CN115901401A - 一种p16免疫细胞化学染色试剂盒及染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种p16免疫细胞化学染色试剂盒及染色方法，所述试剂盒包括细胞保存液；所述细胞保存液包括氮基三乙酸、葡萄糖酸、山梨糖醇、氨基醇、多聚甲醛、PEG400、NaCl、KCl和缓冲液。本发明的试剂盒中的细胞保存液可以快速修复细胞抗原、充分暴露抗原决定簇，同时提高细胞膜通透性，利于抗体分子进入细胞结合抗原，细胞保存液与封闭液、染色液相互配合，检测准确性高、假阴性率低，染色方法操作简便、染色结果清晰可见、易判读。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞化学染色技术领域，涉及一种p16免疫细胞化学染色试剂盒及染色方法。
背景技术
宫颈癌细胞学检测常使用的生物标志物为肿瘤抑制蛋白p16INK4a（p16），它在细胞周期调控中发挥着关键作用，p16蛋白特异性地与CDK4或Cyclin-CDK4复合物结合，抑制CDK4的活性，从而延缓细胞从G1进入S期的进程。p16蛋白的表达受视网膜母细胞瘤蛋白（RB）的负调控，在高危HPV（hrHPV）的转化细胞中，RB与HPV E7结合而失活，使p16发生过表达，因此，p16过表达可以作为肿瘤转化的指标。
p16免疫组化已被广泛应用于宫颈高级别上皮内瘤变（CIN）的组织学诊断，相较其他检测手段具有较高的准确性。然而，p16在宫颈癌初筛中的适用性仍需进一步评估。近年来，多项研究提供了重要的数据，表明p16细胞免疫组织化学染色可以分流细胞学轻度异常患者和HPV阳性患者，且提高了宫颈癌筛查的准确度和效率。
但是，现有的p16细胞免疫组织化学染色试剂盒存在抗干扰性弱、假阴性、操作复杂、结果难判读且判读方法复杂的问题，降低了检测特异性和准确性。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种p16免疫细胞化学染色试剂盒及染色方法，所述试剂盒中的细胞保存液可以快速修复细胞抗原、充分暴露抗原决定簇，同时提高细胞膜通透性，利于抗体分子进入细胞结合抗原，细胞保存液与封闭液、染色液相互配合，检测准确性高、假阴性率低，染色方法操作简便、染色结果清晰可见、易判读。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒包括细胞保存液；
所述细胞保存液包括氮基三乙酸、葡萄糖酸、山梨糖醇、氨基醇、多聚甲醛、PEG400、NaCl、KCl和缓冲液。
本发明中，氮基三乙酸和葡萄糖酸相互配合、高效解离细胞中存在的p16-CDK4或p16-Cyclin-CDK4蛋白质复合物，使p16的抗原决定簇充分暴露，方便多聚甲醛固定p16；葡萄糖酸、山梨糖醇、氨基醇和PEG400、NaCl、KCl协同作用，在维持细胞形态完整性的前提下提高细胞膜的通透性，方便p16抗体进入细胞与p16抗原决定簇结合，所述细胞保存液中的各组分相互配合发挥协同促进作用，显著减少了细胞样本的处理时间，提高了免疫细胞化学染色的准确性，同时避免了假阴性发生。
优选地，所述氮基三乙酸在所述细胞保存液中的终浓度为2~10 mM，例如可以是2mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM或10 mM，优选为2~5 mM。
优选地，所述葡萄糖酸在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM，例如可以是1 mM、2 mM、3 mM、4 mM或5 mM，优选为3~4 mM。
优选地，所述山梨糖醇在所述细胞保存液中的终浓度为15~30 mM，例如可以是15mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26 mM、27 mM、28mM、29 mM或30 mM，优选为20~25 mM。
优选地，所述氨基醇可以是氨基丁醇或氨基戊醇，所述氨基醇在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM，例如可以是1 mM、2 mM、3 mM、4 mM或5 mM，优选为2~4 mM。
本发明中，细胞保存液中的低浓度氨基醇可以提高细胞样本的分散性、避免细胞成团，使得细胞的染色效果好，易于在显微镜下观察。
优选地，所述多聚甲醛在所述细胞保存液中的终浓度为0.1~0.5 mM，例如可以是0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM或0.5 mM，优选为0.1~0.2 mM。
优选地，所述PEG400在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM，例如可以是1 mM、2mM、3 mM、4 mM或5 mM，优选为3~4 mM。
优选地，所述NaCl在所述细胞保存液中的终浓度为50~100 mM，例如可以是50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、95 mM或100 mM，优选为70~80 mM。
优选地，所述KCl在所述细胞保存液中的终浓度为10~20 mM，例如可以是10 mM、11mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM或20 mM，优选为10~15 mM。
本发明中，氮基三乙酸、葡萄糖酸、山梨糖醇、氨基醇、多聚甲醛、PEG400、NaCl和KCl在合理的配比下充分混合形成细胞保存液，具有快速修复p16蛋白质、促进p16抗体进入细胞结合p16的效果，对于提高免疫细胞化学染色效果、检测准确性具有显著促进作用。
优选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。
优选地，所述细胞保存液的pH为7~7.5，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为7~7.2。
优选地，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液包括脱脂奶粉、TritonX-100、proclin300和缓冲液。
优选地，所述脱脂奶粉在所述封闭液中的终浓度为50~150 g/L，例如可以是50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L、110 g/L、120 g/L、130 g/L、140 g/L或150 g/L，优选为80~100 g/L。
优选地，所述TritonX-100在所述封闭液中的终浓度为10~20 g/L，例如可以是10g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L或20 g/L，优选为15~20 g/L。
优选地，所述proclin300可以增强封闭液的稳定性，防止脱脂奶粉等营养成分变质，延长封闭液的保存时间，所述proclin300在所述封闭液中的终浓度为200~300 g/L，例如可以是200 g/L、210 g/L、220 g/L、230 g/L、240 g/L、250 g/L、260 g/L、270 g/L、280g/L、290 g/L或300 g/L，优选为260~280 g/L。
本发明中，脱脂奶粉、TritonX-100和proclin300在合理的配比下发挥作用，有效封闭非检测位点，在不依赖于酶标二抗的同时提高了染色的特异性，操作简单、成本低。
优选地，所述试剂盒还包括洗涤液、染色液或p16抗体包被固相载体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液。
优选地，所述洗涤液的pH为7~7.5，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为7~7.2。
优选地，所述染色液包括第一染色液和/或第二染色液。
优选地，所述第一染色液包括DAB染色液，由DAB底物、DAB底物缓冲液和DAB显色剂组成，其中，所述DAB底物的成分包括过氧化物酶葡聚糖聚合物、Tris/HCl、氯化钠、牛血清白蛋白、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、4-氨基安替比林、聚乙二醇（PEG3000）、酪蛋白和吐温-20，所述DAB底物的pH值为7.6；所述DAB底物缓冲液的成分包括咪唑、N,N'-乙基双(2-[2-羟基苯基]甘氨酸)（EDHPA）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40）、过氧化氢和氯化苯二甲烃铵，所述DAB底物缓冲液的pH为7.5；所述DAB显色剂由3,3二氨基联苯胺四氯化碳溶于80%丙二醇制成。
优选地，所述第二染色液包括苏木素染色液，所述苏木素染色液的配制方法包括：
在100份无水乙醇中溶解1份苏木素，并进行加热，得到溶液A；
在100份蒸馏水中溶解60 g明矾并加入100份甘油，再进行加热，得到溶液B；
将溶液A和溶液B混合，并加入10份冰醋酸，得到溶液C；
将溶液C暴露在空气和阳光中，持续3-4个星期，得到所述苏木素显色液。
优选地，所述p16抗体包括鼠抗人p16抗体或兔抗人p16抗体。
第二方面，本发明提供了一种p16免疫细胞化学染色方法，所述方法使用第一方面所述的试剂盒，包括：
（1）将细胞样本置于细胞保存液中保存；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于p16抗体包被固相载体上，孵育，加入洗涤液清洗；
（3）向固定有细胞样本的p16抗体包被固相载体上滴加封闭液，孵育，加入洗涤液清洗；
（4）向固定有细胞样本的p16抗体包被固相载体上滴加第一染色液，孵育，加入洗涤液清洗；
（4）向固定有细胞样本的p16抗体包被固相载体上滴加第二染色液；
（5）利用显微镜观察细胞样本的染色结果。
本发明中，利用第一方面所述的试剂盒进行细胞的化学染色，结果清晰可见，方便按照以下评分规则根据染色情况直接判读细胞样本：
i.当细胞核不规则且核膜皱缩时，判读为1分；
ii.当细胞核增大为正常参照细胞核的2倍以上时，判读为1分；
iii.当细胞染色质增粗和深染时，判读为1分；
iv.当细胞核浆比增大并接近1或大于1时，判读为2分；
v.当细胞核分裂时，判读为3分；
根据以上规则计算总分，若总分≤1分，则不进行临床处理；若总分为2分，则判断为宫颈上皮内低度病变（LSLL），并随访或转阴道镜；若总分≥3分，则转诊阴道镜。
优选地，步骤（1）所述保存的时间为不低于15 min。
本发明中，使用细胞保存液处理细胞样本不短于15 min，使p16抗原决定簇充分暴露，有利于提高免疫细胞化学染色效果。
优选地，步骤（2）所述孵育的温度为20~40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤（2）所述孵育的时间为10~30 min，例如可以是10 min、11 min、12min、13 min、14 min、15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min、21 min、22 min、23min、24 min、25 min、26 min、27 min、28 min、29 min或30 min。
优选地，步骤（3）所述孵育的温度为20~40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤（3）所述孵育的时间为10~30 min，例如可以是10 min、11 min、12min、13 min、14 min、15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min、21 min、22 min、23min、24 min、25 min、26 min、27 min、28 min、29 min或30 min。
优选地，所述细胞样本包括宫颈细胞样本。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的试剂盒在保存和/或染色细胞样本中的应用。
优选地，所述细胞样本包括宫颈细胞样本。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的试剂盒中细胞保存液的各组分相互配合发挥协同促进作用，显著减少了细胞样本的处理时间，在短时间内实现了修复p16抗原、提高细胞膜的通透性、促进p16抗体进入细胞结合p16的效果；
（2）本发明的试剂盒提高了免疫细胞化学染色的准确性，同时避免了假阴性发生；
（3）本发明的染色方法操作简便、染色效果好、易判读，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图2为实施例2的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图3为实施例3的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图4为实施例4的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图5为实施例5的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图6为实施例6的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图7为实施例7的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图8为实施例8的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图9为实施例9的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图10为实施例10的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图11为实施例11的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图12为实施例12的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图13为实施例13的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图14为实施例14的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图15为实施例15的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图16为实施例16的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图17为实施例17的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图18为实施例18的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图19为对比例1的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图20为对比例2的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图21为对比例3的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图22为对比例4的宫颈细胞样本的p16免疫细胞化学染色结果；
图23为第一例p16阳性宫颈细胞样本的p16细胞化学染色结果；
图24为第二例p16阳性宫颈细胞样本的p16细胞化学染色结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸3.5 mM、葡萄糖酸3.6 mM、山梨糖醇22 mM、氨基丁醇3 mM、多聚甲醛0.18 mM、PEG400 3.8 mM、NaCl 75 mM、KCl 12 mM和PBS缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.2；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉95 g/L、TritonX-100 16.8 g/L、proclin300 265 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.2；
染色液包括DAB染色液，其由DAB底物、DAB底物缓冲液和DAB显色剂组成，其中，所述DAB底物的成分包括过氧化物酶葡聚糖聚合物、Tris/HCl、氯化钠、牛血清白蛋白、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、4-氨基安替比林、聚乙二醇（PEG3000）、酪蛋白和吐温-20，所述DAB底物的pH值为7.6；所述DAB底物缓冲液的成分包括咪唑、N,N'-乙基双(2-[2-羟基苯基]甘氨酸)（EDHPA）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40）、过氧化氢和氯化苯二甲烃铵，所述DAB底物缓冲液的pH为7.5；所述DAB显色剂由3,3二氨基联苯胺四氯化碳溶于80%丙二醇制成；
苏木素显色液，配制方法为：
在100份无水乙醇中溶解1份苏木素，并进行加热，得到溶液A；
在100份蒸馏水中溶解60 g明矾并加入100份甘油，再进行加热，得到溶液B；
将溶液A和溶液B混合，并加入10份冰醋酸，得到溶液C；
将溶液C暴露在空气和阳光中，持续3-4个星期，得到所述苏木素显色液。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存1 h；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片上，37℃孵育20 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育20 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例2
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸4.2 mM、葡萄糖酸3.2 mM、山梨糖醇24.5 mM、氨基戊醇3 mM、多聚甲醛0.15 mM、PEG400 3.3 mM、NaCl 72 mM、KCl 13 mM和PBS缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.2；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉88 g/L、TritonX-100 18 g/L、proclin300270 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.0；
DAB染色液和苏木素显色液与实施例1相同。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存30 min；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片上，25℃孵育30 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育20 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例3
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸5 mM、葡萄糖酸4 mM、山梨糖醇20 mM、氨基丁醇4 mM、多聚甲醛0.1 mM、PEG400 3 mM、NaCl 80 mM、KCl 10 mM和PBS缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.2；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉100 g/L、TritonX-100 15 g/L、proclin300 280 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.2；
DAB染色液和苏木素显色液与实施例1相同。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存1 h；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片上，37℃孵育20 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育20 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例4
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸4 mM、葡萄糖酸3 mM、山梨糖醇25 mM、氨基戊醇2 mM、多聚甲醛0.1 mM、PEG400 4 mM、NaCl 70 mM、KCl 15 mM和PBS缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.2；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉80 g/L、TritonX-100 15 g/L、proclin300260 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.0；
DAB染色液和苏木素显色液与实施例1相同。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存30 min；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片上，25℃孵育30 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育20 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例5
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和兔抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸2 mM、葡萄糖酸5 mM、山梨糖醇15 mM、氨基丁醇5 mM、多聚甲醛0.2 mM、PEG400 5 mM、NaCl 50 mM、KCl 20 mM和PBS缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.2；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉50 g/L、TritonX-100 20 g/L、proclin300200 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.5；
DAB染色液和苏木素显色液与实施例1相同。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存1 h；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于兔抗人p16单克隆抗体包被玻片上，20℃孵育30 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育10 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例6
本实施例提供一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，所述试剂盒内含细胞保存液、封闭液、洗涤液、染色液和鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片。
其中，细胞保存液的各组分终浓度如下：氮基三乙酸10 mM、葡萄糖酸1 mM、山梨糖醇30 mM、氨基戊醇1 mM、多聚甲醛0.5 mM、PEG400 1 mM、NaCl 100 mM、KCl 10 mM和Tris缓冲液，所述细胞保存液的pH为7.5；
封闭液的各组分终浓度如下：脱脂奶粉150 g/L、TritonX-100 10 g/L、proclin300 300 g/L和PBS缓冲液，所述封闭液的pH为7.2；
洗涤液为PBS缓冲液，所述洗涤液的pH为7.2；
DAB染色液和苏木素显色液与实施例1相同。
使用该试剂盒对宫颈细胞样本进行免疫细胞化学染色，步骤如下：
（1）将取自同一供者的宫颈细胞样本置于细胞保存液中保存15 min；
（2）将经过细胞保存液保存的细胞样本置于鼠抗人p16单克隆抗体包被玻片上，40℃孵育10 min，利用细胞粘附剂将细胞样本制片，再利用洗涤液清洗；
（3）滴加封闭液，室温孵育30 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加DAB染色液，室温孵育5 min，加入洗涤液清洗；
（4）滴加苏木素显色液，室温孵育1~3 min；
（5）显微镜下观察细胞样本的染色结果。
实施例7
与实施例1相比，细胞保存液中氮基三乙酸的终浓度为4.2 mM，其他条件与实施例1相同。
实施例8
与实施例1相比，细胞保存液中氮基三乙酸的终浓度为7.3 mM，其他条件与实施例1相同。
实施例9
与实施例1相比，细胞保存液中氮基三乙酸的终浓度为8.5 mM，其他条件与实施例1相同。
实施例10
与实施例3相比，细胞保存液中葡萄糖酸的终浓度为3.5 mM，其他条件与实施例3相同。
实施例11
与实施例6相比，细胞保存液中葡萄糖酸的终浓度为4.5 mM，其他条件与实施例6相同。
实施例12
与实施例2相比，细胞保存液中山梨糖醇的终浓度为21.5 mM，其他条件与实施例2相同。
实施例13
与实施例2相比，细胞保存液中山梨糖醇的终浓度为18 mM，其他条件与实施例2相同。
实施例14
与实施例2相比，细胞保存液中山梨糖醇的终浓度为26 mM，其他条件与实施例2相同。
实施例15
与实施例5相比，细胞保存液中氨基丁醇的终浓度为4.5 mM，其他条件与实施例5相同。
实施例16
与实施例6相比，细胞保存液中氨基戊醇的终浓度为1.5 mM，其他条件与实施例6相同。
实施例17
与实施例5相比，细胞保存液中山梨糖醇的终浓度为10 mM，其他条件与实施例5相同。
实施例18
与实施例5相比，细胞保存液中氨基丁醇的终浓度为8 mM，其他条件与实施例5相同。
对比例1
与实施例1相比，细胞保存液的氮基三乙酸替换为相同终浓度的乙二胺四乙酸二钠，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，细胞保存液不含葡萄糖酸，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，细胞保存液不含山梨糖醇，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，细胞保存液的氨基丁醇替换为相同终浓度的丙三醇，其他条件与实施例1相同。
样本判读
按照以下判读规则，对实施例1~18、对比例1~4的细胞样本染色结果进行判读：
i.当细胞核不规则且核膜皱缩时，判读为1分；
ii.当细胞核增大为正常参照细胞核的2倍以上时，判读为1分；
iii.当细胞染色质增粗和深染时，判读为1分；
iv.当细胞核浆比增大并接近1或大于1时，判读为2分；
v.当细胞核分裂时，判读为3分；
根据以上规则计算总分，若总分≤1分，则不进行临床处理；若总分为2分，则判断为宫颈上皮内低度病变（LSLL），并随访或转阴道镜；若总分≥3分，则转诊阴道镜。
实施例1~6的染色结果见图1~6，宫颈细胞样本染色效果良好，其中实施例1~4的宫颈细胞较实施例5、6的宫颈细胞形态更完整、染色更清晰。实施例7~9的染色结果见图7~9，与实施例1相比，在2~10 mM范围内调节氮基三乙酸在细胞保存液中的终浓度，均得到清晰的染色结果。实施例10~11的染色结果见图10~11，细胞形态完整、边缘可见，其中实施例10的染色细胞较实施例11的染色结果稍显清晰。实施例12~14的染色结果见图12~14，与实施例2相比，在15~30 mM范围内调节山梨糖醇的终浓度，山梨糖醇与葡萄糖酸、氨基醇、PEG400等组分相互配合，一方面维持了细胞形态、另一方面使p16抗体与p16抗原结合，确保得到了较好的染色效果。实施例15~16的染色结果见图15~16，在1~5 mM范围内调节氨基丁醇或氨基戊醇的终浓度，基本不影响宫颈细胞样本的染色结果。实施例17~18的染色结果见图17~18，宫颈细胞的染色效果较好，仅少部分细胞发生破裂，但不影响结果判读。
对比例1~4的染色结果见图19~22。对比例1的细胞保存液使用乙二胺四乙酸二钠替代氮基三乙酸，与葡萄糖酸的配合效果不及氮基三乙酸，抗原未充分修复，染色清晰度受到影响；对比例2的细胞保存液不含葡萄糖酸，抗原未充分修复；对比例3的细胞保存液不含山梨糖醇，抗体未充分进入细胞结合抗原，大部分被清洗掉；对比例4的细胞保存液使用丙三醇替代氨基醇，发生一定程度的细胞成团现象。
进一步使用实施例1的试剂盒和染色方法，检测不同供者的宫颈细胞样本，在高倍镜下观察，如图1所示，细胞样本的细胞核未增大、形状规则、核仁及核未分裂，该细胞样本的评分为0；如图23所示，细胞样本的细胞核较正常细胞核更大、染色质增粗或深染，该细胞样本的评分为2分；如图24所示，细胞样本的细胞核较正常细胞核更大、染色质增粗或深染、且几乎无胞浆，该细胞样本的评分为4分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (34)
1.一种p16免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞保存液；
所述细胞保存液包括氮基三乙酸、葡萄糖酸、山梨糖醇、氨基醇、多聚甲醛、PEG400、NaCl、KCl和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氮基三乙酸在所述细胞保存液中的终浓度为2~10 mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氮基三乙酸在所述细胞保存液中的终浓度为2~5 mM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖酸在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖酸在所述细胞保存液中的终浓度为3~4 mM。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述山梨糖醇在所述细胞保存液中的终浓度为15~30 mM。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述山梨糖醇在所述细胞保存液中的终浓度为20~25 mM。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基醇包括氨基丁醇或氨基戊醇。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基醇在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基醇在所述细胞保存液中的终浓度为2~4 mM。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚甲醛在所述细胞保存液中的终浓度为0.1~0.5 mM。
12.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚甲醛在所述细胞保存液中的终浓度为0.1~0.2 mM。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG400在所述细胞保存液中的终浓度为1~5 mM。
14.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG400在所述细胞保存液中的终浓度为3~4 mM。
15.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NaCl在所述细胞保存液中的终浓度为50~100 mM。
16.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NaCl在所述细胞保存液中的终浓度为70~80 mM。
17.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述KCl在所述细胞保存液中的终浓度为10~20 mM。
18.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述KCl在所述细胞保存液中的终浓度为10~15 mM。
19.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。
20.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞保存液的pH为7~7.5。
21.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液包括脱脂奶粉、TritonX-100、proclin300和缓冲液。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述脱脂奶粉在所述封闭液中的终浓度为50~150 g/L。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述脱脂奶粉在所述封闭液中的终浓度为80~100 g/L。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述TritonX-100在所述封闭液中的终浓度为10~20 g/L。
25.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述TritonX-100在所述封闭液中的终浓度为15~20 g/L。
26.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述proclin300在所述封闭液中的终浓度为200~300 g/L。
27.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述proclin300在所述封闭液中的终浓度为260~280 g/L。
28.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
29.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、染色液或p16抗体包被固相载体中的任意一种或至少两种的组合。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液的pH为7~7.5。
31.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液包括第一染色液和/或第二染色液；
所述第一染色液包括DAB染色液；
所述第二染色液包括苏木素染色液。
32.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，所述p16抗体包括鼠抗人p16抗体或兔抗人p16抗体。
33.权利要求1-32任一项所述的试剂盒在保存和/或染色细胞样本中的应用。
34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，所述细胞样本包括宫颈细胞样本。
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2023
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