线网站siDirectversion2.0

(http://sidirect2.rnai.jp/)对目标基因的RNAi序列进行预测和筛选，避免一种dsRNA会同时对两个MSTN基因的表达均产生影响。针对靶标基因的干扰片段，使用PrimerPremier5.0软件设计相应的引物，引物需要满足基因组唯一比对的原则。随后，将两个MSTN干扰片段的序列提交到NEBcutter V2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)选择0cutter，在可选择的限制性核酸外切酶中，选择L4440质粒中存在的两个核酸外切酶即可。外切酶的外侧需要加上每种酶对应的保护碱基。本实施例中所用的dsRNA引物如下表所示：

干扰目的基因的引物序列表

(3)干扰片段的PCR扩增及测序验证

利用苯酚氯仿法提取侏儒蛤组织的RNA，反转录成cDNA后为模板，使用Q5超保真DNA聚合酶对两个MSTN基因的干扰片段进行扩增，反应体系如下表所示，共扩增一整个八连排管200μl体系。PCR反应的条件设置为：98℃预变性30s；98℃变性10s，

58℃退火30s，72℃延伸10s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检验扩增条带，将正确扩增条带的PCR产物条带切下后，使用QIAquick PCR Purification Kit胶回收试剂盒按照操作说明书进行纯化，利用Nanodrop分光光度计对纯化的产物浓度进行测定。随后，将纯化后的干扰片段与Blunt载体于25℃的PCR仪上连接10min。连接后通过热激法将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于37℃摇床上220rpm培养1h，随后涂布于含Amp的LB固体培养基上。将固体平板于37℃恒温培养箱中倒置培养12h。

次日挑取阳性克隆菌株进行检测，具体步骤如下所述。首先，打开超净工作台中的紫外灯进行杀菌20min，在此期间可以准备菌落PCR，按照如下反应体系加入，菌落PCR所用引物是blunt载体上的通用引物M13F和M13R。随后，用移液枪吸取800μl加有Amp的LB液体培养基于1.5mlEP管中，使用灭菌牙签挑取单菌落后，先在PCR反应体系中震荡，随后将牙签放到1.5ml管中，两个管的编号要一一对应。单克隆挑取完毕后，将接入单菌落的液体培养基置于37℃摇床上220rpm恒温培养4h。将PCR管置于PCR仪上，设置反应程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将阳性克隆的菌株送至青岛生工公司进行测序验证。

(4)双酶切反应：使用去内毒素的质粒提取试剂盒将上述测序正确的菌株进行质粒提取，随后根据以下反应体系对目的干扰片段以及L4440载体进行双酶切反应，将体系混匀后置于PCR仪上37℃反应20min。双酶切结束后，取10μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，以未酶切的目的干扰片段和L4440载体为对照进而明确目的片段和L4440载体是否被成功切开。酶切成功后的目的片段和L4440载体进行切胶回收，并测定回收浓度。

(5)连接和转化反应

用T4 DNA连接酶将上述酶切产物与L4440质粒载体进行连接反应，连接反应体系如下：

将上述组分加至PCR管中混匀后，置于PCR仪上25℃中反应10min，连接产物即MulMSTN1-L4440和Mul MSTN2-L4440重组质粒,重组质粒图谱如图1所示。随后，通过热激法将以上重组质粒以及L4440空载质粒分别转化至HT115(DE3)感受态细胞中，随后将菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)的固体培养基上，于37℃条件下倒置培养12h。

使用灭菌牙签挑取单克隆菌落于含Amp和Tet的LB液体培养基中，将PCR验证过的阳性克隆菌株送至青岛生工公司进行测序，再次验证目的基因序列的正确性。

(6)dsRNA的诱导表达

取10μl上述测序正确的菌株接种于5ml含Amp和Tet的LB液体培养基中，37℃，220rpm条件下过夜培养。次日，以1:50的比例转接到新鲜的含双抗的LB液体培养基中进行扩大培养，待紫外分光光度计检测菌液的OD值在04-0.6之间时，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导dsRNA的表达。诱导培养4h后收集菌液，离心后弃掉上清，收集细菌沉淀保存于-80℃冰(7)dsRNA的提取和检测

按照说明书要求使用Trizol法提取细菌总RNA，使用RNaseT1消化单链RNA。随后，利用分光光度计Nanodrop测定RNA的浓度和质量，最后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA条带位置。如图2所示，泳道1为表示未加IPTG诱导的MulMSTN1菌株的RNA，泳道2表示加入IPTG诱导的MulMSTN1菌株的RNA；泳道3表示未加IPTG诱导的MulMSTN2菌株的RNA，泳道4表示加入IPTG诱导的MulMSTN2菌株的RNA；泳道5表示100bp DNAladder。结果表明，经IPTG诱导后，大肠杆菌HT115成功表达出了侏儒蛤两个MSTN基因的dsRNA，目的基因的dsRNA在图中均用箭头标出。

实施例2投喂法进行侏儒蛤MSTN基因的RNA干扰实验

(1)实验前准备：

挑选同一群体、个体均一的2月龄侏儒蛤个体800只，分为四个组，分别是对照组、dsM1组、dsM2干扰组、dsM1/2组。在干扰实验开始前，每组随机抽取100只侏儒蛤进行体尺性状(壳长、壳高、壳宽、全湿重)的测定。

(2)dsRNA的制备：

按照上述方法诱导dsRNA的表达，随后，用50ml离心管取30ml诱导后的L4440空载质粒的HT115菌株，各取两管同样体积诱导后的含MulMSTN1-L4440重组质粒的HT115菌株和含MulMSTN2-L4440重组质粒的HT115菌株。8000rpm离心2min后，弃掉上清液，收集细菌沉淀。其中，1管含MulMSTN1-L4440重组质粒和1管含MulMSTN2-L4440重组质粒的细菌沉淀中各加入50μl的小球藻，振荡混匀作为第4组的饵料。其余三管均加入100μl小球藻，涡旋振荡后重悬菌液，得到菌藻混合物，作为1-3组的饵料。

(3)投喂方案：

侏儒蛤的干扰实验中每天投喂两次，早上9点四个组均投喂100μl的浓缩小球藻，投喂密度为5x10⁴ cells/mL。晚上9点，各组投喂菌藻混合物，对照组投喂100μl含L4440空载质粒的菌藻混合物，dsM1组投喂100μl含MulMSTN1-L4440质粒的菌藻混合物，dsM2组投喂100μl含MulMSTN2-L4440质粒的菌藻混合物，dsM1/2组投喂100μl含MulMSTN1-L4440质粒和含MulMSTN2-L4440质粒的菌藻混合物。在干扰实验过程中，每两天清理养殖缸并更换海水，海水温度为22℃左右，盐度为27-28ppt，养殖水体持续通气供养。

下面结合实验结果对本发明的技术效果作详细的描述。

(4)目的基因表达水平的检测：

设计两个MSTN基因的qRT-PCR引物，为保证对目的基因定量的准确性，引物设计的区段应避开RNA干扰片段。选取EF1α作为内参基因，引物序列如下：

对干扰15天和30天的侏儒蛤进行解剖，每组取90只侏儒蛤进行全组织取材，每30只混为一组取材，共3组生物重复。提取上述各组侏儒蛤个体的肌肉RNA，反转录得到cDNA，稀释5倍作为模板(10ng/μl)。反应体系如下所示：

每个样品设置三个技术重复，反应在LightCycler480Real-time PCR System上进行，程序设定为50℃预变性2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环后进入融解曲线分析程序：60℃-95℃(0.11℃/s)。定量的结果使用2^-△△Ct法计算相对表达量，溶解曲线分析用于排除非特异性扩增的影响。利用T-test计算各组之间目的基因表达量的差异显著性，**表示p<0.01，*表示p<0.05。

侏儒蛤肌肉组织中的MSTN基因表达量检测结果如图3所示。在持续干扰15天后，与对照组相比，MSTN1基因在dsM1组和dsM1/2组中的表达量分别显著降低了59.38％和78.89％，同样的，MSTN2基因在dsM2组和dsM1/2组中的表达量分别显著降低了65.31％和71.99％。值得注意的是，dsM1组中未见MSTN2基因表达量显著降低，dsM2组中也未见MSTN1基因显著下调。定量结果分析可知，细菌介导的dsRNA对侏儒蛤的两个MSTN基因的转录具有高效且特异性的抑制作用。

在干扰30天后，对侏儒蛤肌肉中MSTN基因的表达量同样进行了检测，如图4所示，与对照组相比，MSTN1基因在dsM1组和dsM1/2组中的表达量分别显著降低了72.83％和68.39％；同样的，MSTN2基因在dsM2组和dsM1/2组中的表达量分别显著降低了52.58％和40.22％。实验结果表明。通过饲喂法进行的RNA干扰可以持续且特异性的沉默目的基因的表达。

(5)侏儒蛤表型性状检测：

在持续干扰过程中观察各组侏儒蛤的表型变化，待对照组与各干扰组出现显著的表型变化时，使用游标卡尺对各组侏儒蛤进行表型性状测定，使用电子天平对全湿重、壳加肉重以及壳重进行称量，通过计算获得侏儒蛤的软体重及肌肉重。

如图5所示，在持续干扰15天后，实验组与对照组侏儒蛤出现了显著的表型差异，各组侏儒蛤生长性状的统计结果显示MSTN基因沉默后促进了侏儒蛤的生长。无论是单基因干扰组还是共同干扰组，侏儒蛤在壳长、壳宽、壳高、全湿重、软体中以及肌肉重等6个生长性状中均与对照组存在显著的差异。如图6所示，与对照组相比，dsM1组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了8.63％、7.42％、9.09％、27.30％、20.40％、38.50％；dsM2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了9.89％、9.04％、10.52％、33.42％、26.25％、41.96％；dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了17.27％、16.01％、19.62％、55.75％、51.60％、69.23％。以上结果表明侏儒蛤MSTN1和MSTN2基因均具有抑制组织甚至个体生长的功能。值得注意的是，三个实验组与对照组的表型性状比较中，肌肉差异是最大的，表明侏儒蛤的MSTN基因与肌肉生长相关，是影响贝类生长的负调控因子。不仅如此，与dsM1组相比，dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了7.95％、7.99％、9.65％、22.32％、25.91％、22.22％；与dsM2组相比，dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了6.71％、6.38％、8.23％、16.74％、20.07％、19.21％，这表明侏儒蛤中两个MSTN基因负调控生长的作用是叠加的。

在持续干扰30天后，实验组与对照组侏儒蛤之间仍存在显著的表型差异(图7)。如图8所示，单基因干扰组和双基因干扰组侏儒蛤的6个生长性状仍然与对照组存在显著差异。与对照组相比，dsM1组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了15.57％、14.50％、18.30％、51.38％、47.12％、64.50％；dsM2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了17.13％、16.59％、20.18％、61.32％、61.88％、109.21％；dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了21.45％、19.96％、27.23％、71.57％、75.42％、121.20％。同样的，与dsM1组相比，dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳高、壳宽、全湿重、软体重、肌肉重分别显著增加了5.09％、4.49％、7.54％、13.07％、19.24％、34.45％；与dsM2组相比，dsM1/2组侏儒蛤的平均壳长、壳宽分别显著增加了3.69％、5.86％，其他四个生长性状虽然也有差异，但并不显著。该结果表明，MSTN2基因抑制侏儒蛤生长的作用更强一些。

本发明利用大肠杆菌表达的生长抑制素(MSTN)特异性dsRNA持续饲喂侏儒蛤，通过对目的基因进行表达量检测，MSTN1和MSTN2基因在干扰的第15天和第30天均在肌肉组织中检测到表达量的下降，表明饲喂表达dsRNA的细菌可以显著抑制侏儒蛤MSTN基因的表达。通过表型性状测定，发现MSTN1和MSTN2基因各自被干扰后促进了侏儒蛤的生长，而且两个基因共同干扰后促进生长的程度显著高于单基因干扰组(dsM1和dsM2组)。因此，本发明提供了一种促进双壳贝类生长速度的方法，即通过饲喂dsRNA沉默MSTN基因从而促进侏儒蛤组织以及壳的生长。

Claims (7)

1.一种提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，该方法基于RNA干扰来抑制侏儒蛤中MSTN1和MSTN2两个基因的表达；该方法包括下述步骤：

（1）筛查侏儒蛤中的MSTN基因，得到MSTN1和MSTN2两个基因序列，并选择MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段，所述RNA干扰片段如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；

（2）分别设计MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段的干扰引物；

（3）对MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段进行扩增及测序验证；

（4）构建RNA干扰质粒；

（5）诱导表达dsRNA；

（6）通过饲喂法进行侏儒蛤MSTN基因的RNA干扰。

2.如权利要求1所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述步骤（1）中：将其他物种的MSTN的序列作为参考序列比对侏儒蛤的基因组，筛查得到侏儒蛤的两个MSTN基因，MSTN1和MSTN2基因；并选择MSTN1和MSTN2的RNA干扰片段，所述RNA干扰片段如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

3.如权利要求2所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述MSTN1基因的全长为18,769 bp，由三个外显子组成，其中ORF全长1,425 bp，编码蛋白长度为474个氨基酸；所述MSTN2基因全长8,461bp，由五个外显子组成，其中ORF全长1,362 bp，编码453个氨基酸。

4.如权利要求1所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，利用高保真酶扩增MSTN1和MSTN2基因的干扰片段，切胶进行纯化回收；再将干扰片段连接到blunt载体上，并转化到DH5α感受态细胞中；并通过挑取阳性克隆送测验证序列准确性。

5.如权利要求1所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，将测序合格的单克隆菌株进行质粒提取，随后将含目的基因片段的质粒和L4440质粒进行双酶切，随后利用DNA连接酶将目的基因干扰片段与L4440质粒进行连接；再转化到HT115（DE3）感受态细胞中。

6.如权利要求1所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，在L4440质粒载体上，目的基因插入片段两侧具有两个T7启动子，双向合成dsRNA；质粒上带有的Lac乳糖操纵子使得通过外源添加IPTG诱导dsRNA的产生；大肠杆菌HT115为 RNaseIII缺陷型菌株，所以诱导表达目的基因的dsRNA不会被降解掉。

7.如权利要求1所述的提高侏儒蛤生长速度的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，收集诱导dsRNA后的细菌与小球藻混合，对侏儒蛤进行投喂。