CN115920040A - 用于治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的靶点及小分子化合物 - Google Patents

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刘京
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王昱凯
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Abstract

本发明提供了与神经退行性病变或中枢神经系统损伤有关的特异性基因，其可以提供用于预防或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的一种或多种症状或病理表征的治疗性靶点，以及用于评估疗效的标志物。本发明还提供了针对上述治疗性靶点的小分子化合物，以及这些小分子化合物用于预防或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的一种或多种症状或病理表征的用途。

Description

用于治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的靶点及小分子化合物
技术领域
本发明涉及疾病治疗领域。具体而言，本发明提供了与神经退行性病变或中枢神经系统损伤有关的特异性基因，其可以提供用于预防或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的一种或多种症状或病理表征的治疗性靶点，以及用于评估疗效的标志物。本发明还提供了针对上述治疗性靶点的小分子化合物，以及这些小分子化合物用于预防或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的一种或多种症状或病理表征的用途。
背景技术
神经退行性疾病通常可以表征为中枢神经系统中神经元的缓慢进行性丧失，这通常会致使由受影响的中枢神经系统区域执行的特定大脑功能(例如记忆、运动、认知)不足。这些神经退行性疾病包括，例如，阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病和多系统萎缩症。神经退行性疾病通常会延伸十年以上，并且神经退变的实际发作可能比临床表现早很多年。创伤性脑损伤(traumaticbrain injury,TBI)也可能导致神经退行性病变。TBI通常起源于原发性损伤，与脑部受到的外部打击直接有关，进而逐步发展为继发性损伤。继发性发病机制包括分子、化学及炎症级联反应，涉及兴奋性神经递质的释放，可导致暂时性或永久性神经功能缺损。
阿尔茨海默氏病(AD)是最为常见的神经退行性疾病，又被称为老年痴呆症。它导致大脑中神经细胞逐步受损死亡，造成患者的认知能力和其它大脑功能下降。其发病率随年龄上升而迅速增加。患者首先会出现记忆方面的缺陷，随着症状恶化，他们逐渐丧失生活自理能力，给自身和家人都带来沉重的压力。随着人均寿命延长，社会老龄化程度加剧，AD造成的社会负担可能会更加严重。
虽然世界各地的研究者在对AD进行广泛的研究，但AD背后的机制尚未完全阐明。开发AD药物对于全世界的研究者来说一直是个严峻的挑战。1998年至2017年间，开发AD药物的146次尝试都失败了，只有4 种药物成功获批用于该疾病，成功与失败的比例为1:37。而那些成功药物的效果也并不尽如人意，它们只能减轻症状而不能根治疾病，并且目前用于减缓AD进展的药物也并不特别有效。
面对大多数药物相继研发失败的现状，亟需发明出一种新的能够治疗或者延缓神经退行性疾病(例如阿尔兹海默症)或中枢神经系统损伤病情的药物，来突破神经退行性疾病(例如阿尔兹海默症)或中枢神经系统损伤的治疗困境。
发明内容
本申请的本发明人通过深入的研究，发现了神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的治疗性靶点，并进一步得到了一类针对上述靶点的小分子化合物，其能够改善神经退行性疾病(例如阿兹海默病)所导致的认知功能障碍、共济失调、神经病变、蛋白聚集体形成等症状并且改善中枢神经系统损伤所导致的运动、认知和/或感觉障碍等症状，由此提供了下述发明。
治疗性靶点
在第一方面，本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者施用能够调节Tmem119基因的表达或者调节Tmem119基因产物的活性的试剂 (在本文中，也可简称为Tmem119表达/活性调节剂)。本发明还提供了能够调节Tmem119基因的表达或者调节Tmem119基因产物的活性的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病的至少一种症状或病理表征选自认知功能障碍、共济失调、神经退变(例如神经元死亡)和/或蛋白聚集体形成(例如，淀粉样蛋白β(Aβ)沉积)。
在某些实施方案中，所述药物能够改善神经退行性疾病的至少一种症状或病理表征，例如改善认知功能(例如改善注意力、学习和/或记忆功能缺陷)、改善运动功能、减轻神经病变(例如神经元死亡)和/或减少蛋白聚集体数量(例如减少脑内淀粉样蛋白β(Aβ)的沉积和/或tau蛋白相关的神经原纤维缠结)。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病以选自下列的一种或多种为表征：认知功能障碍、共济失调、神经退变(例如神经元死亡)和/或蛋白聚集体形成(例如，淀粉样蛋白β(Aβ)沉积)。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病的神经退变位点存在于中枢神经系统中。在某些实施方案中，所述神经退行性疾病的神经退变位点存在于外周神经系统中。在某些实施方案中，所述神经退行性疾病的神经退变位点存在于外周神经系统和中枢神经系统中。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病、多系统萎缩症、路易氏痴呆、额颞叶痴呆、血管性痴呆、创伤后神经退行性疾病。
在某些实施方案中，所述中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征选自运动、感觉和/或认知障碍。在某些实施方案中，所述药物能够改善中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征，例如运动、感觉和/或认知障碍。
在某些实施方案中，所述中枢神经系统损伤是创伤性中枢神经系统损伤。在某些实施方案中，所述中枢神经系统损伤选自创伤性脑损伤、脑卒中或脊髓损伤。
在某些实施方案中，所述创伤性脑损伤的至少一种症状或病理表征选自神经炎症(例如促炎因子表达上调和/或抑炎因子表达下调)、头晕、头痛、意识丧失、意识模糊、认知功能障碍、共济失调和/或神经退变(例如神经元死亡)。
在某些实施方案中，所述药物能够改善创伤性脑损伤的至少一种症状或病理表征，例如抑制神经炎症(例如抑制促炎因子如IL6、IL-1β、TFN-α的表达，促进抑炎因子如IL10、CD206、Arg1的表达)、改善头晕、头痛、意识丧失和/或意识模糊、改善认知功能(例如改善注意力、学习和/ 或记忆功能缺陷)、改善运动功能和/或减轻神经病变(例如神经元死亡)。
在某些实施方案中，所述创伤性脑损伤以选自下列的一种或多种为表征：神经炎症(例如促炎因子表达上调和/或抑炎因子表达下调)、头晕、头痛、意识丧失、意识模糊、认知功能障碍、共济失调、神经退变(例如神经元死亡)和/或突触相关蛋白(例如PSD95和/或Synaptophysin)的减少。
在某些实施方案中，所述药物能够改善脊髓损伤的至少一种症状或病理表征，例如改善在损伤的相应节段出现的运动、感觉和/或括约肌功能障碍、肌张力异常。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在本文中，Tmem119基因可以是人源的，也可以是来自其它物种(例如，非人哺乳动物、鱼、爬行动物或鸟，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、灵长类、斑马鱼等)的同源基因。鉴定同源基因的方法是本领域技术人员已知的，例如可以通过HomoloGene鉴定。在某些实施方案中，所述同源基因是指直系同源基因 (orthologousgene)。直系同源基因作为物种形成的伴随事件而被重复，并继续保持相同功能的基因。
Tmem119基因的序列及其蛋白产物的序列是本领域技术人员已知的，例如可参见NCBI登录号：Gene ID:338773；Ensembl:ENSG00000183160。
在本文中，“基因表达”指基因所含信息转化成基因产物的过程。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义 RNA、核酶、结构RNA、shRNA、RNAi、miRNA或任何其它类型的RNA) 或由mRNA翻译产生的蛋白。基因产物还包括经过修饰的RNA和经过修饰的蛋白，RNA修饰过程如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑，蛋白修饰过程如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化。基因表达的“调节”指基因活性的改变，表达的调节可包括但不限于基因激活和基因阻遏。
在某些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂选自多肽、蛋白、核酸、寡核苷酸、低分子量化学化合物或其任意组合。
在某些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂是激活剂，其能够激活或上调Tmem119基因的表达、和/或活化或增强Tmem119基因的蛋白产物的活性。
在某些实施方案中，所述激活剂可以通过任何机制发挥其激活作用，例如通过在RNA或蛋白质水平上激活基因的表达(例如，增强基因的转录，和/或，增强该基因的mRNA产物的翻译)。
在某些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂通过激活 Tmem119基因的表达水平来增强其生物学功能。在此类实施方案中，表达水平的测定可以在核酸水平或蛋白水平实施。在核酸水平测定表达的方法包括但不限于Northern印迹、PCR、RT-PCR或实时(real)RT-PCR。在蛋白水平测定表达的方法包括但不限于Western印迹或聚丙烯酰胺凝胶电泳联合蛋白染色技术如考马斯亮蓝或银染、质谱、ELISA、免疫荧光等。
在一些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂选自 Tmem119基因的蛋白产物或其活性片段，或者编码所述蛋白产物或其活性片段的核酸分子或包含所述核酸分子的载体(例如克隆载体或表达载体)。在该语境下，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如 SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
在另一些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂包括低分子量化学化合物或小分子化合物。在本文中，表述“低分子量化学化合物”或“小分子化合物”是指有机的非蛋白质化合物。在某些实施方案中，所述小分子化合物的分子量不大于1500Da。该小分子化合物能够结合并增强上述基因或其表达产物的功能。可以通过筛选现有的小分子化合物库(例如，Chem Bridge、Chem Div、Inter Bio Screen、Life Chemicals、Specs 或Vitas-m)，并使用如上所述的方法测定化合物对上述基因表达水平的激活活性，来获得所述小分子化合物。
在某些实施方案中，所述低分子量化学化合物选自式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物：
Figure BDA0003737757380000061
其中：
环A是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被R1和R2基团取代；在某些优选方案中，环A是苯基；
X为羟基、C1-C6烷氧基或氨基；
R1位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)，并且R1选自C1-C6烷基(例如C1-C4烷基，C1-C2烷基)、C1-C6烷氧基(例如C1-C4烷氧基，C1-C2烷氧基)、或-C(O)R3；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如 1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、 C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)；
R3选自C1-C6烷基(例如C1-C4烷基，C1-C2烷基)、C1-C6烷氧基(例如C1-C4烷氧基，C1-C2烷氧基)、羟基、氨基或
Figure BDA0003737757380000071
所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、 C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)；其中，
环B是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被Ra基团、Rb基团和Rc基团取代；其中，
Ra为-Ar或-L-Ar；
L为C1-C6亚烷基(例如C1-C4亚烷基，C1-C2亚烷基)、O、C(O)、 S、S(O)、S(O)2；
Ar为Ar1或Ar2-Ar3，其中，Ar1、Ar2、Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个 (例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br 或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、 C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)；
Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)；
R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C6烷基(例如C1-C4烷基，C1-C2烷基)、C1-C6卤代烷基(例如 C1-C4卤代烷基，C1-C2卤代烷基)、C1-C6烷氧基(例如C1-C4烷氧基， C1-C2烷氧基)、C1-C6卤代烷氧基(例如C1-C4卤代烷氧基，C1-C2卤代烷氧基)、C1-C6烷硫基(例如C1-C4烷硫基，C1-C2烷硫基)、C1-C6烷基氨基(例如C1-C4烷基氨基，C1-C2烷基氨基)、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3- 基或吡啶-4-基。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(I)所示的结构，其中，R1选自 C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)或C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、 C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、 C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，R1选自C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)或C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br 或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)。优选地，R1选自甲基，乙基，正丙基或异丙基，正丁基、仲丁基或叔丁基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2 或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ia)所示的结构：
Figure BDA0003737757380000091
其中，环A、X、R2、R3如前定义，并且环A中，-C(O)R3位于-C(O)X 的邻位或对位(例如邻位)。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ia)所示的结构，其中，R3选自C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、羟基或氨基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3 个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如 C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基 (例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，R3选自C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、羟基或氨基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)。优选地，R3选自甲基，乙基，正丙基或异丙基，正丁基、仲丁基或叔丁基，羟基，或氨基，其中所述各脂肪族基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ib)所示的结构：
Figure BDA0003737757380000092
          
Figure BDA0003737757380000101
其中，环A、X、R2、环B、Ra、Rb、Rc如前定义，并且环A中，-C(O)NH- 位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ib)所示的结构，其中，环B 中，Ra为-Ar1或-L-Ar1，Ar1选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、 C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、 C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，Ar1未被取代或被卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)取代。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ib)所示的结构，其中，环B 中，Ra为-Ar2-Ar3或-L-Ar2-Ar3，Ar2和Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2- 基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、 C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，Ar2和Ar3各自独立地为取代或未取代的苯基，所述取代的苯基被一个或几个(例如1、2或3 个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，Ar2和Ar3各自独立地为未取代或卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)取代的苯基。
在某些实施方案中，在式(Ib)所示的结构中，L为亚甲基、亚乙基或氧原子。
在某些实施方案中，在式(Ib)所示的结构中，环B中，Ra位于-NH-的对位或间位。优选地，Ra位于-NH-的对位。
在某些实施方案中，在式(Ib)所示的结构中，环B中，Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)。优选地，Rb、 Rc各自独立地选自氢、甲基或乙基。优选地，Rb、Rc相同。优选地，Rb、 Rc均为氢或甲基。
在某些实施方案中，在式(I)、式(Ia)或式(Ib)所示的结构中，X为羟基、 C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)或氨基。在某些实施方案中，X为羟基，甲氧基，乙氧基，或氨基。
在某些实施方案中，在式(I)、式(Ia)或式(Ib)所示的结构中，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基 (例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基。优选地，R2为氢、苯基、吡啶-2- 基、吡啶-3-基或吡啶-4-基。优选地，R2为氢或苯基，例如氢。
在某些实施方案中，在式(I)、式(Ia)或式(Ib)所示的结构中，当环A为苯基时，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C6烷基(例如C1-C4烷基，C1-C2烷基)、C1-C6卤代烷基(例如 C1-C4卤代烷基，C1-C2卤代烷基)、C1-C6烷氧基(例如C1-C4烷氧基， C1-C2烷氧基)、C1-C6卤代烷氧基(例如C1-C4卤代烷氧基，C1-C2卤代烷氧基)、C1-C6烷硫基(例如C1-C4烷硫基，C1-C2烷硫基)、C1-C6烷基氨基(例如C1-C4烷基氨基，C1-C2烷基氨基)、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3- 基或吡啶-4-基。优选地，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基 (例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、C1-C4烷硫基(例如C1-C2烷硫基)、 C1-C4烷基氨基(例如C1-C2烷基氨基)、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基。优选地，R2为氢、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基。优选地，R2为氢或苯基，例如氢。
在某些实施方案中，在式(I)、式(Ia)或式(Ib)所示的结构中，当环A为吡啶基时，R2为氢。
在某些实施方案中，在式(I)、式(Ia)或式(Ib)所示的结构中，环A中， R2位于-C(O)X的对位或间位。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(I)的结构，
Figure BDA0003737757380000121
其中：
环A是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被R1和R2基团取代；在某些优选方案中，环A是苯基；
X为羟基、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)或氨基；
R1位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)，并且R1选自C1-C4烷基 (例如C1-C2烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、或-C(O)R3；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；
R3选自C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、羟基、氨基或
Figure BDA0003737757380000122
所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、 -Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；其中，
环B是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被Ra基团、Rb基团和Rc基团取代；其中，
Ra为-Ar或-L-Ar；优选地，环B中，Ra位于-NH-的对位或间位，例如对位；
L为C1-C4亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)、O、C(O)、S、S(O)、S(O)2；
Ar为Ar1或Ar2-Ar3，其中，Ar1、Ar2、Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个 (例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br 或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；优选地，Ar2、Ar3各自独立地为取代或未取代的苯基；
Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；
R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、苯基、吡啶-2- 基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；优选地，环A中，R2位于-C(O)X的对位或间位；优选地，当环A为苯基时，R2选自上述基团，当环A为吡啶基时， R2为氢。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ia)的结构，
Figure BDA0003737757380000141
其中：
环A是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被R2基团取代；在某些优选方案中，环A是苯基；
X为羟基、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)或氨基；
-C(O)R3位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)，并且R3选自C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、羟基、氨基或
Figure BDA0003737757380000142
所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2 或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；其中，
环B是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被Ra基团、Rb基团和Rc基团取代；其中，
Ra为-Ar或-L-Ar；优选地，环B中，Ra位于-NH-的对位或间位，例如对位；
L为C1-C4亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)、O、C(O)、S、S(O)、S(O)2；
Ar为Ar1或Ar2-Ar3，其中，Ar1、Ar2、Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br 或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；优选地，Ar2、Ar3各自独立地为取代或未取代的苯基；
Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；
R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、苯基、吡啶-2- 基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；优选地，环A中，R2位于-C(O)X的对位或间位；优选地，当环A为苯基时，R2选自上述基团，当环A为吡啶基时， R2为氢。
在某些实施方案中，所述化合物具有式(Ib)的结构，
Figure BDA0003737757380000151
其中：
环A是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被R2基团取代；在某些优选方案中，环A是苯基；
X为羟基、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)或氨基；
-C(O)NH-位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)；
环B是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被Ra基团、Rb基团和Rc基团取代；其中，
Ra为-Ar或-L-Ar；优选地，环B中，Ra位于-NH-的对位或间位，例如对位；
L为C1-C4亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)、O、C(O)、S、S(O)、S(O)2；
Ar为Ar1或Ar2-Ar3，其中，Ar1、Ar2、Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个 (例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br 或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；优选地，Ar2、Ar3各自独立地为取代或未取代的苯基；
Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)；
R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基(例如C1-C2烷基)、C1-C4卤代烷基(例如C1-C2卤代烷基)、C1-C4烷氧基(例如C1-C2烷氧基)、C1-C4卤代烷氧基(例如C1-C2卤代烷氧基)、苯基、吡啶-2- 基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；优选地，环A中，R2位于-C(O)X的对位或间位(例如间位)；优选地，当环A为苯基时，R2选自上述基团，当环A 为吡啶基时，R2为氢。
在某些实施方案中，所述化合物具有上述式(Ib)的结构，环A中 -C(O)NH-位于-C(O)X的邻位，环B中Ra位于-NH-的对位；环A是苯基，环B是苯基，Ra为-苯基或-L-苯基；其他基团如上实施方案中定义。
在某些示例性实施方案中，所述化合物选自表1中的化合物：
Figure BDA0003737757380000161
表1.
Figure BDA0003737757380000162
Figure BDA0003737757380000171
Figure BDA0003737757380000181
Figure BDA0003737757380000191
Figure BDA0003737757380000201
在某些实施方案中，所述低分子量化学化合物选自1-1或其药学上可接受的盐或酯、1-2或其药学上可接受的盐或酯、1-3或其药学上可接受的盐或酯、1-4或其药学上可接受的盐或酯、1-5或其药学上可接受的盐或酯、 1-6或其药学上可接受的盐或酯、1-7或其药学上可接受的盐或酯、1-8或其药学上可接受的盐或酯、1-9或其药学上可接受的盐或酯、1-10或其药学上可接受的盐或酯、1-11或其药学上可接受的盐或酯、1-12或其药学上可接受的盐或酯、1-13或其药学上可接受的盐或酯、1-14或其药学上可接受的盐或酯、1-15或其药学上可接受的盐或酯、1-16或其药学上可接受的盐或酯、1-17或其药学上可接受的盐或酯、1-18或其药学上可接受的盐或酯、1-19或其药学上可接受的盐或酯、1-20或其药学上可接受的盐或酯、 1-21或其药学上可接受的盐或酯、1-22或其药学上可接受的盐或酯、1-23 或其药学上可接受的盐或酯、1-24或其药学上可接受的盐或酯、1-25或其药学上可接受的盐或酯和1-26或其药学上可接受的盐或酯、1-27或其药学上可接受的盐或酯、1-28或其药学上可接受的盐或酯、1-29或其药学上可接受的盐或酯、1-30或其药学上可接受的盐或酯、1-31或其药学上可接受的盐或酯、1-32或其药学上可接受的盐或酯、1-33或其药学上可接受的盐或酯、1-34或其药学上可接受的盐或酯、1-35或其药学上可接受的盐或酯、 1-36或其药学上可接受的盐或酯、1-37或其药学上可接受的盐或酯、1-38 或其药学上可接受的盐或酯、1-39或其药学上可接受的盐或酯、1-40或其药学上可接受的盐或酯、1-41或其药学上可接受的盐或酯、1-42或其药学上可接受的盐或酯、1-43或其药学上可接受的盐或酯、1-44或其药学上可接受的盐或酯、1-45或其药学上可接受的盐或酯、1-46或其药学上可接受的盐或酯、1-47或其药学上可接受的盐或酯。
在某些实施方案中，所述低分子量化学化合物选自1-4或其药学上可接受的盐或酯、1-11或其药学上可接受的盐或酯、1-15或其药学上可接受的盐或酯、1-29或其药学上可接受的盐或酯、1-31或其药学上可接受的盐或酯、1-32或其药学上可接受的盐或酯、1-33或其药学上可接受的盐或酯、 1-34或其药学上可接受的盐或酯、1-35或其药学上可接受的盐或酯、1-36 或其药学上可接受的盐或酯、1-37或其药学上可接受的盐或酯、1-38或其药学上可接受的盐或酯、1-40或其药学上可接受的盐或酯、1-41或其药学上可接受的盐或酯、1-42或其药学上可接受的盐或酯、1-43或其药学上可接受的盐或酯、1-44或其药学上可接受的盐或酯、1-45或其药学上可接受的盐或酯。
在某些实施方案中，所述低分子量化学化合物选自1-2或其药学上可接受的盐或酯、1-3或其药学上可接受的盐或酯、1-4或其药学上可接受的盐或酯、1-5或其药学上可接受的盐或酯、1-40或其药学上可接受的盐或酯。
在某些实施方案中，所述低分子量化学化合物选自1-40或其药学上可接受的盐或酯。
本文所述的Tmem119表达/活性调节剂(例如，式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)可以为医学领域已知的任何形式，例如可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)、吸入剂、喷雾剂等形式。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
在某些实施方案中，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂(例如，式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)，可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。
本文所述的Tmem119表达/活性调节剂(例如，式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)，可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、直肠、肠胃外或局部给药。
一种示例性施用途径是口服给药。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等。除活性化合物以外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、醋酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服给药的液体剂型也可包括助剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂等。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、颗粒剂等。除活性成分以外，固体剂型可含有药学上可接受的惰性赋形剂或载体，例如填充剂(如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、半乳糖、交联聚维酮和硫酸钙)；粘合剂(如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)；湿润剂(如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)；崩解剂(如琼胶、碳酸钙、淀粉、褐藻酸、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠)；润滑剂(如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)；及其混合物。
本文所述的Tmem119表达/活性调节剂(例如，式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)也可通过非口服途径给药。
因此，另一种示例性的施用途径是肠胃外给药，例如，皮下注射、静脉注射、腹膜内注射、肌肉注射、胸骨内注射和注入。用于肠道外给药的剂型可以为注射制剂，包括注射液、注射用无菌粉末或注射用浓溶液。除活性成分以外，注射剂型可含有药学上可接受的载体例如无菌水、林格氏液和等渗氯化钠溶液，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。
另一种示例性的施用途径是局部给药，例如经皮给药(如通过经皮贴剂或离子电渗装置给药)、眼内给药或者鼻内或吸入给药。用于经皮给药的剂型可以为局部凝胶剂、喷雾剂、软膏剂和霜剂。除活性成分以外，局部剂型可含有能够提高该活性化合物通过皮肤或其它作用区域的吸收或渗透的成分。当本文所述的Tmem119表达/活性调节剂(例如，式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)通过经皮装置给药时，给药将使用存储和多孔膜类型或者固体基质品种的贴剂完成。用于眼部局部给药的剂型可以为滴眼剂，其中所述Tmem119表达/活性调节剂被溶于或者悬浮于适宜的载体中。对于鼻内给药或吸入给药来说，本文所述的Tmem119表达/活性调节剂以溶液剂或悬浮剂的形式从压力喷雾容器中被方便地递送，所述传递是通过患者压握或者泵送而进行的，或者是作为气溶胶喷雾剂制剂从压力容器或喷雾器中使用适宜的抛射剂而传递的。
另一种示例性的施用途径是直肠给药。用于直肠给药的剂型可以为栓剂。
此外，还可以使用药学领域已知的其它载体材料和给药方式。包含本文所述的Tmem119表达/活性调节剂的药物组合物可以通过任何公知的制药工艺制备，例如有效的制剂和给药方法。关于有效制剂和给药方法的上述考虑因素是本领域中公知的，并且描述于标准教科书中。药物的制剂描述在，例如，Hoover，John E.，Remington′s PharmaceuticalSciences.Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania，1975；Liberman等人编辑，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Kibbe等人编辑，Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版)， American PharmaceuticalAssociation，Washington，1999。
药物的筛选方法
本发明所提供的治疗性靶点还可以用于筛选预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的药物。
因此，在第二方面，本发明涉及筛选用于预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征的候选药物的方法，其包括筛选能够调节Tmem119 基因的表达或者调节Tmem119基因产物的活性的试剂的步骤。在某些实施方案中，所述筛选步骤在体外进行。
在某些实施方案中，所述试剂是激活剂，能够激活或上调所述基因的表达、和/或活化或增强所述基因的蛋白产物的活性。
在某些实施方案中，所述筛选步骤包括：
(1)在受试试剂存在的情况下，测定Tmem119基因在能够表达该基因的细胞中的表达水平；
(2)将步骤(1)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的所述基因的表达水平进行比较；
其中，如果步骤(1)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比升高，表明所述受试试剂是该基因的激活剂，并且是用于预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征的候选药物。
在某些实施方案中，所述筛选步骤包括：
(1)使受试试剂与能够表达Tmem119基因的细胞接触；
(2)测定所述基因的表达水平；
(3)将步骤(2)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的所述基因的表达水平进行比较；
(4)选择具有增强或激活所述基因表达的能力的受试试剂；
其中，所筛选获得的受试试剂可用于预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病(neurodegenerative disease)”、“神经退行性障碍(neurodegenerative disorder)”和“神经退行性病症(neurodegenerativecondition)”可互换使用，其是指影响神经元的任何疾病、障碍和/或病症，被影响的所述神经元诸如大脑的神经元和/ 或与神经细胞的退变(degeneration)或丧失相关联的神经系统的神经元。通常，神经退行性疾病可导致神经细胞的进行性退变(progressivedegeneration)和/或死亡。一般而言，神经退变是神经元的结构或功能的进行性丧失，包括神经元死亡。神经退行性疾病可造成运动问题(称为共济失调(ataxia))或者精神或认知功能问题(称为痴呆(dementia))。此类神经退行性疾病的实例包括例如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病、多系统萎缩症、路易氏痴呆、额颞叶痴呆、血管性痴呆、创伤后神经退行性疾病。
如本文中所使用的，术语“创伤性脑损伤(TBI)”是指由物理外力或创伤对脑部造成的伤害，例如因外部机械力诸如快速加速或减速、冲击、冲击波或弹丸穿透而造成的脑损伤。
如本文中所使用的，术语“脊髓损伤(SCI)”是指脊髓任何部分或椎管末端神经(马尾)的损伤，通常会导致损伤部位以下的力量、感觉和其他身体功能发生变化，包括各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等的相应改变。
如本文中所使用的，术语“认知功能障碍”包括短暂或长期的发生的的各类注意力、学习和记忆功能的缺陷。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。如本文中所使用的，关于治疗的“改善”意指至少一种症状相对于不存在治疗时相同症状的改善。在某些实施方案中，改善为症状的严重性或频率减小或者症状的严重性或频率的发作延迟或进展减缓。在某些实施方案中，这些症状的改善导致认知功能(例如改善注意力、学习和/ 或记忆功能缺陷)改善、运动功能改善、神经退变(例如神经元死亡)减少和/或蛋白聚集体数量(例如减少脑内淀粉样蛋白β(Aβ)的沉积和/或tau蛋白相关的神经原纤维缠结)减少。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有或怀疑患有神经退行性疾病或中枢神经系统损伤。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：崩解剂、粘合剂、表面活性剂、助流剂、润滑剂、pH 调节剂、离子强度增强剂、维持渗透压的试剂、延迟吸收的试剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、矫味剂、防腐剂、味道掩蔽剂等。例如，崩解剂的非限制性实例包括淀粉羟乙酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基-取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶凝化淀粉和藻酸钠。粘合剂的非限制性实例包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然与合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶凝化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。稀释剂的非限制性实例包括乳糖(一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水等)、甘露糖醇、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙二水合物。表面活性剂的非限制性实例包括月桂基硫酸钠和聚山梨醇酯80。助流剂的非限制性实例包括二氧化硅和滑石。润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂基富马酸钠以及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。pH调节剂的非限制性实例包括但不磷酸盐缓冲液。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2- 苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。
如本文中所使用的，术语“C1-C4烷基”是指含有1-4个碳原子的直链或支链烷烃去掉一个氢原子后得到的基团，包括例如“C1-C2烷基”、“C1-C3烷基”、“C2-C3烷基”、“C2-C4烷基”、“C3-C4烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。在某些优选的实施方案中，所述C1-C4烷基为C1-C2烷基，例如甲基或乙基。
如本文中所使用的，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文中所使用的，术语“烷氧基”是指，以烷基-O-方式形成的基团。
如本文中所使用的，术语“烷氨基”是指，以烷基-NH-方式形成的基团。
如本文中所使用的，术语“烷硫基”是指，以烷基-S-方式形成的基团。
如本文中所使用的，“卤代”是指被卤素原子取代，所述卤素原子选自氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。在某些优选的实施方案中，所述卤素原子为氟原子或氯原子。
如本文中所使用的，“C1-C4卤代烷基”指一个或多个(例如2个、3个或4个)卤素原子取代C1-C4烷基上的一个或多个(例如2个、3个或4个) 氢原子所衍生的基团，所述卤素原子和C1-C4烷基如前文所定义。在某些优选的实施方案中，所述C1-C4卤代烷基为卤代甲基或卤代乙基。在某些优选的实施方案中，所述C1-C4卤代烷基为氟代C1-C4烷基。所述氟代C1-C4烷基是指一个或多个(例如2个、3个或4个)氟原子取代C1-C4烷基上的一个或多个(例如2个、3个或4个)氢原子所衍生的基团。在某些优选的实施方案中，所述氟代C1-C4烷基为氟代C1-C2烷基。在某些优选的实施方案中，所述卤代C1-C4烷基为单卤代C1-C4烷基、二卤代C1-C4烷基或三卤代C1-C4烷基。本发明所述的“单卤代C1-C4烷基”、“二卤代C1-C4烷基”、“三卤代C1-C4烷基”分别指1个、2个或3个“卤素原子”取代“C1-C4烷基”上的1个、2个或3个氢原子所衍生的基团。
如本文中所使用的，术语“被取代”是指基团上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基所取代，所述“多个取代基”之间可以相同或不同。
如本文中所使用的，术语“C5-C6芳基”是指，含有5-6个环成员的芳香族基团，具体的实例包括但不限于苯基等。
如本文中所使用的，术语“C5-C6杂芳基”是指，含有5-6个环成员的芳基，且其环结构中含有选自N、O、S和P的杂原子，具体的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基等。
如本文中所使用的，术语“邻位”是指包括两个或更多个碳原子的基团上的取代基的位置，其中取代基与相邻碳原子连接。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指，(i)本发明所提供的化合物中存在的酸性官能团(例如-COOH)与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，并且包括但不限于，碱金属盐，如钠盐、钾盐、锂盐等；碱土金属盐，如钙盐、镁盐等；其他金属盐，如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；无机碱盐，如铵盐；有机碱盐，如叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐。以及，(ii)本发明所提供的化合物中存在的碱性官能团(例如-NH2)与适当的无机或者有机阴离子(酸) 形成的盐，并且包括但不限于，氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对苯磺酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；氨基酸盐，如甘氨酸盐、三甲基甘氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的酯”是指，本发明所提供的化合物中存在的-COOH与适当的醇形成的酯，或者本发明所提供的化合物中存在的-OH与适当的酸(例如，羧酸或含氧无机酸)形成的酯。适宜的酯基团包括但不限于，甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯、乙基琥珀酸酯、硬脂肪酸酯或棕榈酸酯。酯在酸或者碱存在的条件下，可以发生水解反应生成相应的酸或醇。
如本文中所使用的，术语“溶剂合物”是指本发明化合物与溶剂分子缔合形成的物质。所述溶剂可以是有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等)，例如本发明化合物可以与乙醇形成乙醇化物。本发明化合物还可以与水形成水合物。
如本文中所使用的，术语“晶型”是指物质的晶体结构。物质在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间键合方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构。本发明化合物可以一种晶体结构存在，也可以多种晶体结构存在，即具有“多晶型”。本发明化合物可以不同的晶型存在。
如本文中所使用的，术语“立体异构体”包括构象异构体和构型异构体，其中所述构型异构体主要包括顺反异构体和旋光异构体。本发明化合物可以以立体异构体的形式存在，并因此涵盖所有可能的立体异构体形式，及其任何组合或任何混合物。例如单一对映异构体，单一非对映异构体或以上的混合物。当本发明化合物含有烯烃双键时，除非特别说明，否则其包括顺式异构体和反式异构体，以及其任何组合。
如本文中所使用的，术语“前药”是指可在受试者体内通过例如氧化、还原、水解等反应转化成本发明的化合物。前药自身可或不可具有式(I)化合物的生物活性(例如，预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤)。例如，包括羟基或羧基的式(I)化合物可以酯的形式给药，其在体内水解转化成羟基化合物或羧基化合物。类似地，包括氨基的式(I)化合物发生酰化、烷基化或磷酸化，以形成例如二十烷酰基氨基(Eicosanoylamino)、丙氨酰氨基、新戊酰氧甲基氨基的化合物给药。关于前体药物使用的进一步信息可以参见Pro-drugs as Novel Delivery Systems，Vol.14，ACS Symposium Series(T Higuchi andW Stella)和Bioreversible Carriers in Drug Design，Pergamon Press，1987(ed.E BRoche，American Pharmaceutical Association)。根据本发明的一些前体药物实例包括：(i)若式(I)化合物含有羧酸官能团(-COOH)，则包括它的酯，例如用(C1-C8)烷基代替氢；(ii)若式(I)化合物含有醇官能团(-OH)，则包括它的醚，例如用 (C1-C6)烷酰氧基甲基代替氢；和(iii)若式(I)化合物含有伯或仲氨基官能团(-NH2或-NHR，其中R不为H)，则包括它的酰胺，例如用(C1-C10)烷酰基代替一个或两个氢。此外，某些式(I)化合物本身可以充当其他式(I)化合物的前体药物。
有益效果
本申请的本发明人创造性地发现了神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的治疗性靶点，并进一步得到了一类针对上述靶点的小分子化合物，其能够显著改善神经退行性疾病(例如阿兹海默病)所导致的神经炎症、认知功能障碍、共济失调、神经退变、蛋白聚集体形成等症状并且改善中枢神经系统损伤所导致的运动、感觉和/或认知障碍等症状，具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了Tmem119过表达细胞对Aβ40和Aβ42吞噬情况的ELISA 检测结果。
图2显示了Tmem119过表达细胞对荧光标记Aβ蛋白吞噬情况的免疫荧光检测结果。
图3显示了Tmem119过表达细胞中LAMP1表达量的免疫印迹分析结果。
图4显示了过表达Tmem119 5xFAD小鼠(5xFADTmem119OE)中Aβ斑块含量的westernblot检测结果。
图5显示了过表达Tmem119 5xFAD小鼠(5xFADTmem119OE)中Aβ斑块含量的免疫荧光染色结果。
图6显示了免疫染色结果显示，过表达Tmem119 5xFAD小鼠 (5xFADTmem119OE)中斑块及吞噬相关基因CD68的免疫荧光染色结果。
图7显示了过表达Tmem119 5xFAD小鼠(5xFADTmem119OE)的水迷宫检测结果。
图8显示了小分子化合物在体外激活Tmem119的荧光定量PCR和 Western blot检测结果。A:1-29；B：1-40。
图9显示了小分子化合物对小胶质细胞吞噬能力的影响的免疫荧光染色结果。
图10显示了小分子化合物在小鼠体内激活Tmem119的荧光定量PCR 和Westernblot检测结果。
图11显示了施用小分子化合物后小鼠大脑的皮层和海马组织中 Tmem119表达量的荧光定量PCR和Western blot检测结果。
图12显示了实施例4中5FAD小鼠的Y迷宫测试结果。
图13显示了实施例4中5FAD小鼠的水迷宫测试结果。
图14显示了实施例4中5FAD小鼠的巴恩斯迷宫检测结果。
图15显示了实施例4中5FAD小鼠中淀粉样沉淀含量的Western blot 检测结果。
图16显示了实施例4中5FAD小鼠中淀粉样沉淀含量的ELISA检测结果。
图17A-17B显示了实施例4中5FAD小鼠皮层和海马淀粉样斑块的沉积的免疫荧光染色照片以及统计结果。
图18显示了实施例4中5FAD小鼠中神经棘突的高尔基染色结果。
图19显示了实施例4中5FAD小鼠中神经核数量以及凋亡情况的免疫荧光染色结果。
图20显示了实施例5中5FAD小鼠的Y迷宫测试结果。
图21显示了实施例5中5FAD小鼠的水迷宫测试结果。
图22显示了实施例5中5FAD小鼠的巴恩斯迷宫检测结果。
图23显示了实施例5中5FAD小鼠皮层淀粉样斑块的沉积的免疫荧光染色结果。
图24显示了实施例5中5FAD小鼠神马淀粉样斑块的沉积的免疫荧光染色结果。
图25显示了实施例6中3Tg小鼠的Y迷宫测试结果。
图26显示了实施例6中3Tg小鼠的水迷宫测试结果。
图27显示了实施例6中3Tg小鼠的巴恩斯迷宫检测结果。
图28显示了实施例7中不同化合物对Tmem119基因的作用评价。
图29显示了实施例8中小分子化合物在穿刺伤海马创伤性脑损伤模型中对早期炎症反应的抑制活性评价。A qRT-PCR检测结果。B ELISA 检测。C Western Blot检测(左侧为蛋白凝胶电泳代表图，右侧为蛋白定量统计图)。β-actin为内参。每组3～4只小鼠；柱状图数据为平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图30显示了实施例9中小分子化合物在穿刺伤海马创伤性脑损伤模型中对神经元凋亡的抑制活性评价。A海马穿刺伤后第三天，海马组织的 TUNEL(红色)染色代表图；B海马齿状回区域的凋亡神经元数量统计；C海马穿刺伤后第三天，海马组织的FJC(红色)染色代表图；D海马齿状回区域的凋亡神经元数量统计。
图31显示了实施例10中小分子化合物在穿刺伤海马创伤性脑损伤模型中对突触相关蛋白过度减低的保护活性评价。A海马穿刺伤后第三天，海马组织的PSD95(绿色)及Synaptophysin(红色)染色代表图；B海马齿状回区域的PSD95及Synaptophysin荧光强度值统计；CWestern blot 检测海马穿刺伤后Caspase3、PSD95及Synaptophysin表达情况。GAPDH 为内参。每组3～4只小鼠；散点图表示平均值±标准误；*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
图32显示了实施例11中小分子化合物在穿刺伤海马创伤性脑损伤模型中对学习记忆能力的改善活性评价。A水迷宫实验的训练阶段首次找到平台所需时间。B水迷宫实验的测试阶段游泳速度。C水迷宫实验的测试阶段首次定位平台区的用时。D水迷宫实验的测试阶段穿越平台区的次数。E巴恩斯迷宫实验的训练阶段首次寻找到藏身盒的时间。F巴恩斯迷宫实验的测试阶段运动距离。G巴恩斯迷宫实验的测试阶段首次找到藏身盒位置的用时。H巴恩斯迷宫实验的测试阶段穿越藏身盒区的次数。每组9只小鼠；散点图统计数据为平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
图33显示了实施例12中小分子化合物在穿刺伤海马创伤性脑损伤模型中对p-Smad3与Tmem119的表达的影响。A Western blot检测 p-Smad2、p-Smad3、Smad4及Tmem119的表达情况。GAPDH为内参。B-C p-Smad3(绿色)免疫荧光染色的代表图及统计。每组3-4只小鼠；柱状图统计数据为平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图34显示了实施例13中脊髓损伤后8天内的BMS分数分析。Sham (假手术组，未造模)，SCI+1-40(药物治疗组，造模后口服药物)，SCI (对照组，仅造模)。
图35显示了实施例13中脊髓损伤5周后病理检测。GFAP代表星型胶质细胞，1-40代表喂小分子化合物1-40的小鼠。
序列信息
本申请涉及的序列的信息描述于下面的表2中。
表2
Figure BDA0003737757380000341
Figure BDA0003737757380000351
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：过表达Tmem119基因能够增强对Aβ的吞噬
1、实验用品：BV2小鼠小胶质细胞细胞系，HMO6小胶质细胞系， CD511B过表达载体，CD511B-U6敲降达载体。
2、实验方法：
(1)过表达和敲降细胞系的构建
BV2小鼠的小胶质细胞和HMO6人类小胶质细胞，种植在含有 DMEM/F12+10％FBS培养基的12孔板中。每隔24小时更换新鲜的培养基。当孔内细胞结合密度在80％左右时进行实验。
构建利用慢病毒感染两种细胞系，流式分选出Tmem119过表达细胞系(OE)，和表达降低的细胞系(SH)。具体流程如下：
CD511B-Tmem119-OE过表达质粒的构建
目的片段扩增及回收：为了构建CD511B-Tmem119-OE过表达质粒，我们首先在NCBI上查找Tmem119基因序列(ID:231633)，设计引物，每条引物组成依次为保护碱基、酶切位点、Kozak序列和目的基因序列，其中正向序列：5’-ATGGTTTCGGCGGCAGCCCCC-3’，反向序列：5’- TTAGACACTGGGGTGGACACTGCTGCAA-3’。以cDNA为模板进行 PCR扩增出目的条带。使用天根生物公司的DNA凝胶回收纯化试剂盒进行目的片段的回收，测定样品浓度后进行后续实验。
酶切：对于回收片段及CD511B载体进行限制性内切酶酶切(SwaI 和BamHI)，37℃反应4h。使用天根生物公司的DNA凝胶回收纯化试剂盒，纯化回收DNA。
连接：配置连接体系20μl，16℃进行连接反应过夜。
连接体系(20μl)
Figure BDA0003737757380000371
转化：取10μl连接产物加入500μl DH5α大肠杆菌感受态中，混匀，冰上放置30min。42℃热激90s，然后迅速将EP管置于冰上2min。随后加500μl不含氨苄的LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养45min。活化后将菌液3000rpm离心3min，弃上清，剩余100μl LB吹悬菌体，使用灭菌后的涂布棒均匀涂于氨苄抗性的琼脂平板上。37℃倒置培养 12-16h。
鉴定阳性克隆：挑取单克隆菌落过夜摇菌，用天根生物公司的小提质粒试剂盒提取质粒。取1μg质粒进行酶切(SwaI和BamHI)，将酶切产物进行琼脂糖电泳，观察产物条带大小，与阳性对照大小一致的即为阳性克隆。将阳性克隆质粒送测序，测序结果通过NCBI-BLAST进行序列比对。
目的基因shRNA质粒的载体构建
为了构建CD511B-U6-Tmem119-shRNA质粒，首先登陆Invitrogen 网站设计引物，选择针对CDS区的评分最高的2条设计核苷酸序列，分别是：第一条：正向引物： 5’-CTAGGCACTCCTACTTAGAACAAAGTCAAGAGCTTTGTTCTAA GTAGGAGTGCTTTTT-3’；反向引物： 5’-AATTAAAAAGCACTCCTACTTAGAACAAAGCTCTTGACTTTGTT CTAAGTAGGAGTGC-3’。第二条：正向引物：5’-CTAGGGAGTCAAATTTGTCCCAATGTCAAGAGCATTGGGACAA ATTTGACTCTTTTT-3’；反向引物：5’- AATTAAAAAGGAGTCAAATTTGTCCCAATGCTCTTGACATTGGGA CAAATTTGACTC--3’。其中5’端CTAG为EcoRI酶切位点，3’端AATT 为XbaI酶切位点；中间部分GCACTCCTACTTAGAACAAAG及GGAGTCAAATTTGTCCCAATG为网站设计的shRNA序列，TCAAGAG 为茎环结构，TTTTT为RNA聚合酶III的转录终止子。将引物进行退火，退火体系为50μl。取1L水煮沸后迅速倒于烧杯中，待温度降至95℃时，将退火体系放入烧杯中进行退火，待水温自然冷却至室温，退火即完成。退火体系(50μl)
Figure BDA0003737757380000381
载体酶切：对于CD511B-U6载体进行限制性酶切(EcoRI和XbaI)， 37℃反应4h。使用天根生物公司的DNA凝胶回收纯化试剂盒，纯化回收 DNA。
连接：配置连接体系20μl，16℃进行连接反应过夜。
连接体系(20μl)
Figure BDA0003737757380000382
转化：步骤同过表达质粒的构建。
鉴定阳性克隆：挑取单克隆、提取质粒，送公司测序。
慢病毒包装
复苏HEK-293T，并进行细胞传代。待293T细胞密度至60％-70％时，即可转染。取15ml离心管中加入1ml Opti-MEM(或者无血清DMEM) (Gbico)，依次加入目的质粒及病毒包装质粒(pMDL、REV、pVSVG)，轻轻混匀。加入PEI转染试剂，比例为1μg/3μl，轻轻混匀。室温孵育20 min，以获得转染试剂与质粒的复合物。将复合物缓缓加入293T细胞中，置于37℃培养箱继续培养。转染6h后，更换新鲜培养基。分别收取培养 48h及72h的培养基上清，即为病毒上清。
慢病毒浓缩
对于收集的病毒上清进行3000rpm离心15min，以去除细胞碎片。使用0.22μm滤器过滤病毒上清至超速离心管中，于4℃、19000rpm离心2h，得到病毒浓缩沉淀。弃上清，将离心管置入生物安全柜中待其完全烘干，加入适量PBS溶解病毒沉淀。取适量浓缩好的病毒感染目的细胞，一般感染48h后观察绿色荧光表达，以确定感染效率。同时可以收集细胞进行相关实验检测。将浓缩好的病毒液分装后冻存于-80℃冰箱。
细胞感染与流式分选
将浓缩病毒液感染培养板上的细胞，随后进行流式分选，利用FITC 光路分选出GFP阳性细胞候选。
(2)检测细胞对于Aβ的吞噬能力
用Tmem119-OE或Tmem119-shRNA以及空白对照感染BV2小胶质细胞72小时，然后用含100ng Aβ1-42(20276；Anaspec)或Aβ1-40(24236； Anaspec)的无血清DMEM补充培养基3小时。每组设6个平行孔。孵育 3小时后，从三个平行孔收集条件培养基，并使用人Aβ1-42ELISA试剂盒 (DAB142；R&D Systems)或人Aβ1-42ELISA试剂盒(DAB142；R&D Systems)评估Aβ1-42或Aβ1-40水平。对于剩余的平行孔，用无血清DMEM 代替培养基并再培养3小时以评估Aβ的降解。取细胞于添加蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA缓冲液中裂解，测定Aβ1-42或Aβ1-40水平。
用Lenti-NC或Tmem119-OE病毒感染原代小胶质细胞72小时，然后用1μg/ml Aβ1-42孵育24小时。按照制造商的方案，使用小鼠IL-6、IL-1β和TNFαELISA试剂盒(BOSTER)收集和分析条件培养基。这些实验重复3次。
3、实验结果：
ELISA检测培养上清中Aβ40和Aβ42含量的结果如图1所示，结果显示，Tmem119过表达细胞系上清中所剩下的Aβ明显降低。免疫荧光检测结果如图2所示，红色荧光标记的Aβ蛋白加入培养基4个小时后， Tmem119过表达细胞系能够吞噬的Aβ蛋白的量显著高于其他组。上述结果表明过表达Tmem119有助于增强细胞对Aβ的吞噬。
免疫印迹分析结果如图3所示，Tmem119过表达细胞系中溶酶体蛋白 LAMP1表达量提高，其能够更好的让Aβ降解。
以上结果表明，过表达Tmem119能够增强细胞对Aβ的吞噬，并促进 Aβ降解，从而减少Aβ沉积。
实施例2：过表达Tmem119基因能够改善小鼠认知与记忆
1、实验用品：Tmem119过表达5xFAD小鼠，Tmem119基因敲除5xFAD 小鼠。取C57/BL6背景小鼠为实验材料。将Tmem119-OE小鼠(南方模式生物定制),Tmem119-KO(南方模式生物定制)与5xFAD((B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax,34840-JAX))小鼠杂交以获得5xFADTmem119-OE过表达(Tmem119-OE)和5xFADTmem119-KO敲除小鼠(Tmem119-KO)。
Thioflavin S染料(Sigma Cat:T1892)。
一抗：rabbit polyclonal anti-Iba1(1:1000；019-19741；Wako),rabbitpolyclonal anti-Iba1(1:1000；019-19741；Wako),goat rabbit polyclonal anti-Iba1(1:500；ab5076；abcam),rabbit monoclonal anti-Tmem119(1:1000； ab209064；Abcam)。Human Amyloid beta(aa1-42)Quantikine ELISA Kit(DAB142,R&D),Human Amyloid beta(aa1-40)Quantikine ELISA Kit(DAB140,R&D)。
二抗：HRP标记的羊抗兔IgG(普利莱C1309),HRP标记的驴抗羊 IgG(普利莱C2212),Alexa Fluor 488Goat anti-Rabbit IgG(Thermo Fisher),Alexa Fluor 568Goatanti-Rabbit IgG(Thermo Fisher),Alexa Fluor 568Goat anti-Mouse IgG(ThermoFisher),Alexa Fluor 568Donkey anti-Goat IgG(Thermo Fisher).
2、实验方法：
(1)病理切片检测
待Tmem119过表达5xFAD小鼠，Tmem119基因敲除5xFAD小鼠8个月时候，小鼠大脑灌注切片，免疫荧光染色，抗体检测Aβ沉淀情况，小胶质细胞marker，吞噬能力情况。
(2)分子实验检测
待Tmem119过表达5xFAD小鼠，Tmem119基因敲除5xFAD小鼠8个月时候，取小鼠海马组织，提取蛋白进行Western Blot检测，看小鼠病理特征。
(3)行为学检测
待Tmem119过表达5xFAD小鼠，Tmem119基因敲除5xFAD小鼠8个月时候，对小鼠进行行为认知与记忆相关的学检测，包括水迷宫，巴恩斯迷宫，Y迷宫。
Morris水迷宫实验
水迷宫实验是被广泛采用地用于测试啮齿类动物空间学习记忆能力的经典实验方法。实验依次分为：获得性训练(Aquisition)和探查(Probe)两个过程。
a.小鼠handle
在实验前开始的连续3天内，每天固定时间(最好在试验开始的时间) 对每只小鼠进行handle，目的是让小鼠熟悉实验者，并建立“友好”关系，将小鼠置于手臂上，轻加抚摸，handle约3min即可。
b.获得性训练(Acquisition)
获得性训练通常持续5天，每天每只小鼠依次进行4次trial，每次trial 的起始位置为s、e、n、w、四个方位之一。
c.将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置如上表。记录动物找到水下平台的时间(s)。找到平台的判断原则为：小鼠停留在平台上的时间超过3s，若少于3s则不算。小鼠找到平台后让其在平台上继续停留30s。若小鼠停留在平台上一会儿如5s就离开，则引导小鼠到平台上，累计停留时间为30s 即可。若超过60s，小鼠依然未找到平台，则引导小鼠到平台，并让其在平台上停留30s，且找到平台时间记为60s。
d.每只动物依次完成4个起始位置的训练后，将动物移开，用纱布擦干水再放回鼠笼内。若动物多则可以按照每个trail将所有小鼠训练完，再开始下一个trail。
e.探查(Probe)：连续5天的获得性训练结束后的第二天，即第6天的同一时间，将平台撤除，进行持续60s的探查(probe)测试。
f.分析：采用smart软件进行分析。
巴恩斯(Barnes)迷宫实验
Barnes迷宫同水迷宫一样，被广泛用于检测啮齿类动物空间学习记忆能力。实验依次分为：获得性训练(Aquisition)和探查(Probe)两个过程。
a.小鼠handle
同水迷宫实验。
b.正式实验时，将实验室的门关闭锁上，门外贴上“No Enter”。将录像装置设置好，装置调试适当。
c.将小鼠从笼子取出放在方塑料盒中，操作者走到Brnes迷宫平台处，将盒子倾斜倒扣在平台中央。将方塑料盒撤去(停留8s)，操作者迅速撤离实验装置处。观察录像装置，录像5min。若小鼠在五分钟内没有找到目标盒，轻柔地将小鼠引导目标盒，停留2min。若小鼠在5min内进入目标盒，也让小鼠在目标盒停留2min。每只动物每天训练2次，每次5min。
d.重复实验4-7天。
e.探查：在获得性训练结束后第二天，在相同时间，将目标盒撤除，平台上面转盘旋转180度，测试5min。
Y迷宫实验
Y迷宫装置是由3个等长的黑色臂和一个中间区域组成，各臂互成120 度，臂长50cm，宽10cm，高20cm，支架高50cm。动物放入后，采用 Supermaze软件采集图像和分析数据。自主交替实验，每只大鼠从同一个臂即起始臂放入，连续自主交替8min，检测自主交替自主交替率。每只大鼠结束后放回笼子，再进行下一只实验时，用75％的酒精消除Y迷宫臂内的气味。交替率％＝交替次数/(总次数-2)％。
3、实验结果
Western Blot检测结果如图4所示，小鼠大脑切片的免疫荧光染色如图 5所示，结果显示，Tmem119过表达小鼠的Aβ斑块的含量和数量都显著降低，而Tmem119基因敲除鼠(5xFADTmem119-KO)结果相反。
吞噬能力的免疫染色结果如图6所示，过表达Tmem119 5xFAD小鼠 (5xFADTmem119OE)的吞噬相关的基因CD68表达量增高，且吞噬面积显著增加。而Tmem119基因敲除鼠(5xFADTmem119-KO)结果相反。
小鼠行为学结果如图7所示，水迷宫结果显示过表达Tmem119 5xFAD 小鼠(5xFADTmem119OE)无论是训练时间，还是测试中第一次到达平台是时间和穿越平台的次数都得到改善。基因敲除鼠(5xFADTmem119-KO)结果相反。
以上结果表明，过表达Tmem119有助于改善小鼠认知与记忆。
实施例3：小分子化合物能够激活Tmem119基因从而增强吞噬作用
1、实验用品：C57/B6小鼠小胶质细胞，小分子药物1-40(购买于MCE)，小分子药物1-29(购买于Selleck)，C57/B6小鼠(购买于北京斯贝福公司)。
2、实验方法：
(1)体外实验：
分离并培养C57/B6 P0小鼠的小胶质细胞，获得原代小胶质细胞。随后对原代小胶质细胞进行纯化，纯化包括：待细胞生长至10-14天时，用低倍显微镜观察细胞，发现细胞密度至100％，其中星形胶质细胞于皿底铺满一层，小胶质细胞在星形胶质细胞之上生长，视野中呈现透亮圆形。将培养皿置于水平摇床上进行震荡，吸取培养基至离心管中并进行离心，于管底观察到细胞沉淀，此即为纯化的小胶质细胞。弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，将细胞种至PDL包被过的6孔板或者24孔板玻片上。待细胞贴壁后直接用于后续实验。
培养基中加入不同浓度(2μM，5μM，10μM)的1-40或1-29。加药后 0h,12h,24h,48h取样检测相关指标，每个样品3个复孔。
培养基中加入不同浓度(2μM，5μM，10μM)的1-40或1-29。并且加入红色荧光标记的Aβ1-42(60480；Anaspec)。孵育三小时，进行细胞免疫荧光染色，检测细胞对于Aβ的吞噬能力，每个样品3个复孔。
(2)体内实验
C57/B6小鼠在2个月大时，每隔24h尾静脉注射100μM的1-40或100μM 的1-29。1周后和2周后分别取小鼠海马组织，提取蛋白进行Western Blot 检测，每个测试3只小鼠。
3、实验结果：
荧光定量PCR和Western blot检测Tmem119表达情况的结果如图8所示，结果显示，1-40B和1-29A均能够在体外激活tmem119。
小胶质细胞的吞噬能力的免疫荧光染色结果如图9所示，在培养基加入红色荧光标记的Aβ1-42 3小时后，1-40组细胞内含有红色的荧光强度明显增多，表明1-40能够增强对细胞aβ的吞噬。
尾静脉注射1-40后，小鼠体内tmem119的表达情况如图10所示，结果显示，1-40能够明显激活小鼠体内tmem119的表达。分别提取大脑的皮层和海马组织进行检测发现tmem119表达量提高，说明小分子药物能够穿过血脑屏障起作用(图11)。
实施例4：5FAD阿尔兹海默模型鼠发病初期使用小分子药物小分子化合物能够改善其病理表型及症状
1、实验材料：5xFAD*B6SJ-Tg AD模型小鼠：5xFAD(B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax,34840-JAX)，小分子药物1-40(购买于MCE)，小分子药物1-29(购买于Selleck)，C57/B6小鼠 (购买于北京斯贝福公司)。
2、实验方法：
将1-40按照20mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，将1-29按照10mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，5FAD小鼠2个月大的时候，开始将饲料换成含有小分子药物的的76-AIN饲料，对照组食用不含有药物的 76-AIN饲料。饲养过程中严格保证SPF的环境，保证小鼠自由进食，并且及时更换新鲜的鼠粮，保证药物不因在常温下失效。
小鼠7个月大时，进行Y迷宫，水迷宫，巴恩斯迷宫的行为学检测(每组10只以上，均为雄性小鼠)。行为学实验结束后，取一些小鼠进行病理检测(每组3-4只)。
3、实验结果：
5FAD小鼠的Y迷宫、水迷宫、巴恩斯迷宫的行为学检测结果分别如图 12、图13、图14所示，经发病前喂药1-40的5FAD小鼠的学习能力、空间记忆能力、恐惧记忆能力等明显提升，表明发病前施用1-40能够改善5FAD 小鼠认知与空间记忆。
5FAD小鼠中淀粉样沉淀含量的western blot和ELISA检测结果分别如图15-16所示，经发病前喂药，小分子药物1-40能够明显减少5FAD小鼠的淀粉样沉淀。5FAD小鼠中淀粉样斑块的沉积情况的免疫荧光染色结果如图 17A-17B所示，无论在海马还是皮层淀粉样沉淀形成的斑块均减少。以上结果表明发病前施用1-40能够改善淀粉样沉淀形成。
5FAD小鼠神经元的高尔基染色结果如图18所示，经发病前喂药1-40 后，5FAD小鼠的里马海里神经的密度相比较对照组有所改善。神经核凋亡免疫荧光染色结果如图19所示，经发病前喂药1-40后，5FAD小鼠的神经核凋亡明显减少。以上结果表明，发病前施用1-40能够保护5FAD小鼠的神经减少凋亡。
实施例5：5FAD阿尔兹海默模型鼠发病后使用小分子药物能够改善其病理表型及症状
1、实验材料：5xFAD*B6SJ-Tg AD模型小鼠：5xFAD(B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax,34840-JAX)，小分子药物1-40(购买于MCE)，小分子药物1-29(购买于Selleck)，C57/B6小鼠 (购买于北京斯贝福公司)。
2、实验方法：
将1-40按照20mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，将1-29按照 10mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，在5FAD小鼠5个月大的时候，开始将饲料换成含有小分子药物的的76-AIN饲料，对照组食用不含有药物的76-AIN饲料。饲养过程中严格保证SPF环境，保证小鼠自由进食，并且及时更换新鲜的鼠粮，保证药物不因在常温下失效。
小鼠9个月大时，进行Y迷宫，水迷宫，巴恩斯迷宫的行为学检测(每组10只以上，均为雄性小鼠)。行为学实验结束后，取小鼠进行病理检测(每组3-4只)。
3、实验结果：
发病后喂药的5FAD小鼠的Y迷宫、水迷宫、巴恩斯迷宫的行为学检测结果分别如图19、图20、图21所示，经发病后喂药1-40的5FAD小鼠的学习能力、空间记忆能力、恐惧记忆能力相比于对照组明显提升，表明发病后施用1-40能够改善5FAD小鼠认知与空间记忆。
发病后喂药的5FAD小鼠的海马以及皮层的淀粉样沉淀的免疫荧光染色结果分别如图23-24所示，无论在海马还是皮层淀粉样沉淀形成的斑块均减少。以上结果表明发病后施用1-40能够改善淀粉样沉淀形成。
实施例6：3Tg阿尔兹海默模型鼠使用小分子药物能够改善其病理表型及症状
1、实验材料：3xTg AD模型小鼠(C57BL/6J-congenic 3xTg-AD mouse line StockNo.033930)，小分子药物1-40(购买于MCE)，小分子药物1-29(购买于Selleck)，C57/B6小鼠(购买于北京斯贝福公司)。
2、实验方法：
将1-40按照20mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，将1-29按照 10mg/kg的浓度以76-AIN为底料制成鼠粮，3xTg小鼠2个月大的时候，开始将饲料换成含有小分子药物的的76-AIN饲料，对照组食用不含有药物的 76-AIN饲料。饲养过程中严格保证SPF环境，保证小鼠自由进食，并且及时更换新鲜的鼠粮，保证药物不因在常温下失效。
小鼠5个月大时，进行Y迷宫，水迷宫，巴恩斯迷宫的行为学检测(每组10只以上，均为雌性小鼠)。
3、实验结果：
3xTg小鼠的Y迷宫、水迷宫、巴恩斯迷宫的行为学检测结果分别如图 25、图26、图27所示，施用1-40的3xTg小鼠的学习能力、空间记忆能力、恐惧记忆能力相比于对照组明显提升，表明施用1-40能够改善3xTg小鼠认知与空间记忆。
实施例7：不同小分子化合物对Tmem119基因的作用评价
1、实验材料：BV2小胶质细胞，表1中的小分子化合物，1-2(Phthalic acid)购自sellcek(S6215)，1-3(Monomethyl phthalate)购自MEC (HY-Y1097)，1-4(o-Toluic acid)购自sellcek(S6217)，1-5(88-97-1) 购自sigma(P867386)，1-40(Kartogenin)购自MCE(HY-16268)。
2、实验方法：
将上述小分子化合物按照10μM的浓度加入BV2细胞培养基中，6小时后检测Tmem119的mRNA表达变化。
3、实验结果：
结果如图28所示，加入部分小分子化合物后Tmem119表达的升高，提示其具备增强aβ吞噬，改善阿尔兹海默病的潜力。
实施例8：1-40显著抑制穿刺伤海马组织的早期炎症反应
1、实验材料：C57BL6小鼠(购自北京斯贝福公司)，小鼠原代培养小胶质细胞，小分子药物1-40(购买于MCE)，白细胞介素-6(IL-6)ELISA 试剂盒(博迈德，EK0411)，白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(博迈德，EK0394)，肿瘤坏死因子(TNFα)ELISA试剂盒(博迈德，EK0527)，白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒(博迈德，EK0417)，脑立体定位仪 (KOPF，Model 940)。
2、实验方法：
将1-40按照20mg/kg的浓度与小鼠饲料混匀后制成药物鼠粮，于-20℃冰箱中保存备用。在海马穿刺伤前一天，将给药组小鼠的饲料更换为添加 1-40的饲料，直至实验结束。
脑创伤小鼠模型采用海马穿刺伤方法构建，具体实验步骤如下：将麻醉小鼠固定在立体定位仪上，用消毒的剪刀沿大脑中线剪开皮肤，用棉签擦拭将小鼠颅骨暴露出来，调节大脑左右和前后的水平，以Bregma与Lamda 连线正中点为定位原点，在前后端(AP)1.5毫米、左右侧(ML)1毫米和 2.5毫米之间的区域上方用手术刀将该区域的头盖骨打开，将一束间距0.5mm 的5跟26G穿刺针垂直插至皮层下2.5mm，停留2min后缓慢拔出。用棉签清楚伤口处的血污，将头盖骨盖上，缝合头皮。将小鼠放入37℃恒温保育箱中，直至小鼠苏醒且活动自如后将其放回饲养笼。
海马组织使用TROZOL抽提RNA，取2μg RNA反转录cDNA，使用 qRT-PCR检测炎症因子的mRNA表达量，qRT-PCR引物列于表2中。
ELISA分析参照博士德公司的检测试剂盒使用说明进行，分别定量IL6、 IL1β、TNFα及IL10的蛋白表达情况。
3、实验结果：
RT-PCR检测结果显示，在C57BL/6雄性小鼠海马穿刺伤后第三天，促炎因子IL6、IL-1β及TFN-α的表达显著上升，抑炎因子IL10、CD206及 Arg1表达下降；海马损伤小鼠进行1-40给药处理后，与溶剂组(Veh)相比，促炎因子IL6、IL-1β及TFN-α的表达显著下降，而抑炎因子IL10、CD206 及Arg1表达显著回复(图29A)。ELISA的结果确认，海马穿刺伤后促炎因子IL-6、IL-1β及TFN-α表达水平显著上升，抑炎因子IL10、Arg1及CD206 表达显著下降，而进行1-40处理后，与Veh组相比，促炎症因子IL-6、IL-1β及TFN-α表达水平显著下降而抑炎症因子IL10表达显著回复(图29B)。
与RT-PCR及ELISA结果相一致，Western Blot进一步确认1-40处理确实降低了脑创伤早期TNF-α表达量，同时增加了Arg1表达量的显著回升 (图29C)。这些数据表明，海马穿刺伤后进行1-40处理，能够显著抑制脑损伤早期的过度炎症反应。
实施例9：1-40有效降低穿刺伤海马的神经元凋亡
1、实验材料：C57BL6小鼠(购自北京斯贝福公司)，小分子药物1-40 (购买于MCE)，Rabbit anti-NeuN(Millipore，MAB360)，一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，C1090)，脑立体定位仪(KOPF，Model 940)。
2、实验方法：
细胞凋亡的TUNEL法检测参照碧云天一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的使用说明进行操作。神经元变性检测采用Fluoro-Jade C(FJC)染色，贴片脑片经56℃烘干与酒精梯度洗脱，室温避光条件下进行FJC染色，经 ddH2O清洗并烘干脑片，最后用抗荧光淬灭封片剂封片。
3、实验结果：
TUNEL及NeuN共染色的结果表明，在海马穿刺伤的第三天，与vehicle 对照组相比，1-40处理后神经元凋亡数目显著减少(图30A，B)。FJC染色结果与TUNEL染色结果相一致，1-40处理后变性神经元数目显著减少(图 30C，D)。这些结果提示，1-40给药能够显著改善穿刺伤海马神经元大量凋亡的现象。
实施例10：1-40有效保护海马组织在穿刺伤后突触相关蛋白的过度减低
1、实验材料：C57BL6小鼠(购自北京斯贝福公司)，小分子药物1-40 (购买于MCE)，Mouse anti-Synaptophysin(Abcam，ab32127)，Rabbit anti-cleaved caspase3(CST，9661s)，Rabbit anti-PSD95(Abcam， ab18258)，Mouse anti-GAPDH(Beyotime，AF1186)，脑立体定位仪(KOPF， Model 940)。
2、实验方法：
实验小鼠经冰冷PBS与4％PFA灌流，鼠脑浸泡在4％PFA中固定过夜，之后用30％蔗糖进行脱水处理，经冰冻组织切片后，采用悬浮组织染色法进行免疫组化的染色分析。
3、实验结果：
如图31所示，海马穿刺伤后，免疫组化(IHC)结果显示PSD95及 Synaptophysin蛋白表达显著下调，1-40处理能够显著改善穿刺伤后PSD95 及Synaptophysin蛋白表达下降程度(图31A，B)。同时，Western blot 检测PSD95及Synaptophysin蛋白表达水平的结果进一步证明：海马穿刺伤后，1-40处理能够显著抑制PSD95及Synaptophysin表达的下降(图22C)。
实施例11：1-40显著改善脑创伤模型鼠的学习记忆能力
1、实验材料：C57BL6小鼠(购自北京斯贝福公司)，小分子药物1-40 (购买于MCE)，脑立体定位仪(KOPF，Model 940)，水迷宫，巴恩斯迷宫。
2、实验方法：
在海马穿刺伤前一天，将给药组小鼠的饲料更换为添加1-40(浓度为20 mg/kg)的饲料，直至实验结束。给药21天后，对小鼠进行水迷宫与巴恩斯迷宫行为学分析。
水迷宫为一直径120厘米的装满水的圆形水箱，加入无毒的白色油漆混匀，使水不透明，保持水温19～23℃；在一个象限的中心，水面下方1厘米处隐藏一个圆形平台(直径13厘米)。小鼠连续5天在水迷宫中接受训练，每天训练4次，每次起始象限和顺序有电脑随机确定。在每次试验中，将小鼠从靠近水箱壁处放下，允许其在60s的试验期内搜索、找到并在平台上站立20秒。训练结束后的第二天进行平台搜索(probe)测试：先将隐藏在水面下的平台移除，用摄像机记录并用Smart 3.0软件分析小鼠在水箱中的游泳轨迹、速度、在每个象限花费的时间、第一次找到平台区域的时间、穿过平台区域的次数等参数。
巴恩斯迷宫是一个直径122厘米的圆形平台是，有20个等间距的洞(直径5厘米，距边缘2厘米)，只有一个洞的正下方有一个可拆卸的藏身盒。试验第一天，先让小鼠适应隐藏盒1分钟。随后进行连续5天的训练，每天进行2次试验，每次试验允许小鼠从平台中心点起始在5分钟内寻找藏身盒。 5分钟后，没有找到隐藏盒的小鼠被轻柔地引导到藏身盒。同一只小鼠的连续两次试验间隔30分钟以上。训练结束后的第二天进行空间记忆能力测试：先将藏身盒移除，用摄像机记录并用Smart 3.0软件分析小鼠在5min内的运动相关参数、穿过藏身盒区域的次数。
3、实验结果：
水迷宫实验结果表明，在适应性训练阶段，各处理组小鼠都表现出越来越好的空间学习能力，即首次找到隐藏平台的用时每天都在缩短。但是与Sham 组相比，海马穿刺伤小鼠首次找到平台的时间显著延长，而1-40给药能够显著缩短海马穿刺伤小鼠首次找到平台所需要的时间(图32A)。在测试阶段，各处理组小鼠游泳速度无组间差异(图32B)，海马穿刺伤小鼠首次找到平台的时间较Sham组显著延长且1min内穿越平台次数显著下降，1-40处理能够显著缩短脑损伤小鼠首次找到平台的时间并提高其穿越平台的次数(图 32C,D)，提示在海马穿刺伤后对小鼠进行1-40处理能够显著改善小鼠的学习认知能力缺陷。
巴恩斯迷宫实验结果与水迷宫实验结果相一致。在适应性训练阶段，1-40 处理的确能够缩短穿刺伤小鼠首次找到藏身盒所需的时间(图32E)。在测试阶段,三组小鼠5min内的运动距离相互间没有明显差别(图23F),海马穿刺伤小鼠第一次找到藏身盒的用时显著延长而1-40处理的小鼠寻找藏身盒所需实验较对照小鼠显著缩短(图32G)。海马穿刺伤小鼠5min内到达藏身盒次数显著少于Sham小鼠，而1-40处理小鼠穿越藏身盒次数显著增加(图 32H)。因此，巴恩斯迷宫实验的结果再次证明，海马穿刺伤后对小鼠进行 1-40给药处理能够显著改善它们的认知缺陷。
实施例12：1-40能够激活p-Smad3与Tmem119的表达
1、实验材料：C57BL6小鼠(购自北京斯贝福公司)，小分子药物1-40 (购买于MCE)，Mouse anti-GAPDH(Beyotime，AF1186)，Rabbit anti-phospho-Smad2(CST，18338S)，Rabbit anti-Smad2(CST，100425-T08)， Rabbit anti-phospho-Smad3(CST，8828S)，Rabbit anti-Smad4(CST， 38454S)，Rabbit anti-Tmem119(Abcam，ab209064)。
2、实验方法：
在海马穿刺伤前一天，将给药组小鼠的饲料更换为添加1-40(浓度为20 mg/kg)的饲料，直至实验结束。给药21天后，取部分实验鼠的海马组织进行Western blot分析；对其余小鼠进行灌流，鼠脑切片后，开展IHC分析。
3、实验结果：
Western blot分析结果表明：1-40给药后，穿刺伤海马组织p-Smad2及 Smad4表达显著上调，Tmem119的表达量也显著上调，提示1-40可能通过激活p-Smad3/Tmem119信号通路发挥功能(图33A)。对穿刺伤海马组织进行p-Smad3免疫荧光染色结果与Western blot结果相一致，1-40给药能显著提高p-Smad3在穿刺伤海马组织中的表达(图33B，C)。以上结果表明，1-40具有激活脑创伤海马组织p-Smad3/Tmem119表达的功能。
实施例13：1-40在脊髓损伤模型中的效果测试
1、实验材料：
小分子药物1-40(HY-16268,MCE)；抗体Mouse anti-GFAP(Abcam，ab7260)，Goatanti-Iba1(Abcam，ab5076)；8周大C57BL6雄性小鼠(购自北京斯贝福公司)
2、动物分组：
随机分为Sham(假手术组，仅切开和缝合皮肤，未造模)，SCI+KGN (药物治疗组，造模后通过鼠粮口服药物，剂量大概10mg/kg鼠粮)，SCI (对照组，造模后正常鼠粮饲喂)，每组6只共18只。
3、实验方法：
3.1脊髓损伤造模
1、小鼠称重，麻醉后将小鼠俯卧并将四肢固定于手术台上，手术区域备毛，1％活力碘消毒，铺无菌孔巾；
2、准确定位，以T9棘突为中心作后正中纵行切开，长约4cm，显露 T8-T10棘突及椎板。咬除T9棘突，从锥弓掀开椎板，咬除部分T8和T10 椎板，暴露待损伤脊髓长约5mm；
3、小鼠撞针规格2.5*5mm，砝码重20g，从30cm套管高度自由落下撞击脊髓。造模成功后缝合切口，青霉素洒至伤口处预防感染。
3.2BMS分数分析
术后1周开始检测，每周1次共8次
①手术前1d将正常鼠放入旷场内熟悉环境；②手术后第1天开始进行 BMS评分，鼠BMS评分观察期为4min；③可用录像机录下视频后用电脑分析，也可在熟练掌握该评分细则后立即给分。
结果分析BMS评分表是根据观察脊髓损伤鼠经过三个阶段的恢复而建立的，共21分。三个阶段为：①早期以无或极少的后肢关节运动为特征；②中期包括几次共济失调步态；③晚期包括精细运动，如拖着脚趾和尾巴，躯干不稳定以及爪子交替轮转。
BMS评分的高低代表了鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复的状态，分值越高，恢复越好，至9分时即与正常动物相当。其中0-2分属于恢复的早期阶段，动物无力支撑自身体重，以至于拖着躯干、后腿和臀部；2-3分进入了恢复的中期，动物可以行走以及支撑自身体重，前后肢协调运动开始恢复；4-9分阶段鼠一些精细运动开始恢复。
3.3脊髓组织免疫荧光染色
实验小鼠经冰冷PBS与4％PFA灌流，鼠脑浸泡在4％PFA中固定过夜，之后用30％蔗糖进行脱水处理，经冰冻组织切片后，采用悬浮组织染色法进行免疫组化的染色分析。
4、实验结果
BMS评分结果如图34所示，三组小鼠进行脊髓损伤8周后，BMS评分显示，小分子1-40治疗组(SCI+1-40)恢复程度较好，评分接近假手术组 (Sham)，而对照组几乎没有恢复。治疗组对比对照组具有显著差异。
免疫荧光染色结果如图35所示，脊髓损伤后，免疫荧光染色结果显示小分子1-40处理组GFAP蛋白表达强度下调，损伤部位未形成星形胶质细胞聚集，未发现明显的胶质瘢痕，有助于神经愈合。
上述结果充分说明小分子化合物通过激活Tmem119能够显著改善脊髓损伤。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Figure IDA0003737757420000011
Figure IDA0003737757420000021
Figure IDA0003737757420000031
Figure IDA0003737757420000041
Figure IDA0003737757420000051
Figure IDA0003737757420000061
Figure IDA0003737757420000071
Figure IDA0003737757420000081
Figure IDA0003737757420000091

Claims (26)

1.能够调节Tmem119基因的表达或者调节Tmem119基因产物的活性的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂选自多肽、蛋白、核酸、寡核苷酸、低分子量化学化合物或其任意组合。
3.权利要求1或2所述的用途，其中，所述试剂是激活剂，其能够激活或上调Tmem119基因的表达、和/或活化或增强Tmem119基因的蛋白产物的活性。
4.权利要求3所述的用途，其中，所述试剂选自Tmem119基因的蛋白产物或其活性片段，或者编码所述蛋白产物或其活性片段的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。
5.权利要求3所述的用途，其中，所述试剂选自低分子量化学化合物，所述低分子量化学化合物选自式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物；
Figure FDA0003737757370000011
其中：
环A是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被R1和R2基团取代；
X为羟基、C1-C6烷氧基或氨基；
R1位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)，并且R1选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、或-C(O)R3；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
R3选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基或
Figure FDA0003737757370000021
所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；其中，
环B是苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中每个基团被Ra基团、Rb基团和Rc基团取代；其中，
Ra为-Ar或-L-Ar；
L为C1-C6亚烷基、O、C(O)、S、S(O)、S(O)2；
Ar为Ar1或Ar2-Ar3，其中，Ar1、Ar2、Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基氨基、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基。
6.权利要求5所述的用途，其中，所述化合物具有式(Ia)所示的结构：
Figure FDA0003737757370000031
其中，环A、X、R2、R3如权利要求5中定义，并且环A中，-C(O)R3位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)。
7.权利要求5所述的用途，其中，所述化合物具有式(Ib)所示的结构：
Figure FDA0003737757370000032
其中，环A、X、R2、环B、Ra、Rb、Rc如权利要求5中定义，并且环A中，-C(O)NH-位于-C(O)X的邻位或对位(例如邻位)。
8.权利要求7所述的用途，其中，环B中，Ra为-Ar1或-L-Ar1，Ar1选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，Ar1未被取代或被卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)取代。
9.权利要求7所述的用途，其中，环B中，Ra为-Ar2-Ar3或-L-Ar2-Ar3，Ar2和Ar3各自独立地选自苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，Ar2和Ar3各自独立地为取代或未取代的苯基，所述取代的苯基被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，Ar2和Ar3各自独立地为未取代或卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)取代的苯基。
10.权利要求7-9任一项所述的用途，其中，L为亚甲基、亚乙基或氧原子。
11.权利要求7-10任一项所述的用途，其中，环B中，Ra位于-NH-的对位或间位；
优选地，Ra位于-NH-的对位。
12.权利要求7-11任一项所述的用途，其中，环B中，Rb、Rc各自独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，Rb、Rc各自独立地选自氢、甲基或乙基；
优选地，Rb、Rc相同；
优选地，Rb、Rc均为氢或甲基。
13.权利要求5所述的用途，其中，R1选自C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，R1选自C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基；
优选地，R1选自甲基，乙基，正丙基或异丙基，正丁基、仲丁基或叔丁基，其中所述各基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)。
14.权利要求6所述的用途，其中，R3选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基或氨基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基；
优选地，R3选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基或氨基；所述烷基或烷氧基未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基；
优选地，R3选自甲基，乙基，正丙基或异丙基，正丁基、仲丁基或叔丁基，羟基，或氨基，其中所述各脂肪族基团未被取代或被一个或几个(例如1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)。
15.权利要求5-14任一项所述的用途，其中，X为羟基、C1-C4烷氧基或氨基；
优选地，X为羟基，甲氧基，乙氧基，或氨基。
16.权利要求5-15任一项所述的用途，其中，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；
优选地，R2为氢、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基
优选地，R2为氢或苯基，例如氢。
17.权利要求5-15任一项所述的用途，其中，当环A为苯基时，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基氨基、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；
优选地，R2选自氢、卤素(例如-F、-Cl、-Br或-I)、硝基、氨基、羟基、巯基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基氨基、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；
优选地，R2为氢、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；
优选地，R2为氢或苯基，例如氢。
18.权利要求5-15任一项所述的用途，其中，当环A为吡啶基时，R2为氢。
19.权利要求5-18任一项所述的用途，其中，环A中，R2位于-C(O)X的对位或间位。
20.权利要求5-19任一项所述的用途，其中，所述化合物选自表格一所述的任何化合物，包括1-2或其药学上可接受的盐或酯、1-3或其药学上可接受的盐或酯、1-4或其药学上可接受的盐或酯、1-5或其药学上可接受的盐或酯、1-6或其药学上可接受的盐或酯、1-7或其药学上可接受的盐或酯、1-8或其药学上可接受的盐或酯、1-9或其药学上可接受的盐或酯、1-10或其药学上可接受的盐或酯、1-11或其药学上可接受的盐或酯、1-12或其药学上可接受的盐或酯、1-13或其药学上可接受的盐或酯、1-14或其药学上可接受的盐或酯、1-15或其药学上可接受的盐或酯、1-16或其药学上可接受的盐或酯、1-17或其药学上可接受的盐或酯、1-18或其药学上可接受的盐或酯、1-19或其药学上可接受的盐或酯、1-20或其药学上可接受的盐或酯、1-21或其药学上可接受的盐或酯、1-22或其药学上可接受的盐或酯、1-23或其药学上可接受的盐或酯、1-24或其药学上可接受的盐或酯、1-25或其药学上可接受的盐或酯、1-26或其药学上可接受的盐或酯、1-27或其药学上可接受的盐或酯、1-28或其药学上可接受的盐或酯、1-29或其药学上可接受的盐或酯、1-30或其药学上可接受的盐或酯、1-31或其药学上可接受的盐或酯、1-32或其药学上可接受的盐或酯、1-33或其药学上可接受的盐或酯、1-34或其药学上可接受的盐或酯、1-35或其药学上可接受的盐或酯、1-36或其药学上可接受的盐或酯、1-37或其药学上可接受的盐或酯、1-38或其药学上可接受的盐或酯、1-39或其药学上可接受的盐或酯、1-40或其药学上可接受的盐或酯、1-41或其药学上可接受的盐或酯、1-42或其药学上可接受的盐或酯、1-43或其药学上可接受的盐或酯、1-44或其药学上可接受的盐或酯、1-45或其药学上可接受的盐或酯、1-46或其药学上可接受的盐或酯、1-47或其药学上可接受的盐或酯。
21.权利要求1-20任一项所述的用途，其中，所述神经退行性疾病以选自下列的一种或多种为表征：认知功能障碍、共济失调、神经退变(例如神经元死亡)和/或蛋白聚集体形成(例如，淀粉样蛋白β(Aβ)沉积)。
22.权利要求1-20任一项所述的用途，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病、多系统萎缩症、路易氏痴呆、额颞叶痴呆、血管性痴呆、创伤后神经退行性疾病。
23.权利要求1-20任一项所述的用途，其中，所述中枢神经系统损伤选自创伤性脑损伤(TBI)、脑卒中或脊髓损伤(SCI)。
24.权利要求1-23任一项所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
25.筛选用于预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征的候选药物的方法，其包括筛选能够调节Tmem119基因的表达或者调节Tmem119基因产物的活性的试剂的步骤。
26.权利要求25所述的方法，其中，所述方法包括筛选能够激活或上调Tmem119基因的表达、和/或活化或增强Tmem119基因的蛋白产物的活性的激活剂；
优选地，所述筛选包括：
(1)在受试试剂存在的情况下，测定Tmem119基因在能够表达该基因的细胞中的表达水平；
(2)将步骤(1)的测定结果与不存在所述受试试剂时测定的所述基因的表达水平进行比较；
其中，如果步骤(1)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果相比升高，表明所述受试试剂是该基因的激活剂，并且是用于预防和/或治疗神经退行性疾病或中枢神经系统损伤或改善神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的至少一种症状或病理表征的候选药物。
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