CN115927303A - TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用，通过设计编码序列外显子4序列，检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列，抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。本发明通过RNA测序，发现TBL1XR1基因在不同耗竭程度的T细胞中表达差异显著，并且TBL1XR1的表达伴随T细胞耗竭程度的升高而不断上调，TBL1XR1的表达水平与TIM‑3呈现高相关性，而与PD‑1的表达则呈现中度相关；本发明通过敲除TBL1XR1，下调了T细胞表面的PD‑1、TIM‑3和LAG‑3抑制性受体的表达，从而增强了T细胞的杀伤能力。

Description

TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用

技术领域

本发明涉及T细胞分子生物领域，具体涉及TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中约90％的原发性肝癌为肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)(Villanueva,A.,Hepatocellular Carcinoma.NEngl J Med,2019.380(15):p.1450-1462.)，其不仅在全球发病率位居第六位，还是全球第三位的癌症死因(Forner,A,et al.Hepatocellular carcinoma.Lancet,2018.391(10127):p.1301-1314.)。目前，仅10-25％早期HCC患者可以用手术切除、消融术和肝移植进行治疗，绝大多数的HCC患者被确诊时已经发展到中晚期，缺乏有效的治疗手段(Yang,J.D.,et al.,A global view of hepatocellular carcinoma:trends,risk,preventionand management.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2019.16(10):p.589-604.)。尽管现已有多重激酶抑制剂(索拉菲尼(Bruix,J,et al.,Adjuvant sorafenib forhepatocellular carcinoma after resection or ablation(STORM):a phase 3,randomised,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet Oncol,2015.16(13):p.1344-54.)、乐伐替尼(Kudo,M.,et al.,Lenvatinib versus sorafenib in first-linetreatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:a randomisedphase 3 non-inferiority trial.Lancet,2018.391(10126):p.1163-1173.)、瑞戈非尼(Bruix,J.,et al.,Regorafenib for patients with hepatocellular carcinoma whoprogressed on sorafenib treatment(RESORCE):a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial.Lancet,2017.389(10064):p.56-66.))和VEGFR2拮抗剂(雷莫芦单抗)(Zhu,A.X.,et al.,Ramucirumab after sorafenib in patients with advancedhepatocellular carcinoma and increased alpha-fetoprotein concentrations(REACH-2):a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial.LancetOncol,2019.20(2):p.282-296.)可以进行选择治疗，但其有效性却非常有限。近期，基于T细胞的嵌合性抗原受体-T(chimeric antigen receptor-T，CAR-T)细胞免疫疗法在临床试验中展现出可观的疗效(Shi,D.,et al.,Chimeric Antigen Receptor-Glypican-3 T-Cell Therapy for Advanced Hepatocellular Carcinoma:Results of Phase ITrials.Clin Cancer Res,2020.26(15):p.3979-3989.)，这提示着HCC是一种对免疫疗法敏感的肿瘤，因而免疫疗法有望成为治疗中晚期HCC的最有希望的手段。

但是在肿瘤微环境中，T细胞逐渐发生功能紊乱的现象，即T细胞耗竭(T cellexhaustion)(Blank,C.U.,et al.,Defining'T cell exhaustion'.Nat Rev Immunol,2019.19(11):p.665-674.)。耗竭的T细胞会在表面表达一系列的抑制性受体，如PD-1(programmed cell death-1)、TIM-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3)、LAG-3(lymphocyte-activation gene-3)，进而导致T细胞杀伤肿瘤细胞功能降低(Crespo,J.,et al.,Tcell anergy,exhaustion,senescence,andstemness in the tumor microenvironment.Curr Opin Immunol,2013.25(2):p.214-21.)。

T细胞耗竭根据T细胞表面PD-1的表达水平可分为：可逆性早期耗竭和不可逆性晚期耗竭(Wherry,E.J.and M.Kurachi,Molecular and cellular insights into T cellexhaustion.Nat Rev Immunol,2015.15(8):p.486-99.)。目前，可以通过阻断性抗体来封闭T细胞表面的抑制性受体，从而恢复早期耗竭T细胞的功能(Chong,E.A.,et al.,Pembrolizumab for B-cell lymphomas relapsing after or refractory to CD19-directed CAR T-cell therapy.Blood,2022.139(7):p.1026-1038.)。然而，很多肿瘤患者对于阻断性抗体并不敏感，这很可能是因为这种方法并不能逆转患者体内晚期耗竭T细胞的功能。因而，开发抑制T细胞向晚期耗竭状态发展的抗肿瘤药物，是目前抗肿瘤免疫急需解决的难题。

目前，通过对T细胞耗竭的机制研究已经发现了多个分子(如Blimp-1、NFAT、TOX等)可以调控T细胞的耗竭状态(Mackay,L.K.,et al.,Hobit and Blimp1 instruct auniversal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.Science,2016.352(6284):p.459-63.Martinez,G.J.,et al.,The transcription factor NFATpromotes exhaustion of activated CD8(+)T cells.Immunity,2015.42(2):p.265-278.Khan,O.,et al.,TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8(+)Tcell exhaustion.Nature,2019.571(7764):p.211-218.)，这提示着这些分子可以作为治疗靶点来逆转T细胞的耗竭。然而，对于T细胞耗竭的机制研究仍处于初步阶段，通过逆转T细胞耗竭状态来开发抗肿瘤免疫治疗方法充满了挑战和不确定性。

TBL1XR1基因位于人3号染色体上q26.32，全长7959bp，编码514个氨基酸，蛋白在细胞内表达，NCBI Gene ID号为79718。TBL1XR1基因在所有物种中保持高度相似性，在由核受体(nuclear receptors，NRs)和其他调节转录因子(transcription factors，TFs)介导的转录抑制作用中发挥重要作用(Yoon,H.G.,et al.,Purification and functionalcharacterization of the human N-CoR complex:the roles of HDAC3,TBL1 andTBLR1.EMBO J,2003.22(6):p.1336-46.Perissi,V.,et al.,A corepressor/coactivatorexchange complex required for transcriptional activation by nuclear receptorsand other regulated transcription factors.Cell,2004.116(4):p.511-26.)。有研究报道，TBL1XR1在原发性肺鳞状细胞癌(Liu,Y.,et al.,Identification of genesdifferentially expressed in human primary lung squamous cell carcinoma.LungCancer,2007.56(3):p.307-17.)、宫颈癌(Wang,J.,et al.,TBLR1 is a novelprognostic marker and promotes epithelial-mesenchymal transition in cervicalcancer.Br J Cancer,2014.111(1):p.112-24.)、鼻咽癌(Chen,S.P.,et al.,Transducinbeta-like 1X-linked receptor 1suppresses cisplatin sensitivity innasopharyngeal carcinoma via activation of NF-kappaB pathway.Mol Cancer,2014.13:p.195.)、食管鳞状细胞癌(Liu,L.,et al.,TBL1XR1 promoteslymphangiogenesis and lymphatic metastasis in esophageal squamous cellcarcinoma.Gut,2015.64(1):p.26-36.)、B淋巴细胞白血病中都异常表达(Venturutti,L.,et al.,TBL1XR1 Mutations Drive Extranodal Lymphoma by Inducing a Pro-tumorigenic Memory Fate.Cell,2020.182(2):p.297-316e27.)，比如基因易位、缺失、突变等，同时这些异常与晚期肿瘤分期、转移和预后都息息相关。但是，TBL1XR1基因在肝癌组织中与浸润T细胞的耗竭关系及其应用方式目前尚未见报道。因此，本领域亟待利用TBL1XR1基因作为靶点来开发基于T细胞的免疫治疗方法，从而逆转T细胞耗竭状态，进而提升T细胞功能来应用于HCC的治疗。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，通过分离出HCC肝癌组织样本中的T细胞，而后经过转录组表达谱分析发现TBL1XR1基因在调控T细胞耗竭中发挥关键作用，并针对该基因设计了gRNA用于逆转T细胞耗竭药物应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

TBL1XR1基因及其gRNA用于制备提升T细胞功能的药物。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

进一步地，设计编码序列外显子4序列，检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列，抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。

一种gRNA，所述gRNA的核苷酸序列选自：

1)如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5所示的任一种核苷酸序列；

2)将所述1)中的核苷酸经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和、或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。

上述gRNA用于敲除TBL1XR1基因。

一种CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除T细胞中TBL1XR1的方法，包括以下步骤：

1)TBL1XR1-gRNA的设计：根据NCBI Gene上TBL1XR1的基因序列，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，选取位于TBL1XR1基因外显子4的3个位点，设计3条gRNA序列；

2)RNP的制备：将CRISPR-Cas9蛋白和3条gRNA共同孵育，制备成RNP复合物；

3)电转：利用Lonza 4D-Nuclefector电转仪电转T细胞，用P3 Primary cell 4D-Nuclefector X Kit试剂盒将RNP复合物电转入T细胞中；

4)电转模式：activated human T cell。

本发明的有益效果是：相较于现有技术，本发明具有以下优点：

1)本发明首次发现TBL1XR1基因在调控T细胞耗竭中发挥关键作用；

2)本发明首次设计了TBL1XR1的gRNA序列，并成功地敲除了T细胞中的TBL1XR1基因，获得了特异性敲除TBL1XR1的耗竭的T细胞；

3)本发明首次证明了TBL1XR1基因敲除通过下调了T细胞表面的PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达，从而增强了T细胞的杀伤能力。

附图说明

图1寻找T耗竭相关基因的流程示意图；

图2 TBL1XR1基因在不同耗竭程度T细胞中的表达情况示意图；

图3 TBL1XR1基因与T细胞上抑制性受体的相关性示意图；

图4 TBL1XR1-gRNA设计示意图；

图5 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后的蛋白表达情况示意图；

图6 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后抑制性受体的表达情况示意图；

图7 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后对肿瘤细胞的杀伤能力的示意图。

具体实施方式

实施例1 TBL1XR1基因的筛选

1.1浸润性T细胞的获取

收集HCC患者的肿瘤组织，加入胶原酶后放入研磨器中研磨成单细胞。然后加入Precoll溶液进行密度梯度离心，吸取白色薄雾层，同时用PBS洗涤一遍，即分离得到了组织中的浸润性T淋巴细胞(图1)。利用流式细胞术，根据PD-1和TIM-3的表达水平程度，分选得到了非耗竭性T细胞(PD-1^-TIM-3^-)3例，早期耗竭性T细胞(PD-1^intTIM-3⁺)4例和晚期耗竭性细胞(PD-1^hiTIM-3⁺)3例。

1.2寻找耗竭T细胞中的高表达基因

利用高通量RNA测序，通过分析发现TBL1XR1基因在不同耗竭程度的T细胞中表达差异显著，并且TBL1XR1的表达伴随T细胞耗竭程度的升高而不断上调(图2)。

1.3分析TBL1XR1基因与T细胞耗竭相关抑制性受体的关系

对TBL1XR1在4例HCC患者各组T细胞中的表达丰度与各类T细胞耗竭相关因子的表达丰度进行相关性分析，Pearson相关系数计算结果显示，TBL1XR1的表达水平与TIM-3呈现高相关性，而与PD-1的表达则呈现中度相关(图3)。

实施例2 TBL1XR1基因的敲除

2.1外周血中PBMC的分离

收集健康人的外周血，将其和等量的PBS混合。取50mL的离心管，向离心管中加入Ficoll淋巴分离液，然后再将血液和PBS的混合液缓慢加入到离心管中，应注意不能破坏Ficoll淋巴液的液面。然后2000rpm离心10分钟，调整升速为9，降速为1。离心结束后，小心吸取中间白色分层，为PBMC。同时加入20mL的PBS缓冲液，继续离心300×g，8分钟。弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，再次离心300×g，8分钟。弃去上清后，用PBS缓冲液重悬沉淀，并且吸取10μL的0.1％台盼蓝和10μL的细胞悬液混合均匀后，进行计数。

2.2 AFP TCR细胞的转染

将HEK293T细胞接种在DMEM+10％FBS培养基中，待密度为70％左右时，按照Lipofectamine 3000 Transfection Reagent的说明书，将含有AFP TCR基因的病毒载体和辅助质粒加入到细胞中，6h后换液，同时48h后收取病毒液备用。

将分离好的PBMC和磁珠(Human T-activation anti-CD3/28 dynabeads)以1:1的比例在RPMI-1640+50IU/mL IL-2+10％FBS培养基中刺激72h。然后将AFP TCR的病毒液按照MOI为5加入到T细胞中，48h后用anti-mouse beta chain和anti-CD3抗体对感染后的T细胞进行染色，利用流式细胞术检测TCR的阳性率。

实验结果如图5B所示：在图5B中，isotype为同型对照，用于分析中作为空白对照。未感染的T细胞和感染后的T细胞的CD3阳性率均为90％以上，表明刺激后的PBMC绝大部分为T细胞。同时通过anti-mouse TCR beta chain抗体，可以发现只有AFP TCR感染后的T细胞呈现了30％左右的阳性率，表明T细胞转染成功。

2.3 Cas9蛋白：gRNA核糖核蛋白(RNP)的制备

根据NCBI gene上TBL1XR1的基因序列，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，根据TBL1XR1外显子4选取到了3个位点，从而设计出了3条gRNA的序列。

用NEB buffer 3.1溶解gRNA，然后与Cas9重组蛋白在室温下共孵育20分钟，形成RNP复合物用于后续实验。其中Cas9蛋白和gRNA的摩尔比例为1:1.5，同时3条gRNA之间的摩尔比也为1:1:1。

如图4所示，gRNA-1和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的反义链上，gRNA-2和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的反义链上，gRNA-3和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的正义链上。这表明，Cas9重组蛋白和3条gRNA的RNP会分别结合TBL1XR1基因的正反义链，从而对其进行剪切。

2.4电转敲除

取1.2×10⁶感染后的T细胞放于1.5mL的离心管中，离心300×g，8分钟。再次用PBS重悬，继续离心300×g，8分钟。然后用Lonza电穿孔缓冲液重悬T细胞，分别加入120pmolCas9蛋白(对照)和RNP复合物(实验组)至T细胞悬液中，反复吹打混匀后加入到电转杯中，用Lonza电穿孔仪进行电转。随后加入预热的培养基(RPMI-1640+50IU/mL IL-2+10％FBS)继续培养，维持T细胞密度为1.2×10⁶/mL。

实施例3 TBL1XR1敲除对于T细胞功能的影响

3.1 TBL1XR1敲除效率检测

分别收集相同数目的电转后对照组和实验组的T细胞，离心300×g，8分钟。然后加入PBS洗涤1次，离心300×g，8分钟。弃去PBS，加入细胞裂解液重悬后，冰上放置10分钟，然后放入预冷的离心机中，14000×g，10分钟，收集细胞裂解上清。上清中加入loadingbuffer，沸水浴5分钟，然后进行12％SDS-PAGE蛋白胶电泳。电泳结束后进行转膜，然后加入一抗anti-TBL1XR1和anti-βactin抗体过夜孵育。次日加入二抗孵育1h后，利用显色液进行显色，从而对比野生型和敲除后T细胞中TBL1XR1的表达情况。

如图5A所示，T细胞经过AFP TCR病毒感染后，再经过电转敲除TBL1XR1基因后，利用western blotting验证敲除效果。如图5C所示，NC代表对照野生型组，KO代表TBL1XR1基因敲除的实验组。结果表明野生型和TBL1XR1基因敲除后的T细胞的βactin表达相当，说明总体细胞数目和总蛋白量相差不大。但是TBL1XR1基因敲除后的T细胞表达的TBL1XR1蛋白较野生型有明显的下降，这说明利用RNP复合物电转的方式成功将T细胞中的TBL1XR1基因敲除。

3.2 TBL1XR1基因敲除后在T细胞表面抑制性受体的表达检测

分别收集电转后对照组和实验组的T细胞，离心300×g，8分钟。然后用PBS洗涤一次，离心300×g，8分钟。分别加入anti-CD3、anti-PD-1、anti-TIM-3和LAG-3，置于4℃冰箱避光孵育20分钟。用PBS洗涤两次后，利用流式细胞术检测TBL1XR1基因T细胞上敲除前后表面PD-1、TIM-3和LAG-3的表达情况。

如图6所示，TBL1XR1基因敲除后的T细胞表面的抑制性受体都较野生型组的表达降低。这表明，TBL1XR1基因调控着PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达，从而影响了T细胞耗竭的发生发展。

3.3 TBL1XR1基因敲除后对T细胞杀伤的影响

乳酸脱氢酶(LDH)在活细胞中无法穿过细胞膜，但当肿瘤细胞受到效应细胞的杀伤后，其细胞膜的通透性发生改变，导致LDH会释放到培养上清中，因而通过检测培养上清中的LDH可以获得T细胞对靶细胞的杀伤效应功能。

用RPMI-1640培养基分别将靶细胞密度调整成2×10⁵/mL，效应T细胞密度调整成2×10⁵/mL和4×10⁵/mL。将靶细胞和效应细胞按照效靶比为1:1和2:1加入到96孔圆底板中。同时设置靶细胞自发孔、效应细胞自发孔和靶细胞最大释放孔作为对照孔。24h后，收集上清，按照LDH试剂盒说明书，利用酶联检测仪检测在490nm波长下的OD值，并按照计算公式计算T细胞的杀伤功能。计算公式：杀伤率＝(实验孔-效应细胞自发孔-靶细胞自发孔)/(靶细胞最大裂解孔-靶细胞自发孔)。

如图7所示，TBL1XR1基因敲除后的T细胞较野生型组的T细胞在靶细胞存在的情况下，表现为更强的杀伤能力。这表明，TBL1XR1基因敲除通过下调了T细胞表面的PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达，从而增强了T细胞的杀伤能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，设计编码序列外显子4序列，检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列，抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。

3.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列选自：

1)如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5所示的任一种核苷酸序列；

2)将所述1)中的核苷酸经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和、或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的gRNA在敲除TBL1XR1基因中的应用。

5.CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除T细胞中TBL1XR1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)TBL1XR1-gRNA的设计：根据NCBI Gene上TBL1XR1的基因序列，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，选取位于TBL1XR1基因外显子4的3个位点，设计3条gRNA序列；

2)RNP的制备：将CRISPR-Cas9蛋白和3条gRNA共同孵育，制备成RNP复合物；

3)电转：利用Lonza 4D-Nuclefector电转仪电转T细胞，用P3 Primary cell 4D-Nuclefector X Kit试剂盒将RNP复合物电转入T细胞中；

4)电转模式：activated human T cell。

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