CN115927303A - TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用,通过设计编码序列外显子4序列,检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列,抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。本发明通过RNA测序,发现TBL1XR1基因在不同耗竭程度的T细胞中表达差异显著,并且TBL1XR1的表达伴随T细胞耗竭程度的升高而不断上调,TBL1XR1的表达水平与TIM‑3呈现高相关性,而与PD‑1的表达则呈现中度相关;本发明通过敲除TBL1XR1,下调了T细胞表面的PD‑1、TIM‑3和LAG‑3抑制性受体的表达,从而增强了T细胞的杀伤能力。
Description
技术领域
本发明涉及T细胞分子生物领域,具体涉及TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用。
背景技术
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其中约90%的原发性肝癌为肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(Villanueva,A.,Hepatocellular Carcinoma.NEngl J Med,2019.380(15):p.1450-1462.),其不仅在全球发病率位居第六位,还是全球第三位的癌症死因(Forner,A,et al.Hepatocellular carcinoma.Lancet,2018.391(10127):p.1301-1314.)。目前,仅10-25%早期HCC患者可以用手术切除、消融术和肝移植进行治疗,绝大多数的HCC患者被确诊时已经发展到中晚期,缺乏有效的治疗手段(Yang,J.D.,et al.,A global view of hepatocellular carcinoma:trends,risk,preventionand management.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2019.16(10):p.589-604.)。尽管现已有多重激酶抑制剂(索拉菲尼(Bruix,J,et al.,Adjuvant sorafenib forhepatocellular carcinoma after resection or ablation(STORM):a phase 3,randomised,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet Oncol,2015.16(13):p.1344-54.)、乐伐替尼(Kudo,M.,et al.,Lenvatinib versus sorafenib in first-linetreatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:a randomisedphase 3 non-inferiority trial.Lancet,2018.391(10126):p.1163-1173.)、瑞戈非尼(Bruix,J.,et al.,Regorafenib for patients with hepatocellular carcinoma whoprogressed on sorafenib treatment(RESORCE):a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial.Lancet,2017.389(10064):p.56-66.))和VEGFR2拮抗剂(雷莫芦单抗)(Zhu,A.X.,et al.,Ramucirumab after sorafenib in patients with advancedhepatocellular carcinoma and increased alpha-fetoprotein concentrations(REACH-2):a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial.LancetOncol,2019.20(2):p.282-296.)可以进行选择治疗,但其有效性却非常有限。近期,基于T细胞的嵌合性抗原受体-T(chimeric antigen receptor-T,CAR-T)细胞免疫疗法在临床试验中展现出可观的疗效(Shi,D.,et al.,Chimeric Antigen Receptor-Glypican-3 T-Cell Therapy for Advanced Hepatocellular Carcinoma:Results of Phase ITrials.Clin Cancer Res,2020.26(15):p.3979-3989.),这提示着HCC是一种对免疫疗法敏感的肿瘤,因而免疫疗法有望成为治疗中晚期HCC的最有希望的手段。
但是在肿瘤微环境中,T细胞逐渐发生功能紊乱的现象,即T细胞耗竭(T cellexhaustion)(Blank,C.U.,et al.,Defining'T cell exhaustion'.Nat Rev Immunol,2019.19(11):p.665-674.)。耗竭的T细胞会在表面表达一系列的抑制性受体,如PD-1(programmed cell death-1)、TIM-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3)、LAG-3(lymphocyte-activation gene-3),进而导致T细胞杀伤肿瘤细胞功能降低(Crespo,J.,et al.,Tcell anergy,exhaustion,senescence,andstemness in the tumor microenvironment.Curr Opin Immunol,2013.25(2):p.214-21.)。
T细胞耗竭根据T细胞表面PD-1的表达水平可分为:可逆性早期耗竭和不可逆性晚期耗竭(Wherry,E.J.and M.Kurachi,Molecular and cellular insights into T cellexhaustion.Nat Rev Immunol,2015.15(8):p.486-99.)。目前,可以通过阻断性抗体来封闭T细胞表面的抑制性受体,从而恢复早期耗竭T细胞的功能(Chong,E.A.,et al.,Pembrolizumab for B-cell lymphomas relapsing after or refractory to CD19-directed CAR T-cell therapy.Blood,2022.139(7):p.1026-1038.)。然而,很多肿瘤患者对于阻断性抗体并不敏感,这很可能是因为这种方法并不能逆转患者体内晚期耗竭T细胞的功能。因而,开发抑制T细胞向晚期耗竭状态发展的抗肿瘤药物,是目前抗肿瘤免疫急需解决的难题。
目前,通过对T细胞耗竭的机制研究已经发现了多个分子(如Blimp-1、NFAT、TOX等)可以调控T细胞的耗竭状态(Mackay,L.K.,et al.,Hobit and Blimp1 instruct auniversal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.Science,2016.352(6284):p.459-63.Martinez,G.J.,et al.,The transcription factor NFATpromotes exhaustion of activated CD8(+)T cells.Immunity,2015.42(2):p.265-278.Khan,O.,et al.,TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8(+)Tcell exhaustion.Nature,2019.571(7764):p.211-218.),这提示着这些分子可以作为治疗靶点来逆转T细胞的耗竭。然而,对于T细胞耗竭的机制研究仍处于初步阶段,通过逆转T细胞耗竭状态来开发抗肿瘤免疫治疗方法充满了挑战和不确定性。
TBL1XR1基因位于人3号染色体上q26.32,全长7959bp,编码514个氨基酸,蛋白在细胞内表达,NCBI Gene ID号为79718。TBL1XR1基因在所有物种中保持高度相似性,在由核受体(nuclear receptors,NRs)和其他调节转录因子(transcription factors,TFs)介导的转录抑制作用中发挥重要作用(Yoon,H.G.,et al.,Purification and functionalcharacterization of the human N-CoR complex:the roles of HDAC3,TBL1 andTBLR1.EMBO J,2003.22(6):p.1336-46.Perissi,V.,et al.,A corepressor/coactivatorexchange complex required for transcriptional activation by nuclear receptorsand other regulated transcription factors.Cell,2004.116(4):p.511-26.)。有研究报道,TBL1XR1在原发性肺鳞状细胞癌(Liu,Y.,et al.,Identification of genesdifferentially expressed in human primary lung squamous cell carcinoma.LungCancer,2007.56(3):p.307-17.)、宫颈癌(Wang,J.,et al.,TBLR1 is a novelprognostic marker and promotes epithelial-mesenchymal transition in cervicalcancer.Br J Cancer,2014.111(1):p.112-24.)、鼻咽癌(Chen,S.P.,et al.,Transducinbeta-like 1X-linked receptor 1suppresses cisplatin sensitivity innasopharyngeal carcinoma via activation of NF-kappaB pathway.Mol Cancer,2014.13:p.195.)、食管鳞状细胞癌(Liu,L.,et al.,TBL1XR1 promoteslymphangiogenesis and lymphatic metastasis in esophageal squamous cellcarcinoma.Gut,2015.64(1):p.26-36.)、B淋巴细胞白血病中都异常表达(Venturutti,L.,et al.,TBL1XR1 Mutations Drive Extranodal Lymphoma by Inducing a Pro-tumorigenic Memory Fate.Cell,2020.182(2):p.297-316e27.),比如基因易位、缺失、突变等,同时这些异常与晚期肿瘤分期、转移和预后都息息相关。但是,TBL1XR1基因在肝癌组织中与浸润T细胞的耗竭关系及其应用方式目前尚未见报道。因此,本领域亟待利用TBL1XR1基因作为靶点来开发基于T细胞的免疫治疗方法,从而逆转T细胞耗竭状态,进而提升T细胞功能来应用于HCC的治疗。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足,通过分离出HCC肝癌组织样本中的T细胞,而后经过转录组表达谱分析发现TBL1XR1基因在调控T细胞耗竭中发挥关键作用,并针对该基因设计了gRNA用于逆转T细胞耗竭药物应用。为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
TBL1XR1基因及其gRNA用于制备提升T细胞功能的药物。
为优化上述技术方案,采取的具体措施还包括:
进一步地,设计编码序列外显子4序列,检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列,抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。
一种gRNA,所述gRNA的核苷酸序列选自:
1)如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.5所示的任一种核苷酸序列;
2)将所述1)中的核苷酸经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和、或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
上述gRNA用于敲除TBL1XR1基因。
一种CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除T细胞中TBL1XR1的方法,包括以下步骤:
1)TBL1XR1-gRNA的设计:根据NCBI Gene上TBL1XR1的基因序列,结合CRISPR/Cas9基因编辑原理,选取位于TBL1XR1基因外显子4的3个位点,设计3条gRNA序列;
2)RNP的制备:将CRISPR-Cas9蛋白和3条gRNA共同孵育,制备成RNP复合物;
3)电转:利用Lonza 4D-Nuclefector电转仪电转T细胞,用P3 Primary cell 4D-Nuclefector X Kit试剂盒将RNP复合物电转入T细胞中;
4)电转模式:activated human T cell。
本发明的有益效果是:相较于现有技术,本发明具有以下优点:
1)本发明首次发现TBL1XR1基因在调控T细胞耗竭中发挥关键作用;
2)本发明首次设计了TBL1XR1的gRNA序列,并成功地敲除了T细胞中的TBL1XR1基因,获得了特异性敲除TBL1XR1的耗竭的T细胞;
3)本发明首次证明了TBL1XR1基因敲除通过下调了T细胞表面的PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达,从而增强了T细胞的杀伤能力。
附图说明
图1寻找T耗竭相关基因的流程示意图;
图2 TBL1XR1基因在不同耗竭程度T细胞中的表达情况示意图;
图3 TBL1XR1基因与T细胞上抑制性受体的相关性示意图;
图4 TBL1XR1-gRNA设计示意图;
图5 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后的蛋白表达情况示意图;
图6 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后抑制性受体的表达情况示意图;
图7 TBL1XR1基因在T细胞中敲除前后对肿瘤细胞的杀伤能力的示意图。
具体实施方式
实施例1 TBL1XR1基因的筛选
1.1浸润性T细胞的获取
收集HCC患者的肿瘤组织,加入胶原酶后放入研磨器中研磨成单细胞。然后加入Precoll溶液进行密度梯度离心,吸取白色薄雾层,同时用PBS洗涤一遍,即分离得到了组织中的浸润性T淋巴细胞(图1)。利用流式细胞术,根据PD-1和TIM-3的表达水平程度,分选得到了非耗竭性T细胞(PD-1-TIM-3-)3例,早期耗竭性T细胞(PD-1intTIM-3+)4例和晚期耗竭性细胞(PD-1hiTIM-3+)3例。
1.2寻找耗竭T细胞中的高表达基因
利用高通量RNA测序,通过分析发现TBL1XR1基因在不同耗竭程度的T细胞中表达差异显著,并且TBL1XR1的表达伴随T细胞耗竭程度的升高而不断上调(图2)。
1.3分析TBL1XR1基因与T细胞耗竭相关抑制性受体的关系
对TBL1XR1在4例HCC患者各组T细胞中的表达丰度与各类T细胞耗竭相关因子的表达丰度进行相关性分析,Pearson相关系数计算结果显示,TBL1XR1的表达水平与TIM-3呈现高相关性,而与PD-1的表达则呈现中度相关(图3)。
实施例2 TBL1XR1基因的敲除
2.1外周血中PBMC的分离
收集健康人的外周血,将其和等量的PBS混合。取50mL的离心管,向离心管中加入Ficoll淋巴分离液,然后再将血液和PBS的混合液缓慢加入到离心管中,应注意不能破坏Ficoll淋巴液的液面。然后2000rpm离心10分钟,调整升速为9,降速为1。离心结束后,小心吸取中间白色分层,为PBMC。同时加入20mL的PBS缓冲液,继续离心300×g,8分钟。弃去上清,用PBS缓冲液重悬沉淀,再次离心300×g,8分钟。弃去上清后,用PBS缓冲液重悬沉淀,并且吸取10μL的0.1%台盼蓝和10μL的细胞悬液混合均匀后,进行计数。
2.2 AFP TCR细胞的转染
将HEK293T细胞接种在DMEM+10%FBS培养基中,待密度为70%左右时,按照Lipofectamine 3000 Transfection Reagent的说明书,将含有AFP TCR基因的病毒载体和辅助质粒加入到细胞中,6h后换液,同时48h后收取病毒液备用。
将分离好的PBMC和磁珠(Human T-activation anti-CD3/28 dynabeads)以1:1的比例在RPMI-1640+50IU/mL IL-2+10%FBS培养基中刺激72h。然后将AFP TCR的病毒液按照MOI为5加入到T细胞中,48h后用anti-mouse beta chain和anti-CD3抗体对感染后的T细胞进行染色,利用流式细胞术检测TCR的阳性率。
实验结果如图5B所示:在图5B中,isotype为同型对照,用于分析中作为空白对照。未感染的T细胞和感染后的T细胞的CD3阳性率均为90%以上,表明刺激后的PBMC绝大部分为T细胞。同时通过anti-mouse TCR beta chain抗体,可以发现只有AFP TCR感染后的T细胞呈现了30%左右的阳性率,表明T细胞转染成功。
2.3 Cas9蛋白:gRNA核糖核蛋白(RNP)的制备
根据NCBI gene上TBL1XR1的基因序列,结合CRISPR/Cas9基因编辑原理,根据TBL1XR1外显子4选取到了3个位点,从而设计出了3条gRNA的序列。
用NEB buffer 3.1溶解gRNA,然后与Cas9重组蛋白在室温下共孵育20分钟,形成RNP复合物用于后续实验。其中Cas9蛋白和gRNA的摩尔比例为1:1.5,同时3条gRNA之间的摩尔比也为1:1:1。
如图4所示,gRNA-1和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的反义链上,gRNA-2和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的反义链上,gRNA-3和Cas9形成的RNP复合物会结合到TBL1XR1基因的正义链上。这表明,Cas9重组蛋白和3条gRNA的RNP会分别结合TBL1XR1基因的正反义链,从而对其进行剪切。
2.4电转敲除
取1.2×106感染后的T细胞放于1.5mL的离心管中,离心300×g,8分钟。再次用PBS重悬,继续离心300×g,8分钟。然后用Lonza电穿孔缓冲液重悬T细胞,分别加入120pmolCas9蛋白(对照)和RNP复合物(实验组)至T细胞悬液中,反复吹打混匀后加入到电转杯中,用Lonza电穿孔仪进行电转。随后加入预热的培养基(RPMI-1640+50IU/mL IL-2+10%FBS)继续培养,维持T细胞密度为1.2×106/mL。
实施例3 TBL1XR1敲除对于T细胞功能的影响
3.1 TBL1XR1敲除效率检测
分别收集相同数目的电转后对照组和实验组的T细胞,离心300×g,8分钟。然后加入PBS洗涤1次,离心300×g,8分钟。弃去PBS,加入细胞裂解液重悬后,冰上放置10分钟,然后放入预冷的离心机中,14000×g,10分钟,收集细胞裂解上清。上清中加入loadingbuffer,沸水浴5分钟,然后进行12%SDS-PAGE蛋白胶电泳。电泳结束后进行转膜,然后加入一抗anti-TBL1XR1和anti-βactin抗体过夜孵育。次日加入二抗孵育1h后,利用显色液进行显色,从而对比野生型和敲除后T细胞中TBL1XR1的表达情况。
如图5A所示,T细胞经过AFP TCR病毒感染后,再经过电转敲除TBL1XR1基因后,利用western blotting验证敲除效果。如图5C所示,NC代表对照野生型组,KO代表TBL1XR1基因敲除的实验组。结果表明野生型和TBL1XR1基因敲除后的T细胞的βactin表达相当,说明总体细胞数目和总蛋白量相差不大。但是TBL1XR1基因敲除后的T细胞表达的TBL1XR1蛋白较野生型有明显的下降,这说明利用RNP复合物电转的方式成功将T细胞中的TBL1XR1基因敲除。
3.2 TBL1XR1基因敲除后在T细胞表面抑制性受体的表达检测
分别收集电转后对照组和实验组的T细胞,离心300×g,8分钟。然后用PBS洗涤一次,离心300×g,8分钟。分别加入anti-CD3、anti-PD-1、anti-TIM-3和LAG-3,置于4℃冰箱避光孵育20分钟。用PBS洗涤两次后,利用流式细胞术检测TBL1XR1基因T细胞上敲除前后表面PD-1、TIM-3和LAG-3的表达情况。
如图6所示,TBL1XR1基因敲除后的T细胞表面的抑制性受体都较野生型组的表达降低。这表明,TBL1XR1基因调控着PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达,从而影响了T细胞耗竭的发生发展。
3.3 TBL1XR1基因敲除后对T细胞杀伤的影响
乳酸脱氢酶(LDH)在活细胞中无法穿过细胞膜,但当肿瘤细胞受到效应细胞的杀伤后,其细胞膜的通透性发生改变,导致LDH会释放到培养上清中,因而通过检测培养上清中的LDH可以获得T细胞对靶细胞的杀伤效应功能。
用RPMI-1640培养基分别将靶细胞密度调整成2×105/mL,效应T细胞密度调整成2×105/mL和4×105/mL。将靶细胞和效应细胞按照效靶比为1:1和2:1加入到96孔圆底板中。同时设置靶细胞自发孔、效应细胞自发孔和靶细胞最大释放孔作为对照孔。24h后,收集上清,按照LDH试剂盒说明书,利用酶联检测仪检测在490nm波长下的OD值,并按照计算公式计算T细胞的杀伤功能。计算公式:杀伤率=(实验孔-效应细胞自发孔-靶细胞自发孔)/(靶细胞最大裂解孔-靶细胞自发孔)。
如图7所示,TBL1XR1基因敲除后的T细胞较野生型组的T细胞在靶细胞存在的情况下,表现为更强的杀伤能力。这表明,TBL1XR1基因敲除通过下调了T细胞表面的PD-1、TIM-3和LAG-3抑制性受体的表达,从而增强了T细胞的杀伤能力。
以上仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.TBL1XR1基因及其gRNA在制备提升T细胞功能药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,设计编码序列外显子4序列,检测引导Cas9蛋白特异性剪切TBL1XR1编码序列,抑制TBL1XR1表达的3个gRNA序列。
3.一种gRNA,其特征在于,所述gRNA的核苷酸序列选自:
1)如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.5所示的任一种核苷酸序列;
2)将所述1)中的核苷酸经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和、或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的gRNA在敲除TBL1XR1基因中的应用。
5.CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除T细胞中TBL1XR1的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)TBL1XR1-gRNA的设计:根据NCBI Gene上TBL1XR1的基因序列,结合CRISPR/Cas9基因编辑原理,选取位于TBL1XR1基因外显子4的3个位点,设计3条gRNA序列;
2)RNP的制备:将CRISPR-Cas9蛋白和3条gRNA共同孵育,制备成RNP复合物;
3)电转:利用Lonza 4D-Nuclefector电转仪电转T细胞,用P3 Primary cell 4D-Nuclefector X Kit试剂盒将RNP复合物电转入T细胞中;
4)电转模式:activated human T cell。
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