CN115918513A

CN115918513A - 一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法

Info

Publication number: CN115918513A
Application number: CN202310147725.2A
Authority: CN
Inventors: 茅云翔; 张帅; 唐磊
Original assignee: Sanya Institute Of Oceanography Ocean University Of China; Yazhouwan Innovation Research Institute Of Hainan Institute Of Tropical Oceanography
Current assignee: Sanya Institute Of Oceanography Ocean University Of China; Yazhouwan Innovation Research Institute Of Hainan Institute Of Tropical Oceanography
Priority date: 2023-02-22
Filing date: 2023-02-22
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2043-02-22
Also published as: CN115918513B

Abstract

本发明提供了一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，属于海藻养殖技术领域。本发明所述方法包括：将琼枝预培养后，通过连续供给方式培养琼枝；所述连续供给的水体中NH₄ ⁺‑N的浓度为4‑6μmol·L^‑1，PO₄ ^3‑‑P的浓度为0.5‑1.5μmol·L^‑1。本发明采用恒定的低营养盐浓度水体，能够满足琼枝生长习性，贴近海区自然生长状态，实现室内琼枝连续培养；不仅为琼枝或其它大型海藻室内培养模式提供了新的思路，也为琼枝的室内驯化及大型海藻生态资源修复提供了技术保障。实验结果表明，与一次供给营养盐的培养方式相比，本发明低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，更有利于提升琼枝的生长速率。

Description

一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法

技术领域

本发明属于海藻养殖技术领域，尤其涉及一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法。

背景技术

琼枝（Betaphycus gelatinus）是原生的大型热带海洋红藻，是重要的珊瑚礁海藻种质资源，具有很高的经济和生态价值。在经济方面，琼枝不仅是天然的绿色食品，也是卡拉胶提取的重要来源；在生态方面，琼枝是热带珊瑚礁生态系统中重要的大型海藻，作为初级生产者能够为鱼类、螺类等捕食者提供食物来源和栖息地，对维持珊瑚礁生态系统的平衡具有重要作用。

目前，国内需求的琼枝主要来自海南野生种，但由于海洋环境的污染、水质恶化以及人为采摘等原因，使得野生琼枝逐年缩小，已处于濒临灭绝的状态。人工养殖可弥补琼枝资源的紧缺，但养殖主要在海区采用水泥框底播种植方式；海藻室内养殖一般采用一次供给营养盐的方式为主，而琼枝为喜好在低营养盐浓度环境中生长，显然此类方法不适应琼枝在室内的持续培养，琼枝养殖技术处于落后的状态，亟需探索开发琼枝室内养殖体系。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，能够满足琼枝生长习性，贴近海区自然生长状态，实现室内琼枝连续培养。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，包括：将琼枝预培养后，通过连续供给方式培养琼枝；所述连续供给的水体中NH₄ ⁺-N的浓度为4-6 μmol·L^-1，PO₄ ^3--P的浓度为0.5-1.5 μmol·L^-1。

优选的，所述连续供给采用水体循环方式；所述水体中通入CO₂；所述水体的流速为3.5-4.5 L·min^-1。

优选的，所述连续供给的水体中盐度为30‰-40‰。

优选的，所述预培养和所述培养的光照强度为110-130 μmol·m^-2·s^-1，温度为24-28 ℃，光暗周期为(10-14)L:(10-14)D。

优选的，所述预培养水体包括海水和培养液；所述培养液为所述预培养水体体积的0.5%-1.5%。

优选的，所述培养液包括以下浓度的组分：六水合硫酸亚铁铵110-115mg·L^-1、氯化铵 100-105 mg·L^-1、硝酸钠635-640 mg·L^-1、磷酸二氢钠45-50mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠 140-160mg·L^-1、R溶液 95-105 mL·L^-1；所述R溶液包括以下浓度的组分：乙二胺四乙酸二钠 240-260 mg·L^-1、六水合氯化铁 120-130 mg·L^-1、一水合硫酸锰 400-420mg·L^-1、七水合硫酸锌 50-60 mg·L^-1、五水合硫酸铜 10-15 mg·L^-1、硼酸2800-2810mg·L^-1。

优选的，所述预培养的时间为13-15 d。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明首次建立了一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，采用恒定的低营养盐浓度水体，能够满足琼枝生长习性，贴近海区自然生长状态，实现室内琼枝连续培养；不仅为琼枝或其它大型海藻室内培养模式提供了新的思路，也为琼枝的室内驯化及大型海藻生态资源修复提供了技术保障。

实验结果表明，与一次供给营养盐的培养方式相比，本发明低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，更有利于提升琼枝的生长速率。

附图说明

图1为本发明连续培养海藻琼枝的装置；所述装置包括：储水桶A、潜水泵B、水排C、培养瓶D、蠕动泵E、母液瓶F和气泵G；

图2为实施例1培养体系中NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化；

图3为实施例2培养体系中NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化；

图4为实施例2中琼枝培养前（a）和培养4d后（b）的状态；

图5为实施例3培养体系中NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化；

图6为实施例4低浓度连续培养体系内NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度；

图7为实施例4和对比例2琼枝的每3d的日生长率；

图2-3、图5中0-0.5d为光周期，0.5-1d为暗周期，以此类推。

具体实施方式

本发明提供了一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，包括：将琼枝预培养后，通过连续供给方式培养琼枝；所述连续供给的水体中NH₄ ⁺-N的浓度为4-6 μmol·L^-1，PO₄ ^3--P的浓度为0.5-1.5 μmol·L^-1。

琼枝生长过程中需要氮源的供给，提供适当量的NH₄ ⁺-N，可促进琼枝的生长，而浓度如果过高，会抑制琼枝的生长，甚至会造成琼枝的死亡。因此，本发明培养琼枝设置水体中NH₄ ⁺-N的浓度为5 μmol·L^-1，PO₄ ^3--P的浓度为1.0 μmol·L^-1，此浓度贴近琼枝养殖区内海水中NH₄ ⁺-N与PO₄ ^3--P浓度。

本发明所述连续供给优选采用水体循环方式；所述水体中优选通入CO₂，能够模拟水气交互；本发明对所述CO₂浓度没有特殊限定，采用本领域常用浓度即可；所述水体的流速优选为3.5-4.5 L·min^-1，更优选为4L·min^-1；所述连续供给的水体中盐度优选为30‰-40‰，更优选为35‰，所述水体优选为海水；所述培养的光照强度优选为110-130 μmol·m^-2·s^-1，更优选为120 μmol·m^-2·s^-1，温度优选为24-28 ℃，更优选为26 ℃，光暗周期优选为(10-14)L:(10-14)D，更优选为12L:12D。本发明连续供给培养方式主要模拟海区恒定低营养盐浓度为主，同时模拟海区光暗周期、海流、水气交互、温度等要素贴近海区生长环境，达到模拟自然海区环境的目的；即满足养殖水体低营养盐浓度恒定且能够保持源源不断的营养盐供给，打破现有一次供给的培养模式，为室内模拟海区养殖环境创造了条件，同时为工厂化养殖提供新思路。

本发明所述方法不仅适用于琼枝培养，还可以灵活调整改变装置中温度、光照条件、体系营养盐浓度等环境因子，实现对其他不同生长条件的大型海藻的连续培养，具有一定的普适性。

在本发明中，所述预培养水体优选包括海水和培养液；所述培养液优选为所述预培养水体体积的0.5%-1.5%，更优选为1%；所述培养液优选包括以下浓度的组分：六水合硫酸亚铁铵 110-115mg·L^-1、氯化铵 100-105 mg·L^-1、硝酸钠635-640 mg·L^-1、磷酸二氢钠45-50mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠 140-160mg·L^-1、R溶液 95-105 mL·L^-1；更优选为：六水合硫酸亚铁铵 113.8 mg·L^-1、氯化铵 102.7 mg·L^-1、硝酸钠637.5 mg·L^-1、磷酸二氢钠48mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠 150mg·L^-1、R溶液 100 mL·L^-1；所述R溶液优选包括以下浓度的组分：乙二胺四乙酸二钠 240-260 mg·L^-1、六水合氯化铁 120-130 mg·L^-1、一水合硫酸锰 400-420 mg·L^-1、七水合硫酸锌 50-60 mg·L^-1、五水合硫酸铜10-15 mg·L^-1、硼酸2800-2810mg·L^-1，更优选包括：乙二胺四乙酸二钠 250 mg·L^-1、六水合氯化铁122.5 mg·L^-1、一水合硫酸锰 410 mg·L^-1、七水合硫酸锌 55 mg·L^-1、五水合硫酸铜12mg·L^-1、硼酸2850mg·L^-1；所述培养液中NO₃ ^–-N与NH⁴⁺-N的浓度比为3:1，N/P的浓度比为25:1，氮源浓度为100 μmol·L^-1；所述预培养的光照强度优选为110-130 μmol·m^-2·s^-1，更优选为120 μmol·m^-2·s^-1，温度优选为24-28 ℃，更优选为26 ℃，光暗周期优选为(10-14)L:(10-14)D，更优选为12L:12D。所述预培养的时间优选为13-15 d，更优选为14 d。本发明预培养步骤能稳定琼枝状态，保证琼枝状态均一，减小或消除在后续连续培养中因海藻状态不均一，对琼枝生长率及对营养盐吸收的影响。

本发明还提供了一种用于低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的装置，包括储水桶A、潜水泵B、水排C、培养瓶D、蠕动泵E、母液瓶F和气泵G；所述潜水泵B置于所述储水桶A内，通过所述潜水泵B将所述储水桶A与所述水排、培养瓶D依次连通形成循环回路；所述母液瓶F通过所述蠕动泵E与所述储水桶A相连通；所述储水桶A还连通有气泵G。

所述储水桶A储存水体；所述潜水泵B将储水桶A内水体供给到水排C中；所述水排C由PVC管与水流调节阀组成，调节通入培养瓶内水体流速；所述培养瓶D为琼枝培养容器，下口进水，随着瓶内水体的增多从上口流出，使培养瓶内一直处于水体循环；本发明所述水排C的出水口数量与培养瓶D的数量相同，作为一种优选方式，其数量大于2；所述蠕动泵E从母液瓶F内按光暗周期消耗量分别向储水桶A内补充相应营养盐，使其稳定于实验值；所述母液瓶F储存高浓度营养盐母液；所述气泵G为水体提供CO₂，搅拌水体，模拟水气交互，加速营养盐的混匀。

本发明利用潜水泵B将储水桶A内的海水供给给水排C，之后分配给培养瓶D，并通过调节水流调节阀保持各培养瓶D间水体流速一致，随着水体的不断增加，达到一定量后从培养瓶D上出水口流入储水桶A内，从而实现培养瓶D与储水桶A间的水体循环。每个光周期、暗周期结束时监测储水桶A和培养瓶D内的营养盐浓度，参考每个周期营养盐的消耗量，设定母液F的浓度与每个周期的加入量，并利用蠕动泵E将其定时定量泵入储水桶A内，维持培养水体内营养盐恒定，气泵G处于开启状态，为储水桶A内水体提供CO₂并加快储水桶A内营养盐的混匀。本发明所述连续培养装置可实现水体循环，达到模拟自然海区环境的目的。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

预实验测试装置的运行情况

1、实验材料

实验海水：天然海水（盐度35‰）在暗环境内静置7天，利用0.45μm混合纤维素脂滤膜过滤备用；

培养瓶、镊子、软管等器械均121℃、0.1MPa下灭菌30 min。

母液配置：母液A：1000μmol·L^-1 NH⁴⁺-N。

装置(图1所示)包括：储水桶A、潜水泵B、水排C、培养瓶D、蠕动泵E、母液瓶F和气泵G；所述潜水泵B置于所述储水桶A内，通过所述潜水泵B将所述储水桶A与所述水排C、培养瓶D依次连通形成循环回路；所述母液瓶F通过所述蠕动泵E与所述储水桶A相连通；所述储水桶A还连通有气泵G；水排C的出口数量为6个，培养瓶D的数量为6个。

2、琼枝预培养

采自昌江黎族自治县海尾镇渔人码头附近，选取健康藻体，用实验海水清洗干净，并切成1g左右大小，光强120μmol·m^-2·s^-1、温度26℃、盐度35‰、光暗周期12L:12D、使用实验海水培养14d，每3d更换一次水，并以1:100比例加入培养液。培养液的成分如表1和表2所示。

表1 培养液配方

表2 R溶液配方

3、琼枝在初始NH⁴⁺-N（70μmol·L^-1）浓度下对营养盐吸收率测定实验

储水桶A内放入50L实验海水，并设定 NH⁴⁺-N浓度为70 μmol·L^-1，称取12g步骤2与培养得到的琼枝，平均分为6份，放入6个2L培养瓶内，连接管道，启动装置，后期不加入母液。每24h测定储水桶内NH⁴⁺-N浓度，并计算的琼枝对NH⁴⁺-N的吸收速率。培养条件：在光强120μmol·m^-2·s^-1，温度26℃，盐度35‰，光暗周期12L:12D，培养瓶内水体流速4L·min^-1，培养2d，具体结果见表3。

水样中NH₄ ⁺-N、PO₄ ^3--P浓度测定方法为：利用全自动间断化学分析仪（ClerverChem）测定：NH₄ ⁺-N采用靛酚蓝法测定；PO₄ ^3--P采用磷钼蓝法测定。

（1）海藻吸收速率计算方法：

U=（C₀-C_t）·V·t^-1·G^-1

式中U为吸收速率（μmol·g^-1·h^-1），C₀为初始培养液中营养盐的浓度（μmol·L^-1），C_t为某周期结束时培养液中营养盐的浓度（μmol·L^-1），V为培养液体积（L），t为培养时间（h），G为添加的海藻重量（g）。

（2）营养盐某周期内消耗量计算方法：

M=（C₀-C_t）·V+C_M·V_J

式中M为某周期内消耗量（μmol），C₀为初始培养液中营养盐的浓度（μmol·L^-1），C_t为某周期结束时培养液中营养盐的浓度（μmol·L^-1），V为培养液体积（L），C_M为母液中营养盐的浓度（μmol·L^-1），V_J为母液某周期内加入体积（L）。

（3）特定生长速率(specific growth rate，SGR)计算方法：

SGR =100×（［(W_t/W₀)^（1/t）］^-1）

其中：SGR为海藻日生长率(%·d^-1)；W₀为初始藻的鲜重(g)；W_t为培养 t 时间藻的鲜重(g)；t 为实验培养时间(d)。

表3 琼枝对NH₄ ⁺-N的吸收速率

4、在恒定NH⁴⁺-N（70μmol·L^-1）浓度连续培养琼枝实验

设定NH⁴⁺-N浓度为70μmol·L^-1，水体50L，培养条件同步骤3，蠕动泵每间隔15min自动添加一次母液，共培养12g藻体，每24h监测一次NH⁴⁺-N的浓度，参考于吸收速率实验值，选定60μmol·d^-1·g^-1，通过计算，设定第一天利用蠕动泵每15min泵入7.5mL母液。

由于第一天营养盐变化量与初始相比具有显著差异性，因此根据消耗量重新计算母液添加量，修改为每15min泵入10.4 mL母液，每24h测定NH⁴⁺-N浓度。培养体系内NH⁴⁺-N浓度的变化如图2所示。

根据图2分析，在第一天对NH⁴⁺-N母液加入量调整后，储水桶中的水体处于稳定状态，用Spss26软件进行显著性差异分析，发现除第2d外其余时间均与初始NH⁴⁺-N浓度无显著性差异，证明培养装置可实现NH⁴⁺-N浓度的恒定，达到预期目标。

步骤3和步骤4为初步实验，设置高浓度营养盐以及单营养盐较双营养盐相比，都较为容易控制培养体系中营养盐浓度的相对恒定，能够证明此技术方案能够顺利进行，属于为后续实验做铺垫。根据图2可验证本发明的装置可保证本发明培养方法顺利运行，且满足预期目标。

实施例2

低浓度营养盐（模拟琼枝海区营养盐条件）连续培养海藻琼枝

母液配置：500μmol·L^-1 NH⁴⁺-N 、100μmol·L^-1 PO₄ ^3--P

1、将琼枝进行预培养，具体方法与实施例1步骤2相同。

2、在初始NH⁴⁺-N（8μmol·L^-1）与PO₄ ^3--P（1.3μmol·L^-1）浓度下培养琼枝测定其对营养盐吸收速率实验

储水桶A内放入100L海水，设定NH⁴⁺-N浓度为8μmol·L^-1、PO₄ ^3--P浓度为1.3μmol·L^-1（根据实例1吸收速率实验结果，将营养盐含量相比预设值均提高30%，防止出现将营养盐完全吸收，影响对吸收速率的计算），测定储水桶内NH⁴⁺-N、PO₄ ^3--P初始浓度；称取约6g琼枝，平均分为6份，分别放入6个2L培养瓶内，连接管道，启动装置，培养条件同实施例1步骤3；每光、暗周期测定初、终储水桶内NH⁴⁺-N、PO₄ ^3--P浓度，具体结果见表4。

表4 琼枝分别对NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P的吸收速率

3、恒定NH⁴⁺-N（5μmol·L^-1）与PO₄ ^3--P（1μmol·L^-1）浓度连续培养琼枝实验

储水桶A内放入100L实验海水，设定初始浓度为5μmol·L^-1 NH⁴⁺-N、1μmol·L^-1PO₄ ^3--P，测定储水桶内NH⁴⁺-N、PO₄ ^3--P初始浓度；称取6g琼枝，平均分为6份，分别放入6个2L培养瓶内连接管道，启动装置，培养条件同实施例1步骤4，共培养4d。培养体系中NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化如图3所示。初始根据表4对营养盐消耗量的计算每暗周期利用蠕动泵每15min泵入5mL NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P母液，每光周期泵入7.5mL NH⁴⁺-N母液与5mL PO₄ ^3--P母液。

每光、暗周期结束时监测培养体系中NH⁴⁺-N、PO₄ ^3--P浓度，并根据实时数据对泵入量作出适当调整。调整如下：

1-1.5d内NH⁴⁺-N浓度浮动偏大，在第1.5d调整为蠕动泵每15min暗、光周期分别泵入3.3mL 、10.4mL NH⁴⁺-N 母液， PO₄ ^3--P母液泵入量不变。

在第2.5d发现PO₄ ^3--P变化明显，调整为每暗、光周期分别以蠕动泵泵入2.5mL、5mLPO₄ ^3--P母液，NH⁴⁺-N母液加入量不变。

表5 培养瓶内琼枝鲜重及日生长率

根据图3分析，NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化基本无显著性差异，同时根据表5及图4显示，琼枝在此培养模式下可正常生长。

实施例3

具体实施方式与实施例2相同，不同的是称取10g琼枝，平均分为6份，分别放入6个2L培养瓶中，设定蠕动泵每15min暗周期泵入5.8mL NH⁴⁺-N母液与4.2mL PO₄ ^3--P母液，每光周期泵入17.9mL NH⁴⁺-N母液与8.3mL PO₄ ^3--P母液，每光、暗周期结束时测定储水桶内NH⁴⁺-N、PO₄ ^3--P浓度，具体结果见表6和图5。

表6 培养瓶内琼枝鲜重及日生长率

根据图5分析，在完成调整后，NH⁴⁺-N浓度变化无显著性差异，PO₄ ^3--P仅在第2d出现波动，其余时间节点均无显著性差异，说明营养盐浓度维持在恒定状态；根据表6显示琼枝在此培养模式下可正常生长，因此证明可实现培养装置和方法的稳定。

实施例4

本实施例的具体实施方式和实施例2相同，不同的是没有步骤2，并且培养时间为18d。

根据实例2-3发现，琼枝对营养盐的吸收主要集中在光周期，因此后续营养盐的测定，调整为每光周期结束进行一次测定。培养体系中NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度，具体变化情况如图6所示。

根据图6分析，在18d内NH⁴⁺-N与PO₄ ^3--P浓度变化基本无显著性差异，说明本发明装置及方法稳定可行。

实施例1-4均采用本发明图1装置。

对比例1

一次供给营养盐的培养海藻琼枝

实验材料和琼枝预培养步骤与实施例1步骤1步骤2相同。

藻体采用2L通气瓶培养，每瓶放入约1g琼枝藻体，放入2L的水体，设定初始浓度为5μmol·L^-1 NH⁴⁺-N、1μmol·L^-1 PO₄ ^3--P，共6个平行组，每4d更换一次培养水体，培养8d。其中培养水体中NH⁴⁺-N浓度为5μmol·L^-1 、PO₄ ^3--P浓度为1μmol·L^-1。

培养条件：光强120μmol·m^-2·s^-1，温度26℃，盐度35‰，光暗周期12L:12D。每4d测定藻体重量，计算日生长率，具体结果见表7。

表7 培养瓶内琼枝鲜重及日生长率

通过对比实施例2表5和对比例表7的数据，可以显而易见的得知，本发明连续培养方法的琼枝明显高于对比例1一次供给的日生长率。

对比例2

为了将本发明方法在较长时间内对琼枝的培养状况（实施例4）与对比例1进行更加直观的对比，因此依据对比例1的实施方式，培养时间延设定为18d，每3d更换一次培养水体(琼枝约3d可将培养体系内营养盐完全吸收)，并测定一次日生长率。

实施例4每3d测定一次日生长率。将实施例4连续培养和对比例2一次供给的日生长率进行对比，具体结果见图7。

由图7可知，在同初始浓度状态下，采用本发明实施例4低浓度连续培养琼枝的方式，不仅可实现琼枝在低浓度营养盐环境内的连续培养，而且琼枝生长率高于对比例2一次供给培养琼枝的方式，说明本发明培养方法在促进琼枝生长率上更具备优势。

综上可知，相比对比例1实验室内常采用的一次供给营养盐的培养方式，本发明的连续培养方法更有利于提升琼枝的生长速率，为藻体的扩繁提供理论基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种低浓度营养盐连续培养海藻琼枝的方法，其特征在于，包括：将琼枝预培养后，通过连续供给方式培养琼枝；所述连续供给的水体中NH₄ ⁺-N的浓度为4-6 μmol·L^-1，PO₄ ^3--P的浓度为0.5-1.5 μmol·L^-1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续供给采用水体循环方式；所述水体中通入CO₂；所述水体的流速为3.5-4.5 L·min^-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续供给的水体中盐度为30‰-40‰。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养和所述培养的光照强度为110-130 μmol·m^-2·s^-1，温度为24-28 ℃，光暗周期为(10-14)L:(10-14)D。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养的水体包括海水和培养液；所述培养液占所述预培养的水体体积的0.5%-1.5%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养液包括以下浓度的组分：六水合硫酸亚铁铵110-115mg·L^-1、氯化铵 100-105 mg·L^-1、硝酸钠635-640 mg·L^-1、磷酸二氢钠45-50mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠 140-160mg·L^-1、R溶液 95-105 mL·L^-1；所述R溶液包括以下浓度的组分：乙二胺四乙酸二钠 240-260 mg·L^-1、六水合氯化铁 120-130 mg·L^-1、一水合硫酸锰 400-420 mg·L^-1、七水合硫酸锌 50-60 mg·L^-1、五水合硫酸铜 10-15mg·L^-1、硼酸2800-2810mg·L^-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养的时间为13-15 d。