CN113876808A - 一种囊泡治疗与修复细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了该囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射0.5～4小时，向细胞上清中加入100～500μg/mL化疗药物DOX；将细胞置于37℃细胞培养箱中培养16～24小时；收集细胞上清，经4℃，600～4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，14000～15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；将上清经4℃，15000～17000g离心60‑70分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制。

Description

一种囊泡治疗与修复细胞的方法
技术领域
本发明涉及治疗与修复细胞技术领域，具体为一种囊泡治疗与修复细胞的方法。
背景技术
随着经济社会的发展，皮肤抗衰老越来越受到大众的关注。皮肤的衰老不仅表现在容貌上的老态，也会导致一系列的病态，如：皮肤干燥、皮肤屏障功能下降、皮肤肿瘤的发生等。因此，如何能有效的预防皮肤衰老已经成为整形修复科医生和皮肤科医生关注的热点问题。从病因上讲，皮肤衰老由内源性(遗传)因素和外源性(环境)因素决定。内源性衰老即为自然性衰老，是与年龄直接相关的退行性变化，而外源性衰老是机体皮肤受到暴露因素作用后的衰老，其中紫外线的照射为主要的暴露因素，其通过引起皮肤的损伤而导致衰老，相较于细胞治疗，细胞的胞外囊泡是无细胞组分，其应用有许多的优势：更加稳定、便于储存、避免了致瘤风险、异体应用无/低的免疫排斥，因此，提出一种囊泡治疗与修复细胞的方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种囊泡治疗与修复细胞的方法，具备以上等优点，解决了背景技术提出的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射0.5～4小时，向细胞上清中加入100～500μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养16～24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，600～4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，14000～15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，15000～17000g离心60-70分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
优选的，步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与1％-10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、10vt％-100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和10vt％-100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育1-4h。
优选的，步骤1)中紫外线强度为100～500J/m2。
优选的，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔。
优选的，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡。
优选的，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种囊泡治疗与修复细胞的方法，具备以下有益效果：
1、该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高。
2、该囊泡治疗与修复细胞的方法，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射0.5小时，向细胞上清中加入100μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养20小时；
3)收集细胞上清，经4℃，600g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，14000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，17000g离心65分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和10vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育1h，步骤1)中紫外线强度为100J/m2，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂，该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
实施例二：
一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射2小时，向细胞上清中加入100μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，600g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，14000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，15000g离心60分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、10vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和10vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育3h，步骤1)中紫外线强度为200J/m2，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂，该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
实施例三：
一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射4小时，向细胞上清中加入500μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，17000g离心70分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育1h，步骤1)中紫外线强度为100J/m2，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂，该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
实施例四：
一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射4小时，向细胞上清中加入500μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，17000g离心63分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育0.8h，步骤1)中紫外线强度为100J/m2，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂，该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
实施例五：
一种囊泡治疗与修复细胞的方法，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射4小时，向细胞上清中加入500μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，17000g离心70分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育0.6h，步骤1)中紫外线强度为100J/m2，6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔，不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡，检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂，该囊泡治疗与修复细胞的方法，解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高，揭示了细胞外囊泡预防皮肤成纤维细胞光损伤的机制，并且验证了其在动物体内的治疗效应。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将细胞密度为90％左右的细胞置于紫外线下照射0.5～4小时，向细胞上清中加入100～500μg/mL化疗药物DOX；
2)将细胞置于37℃细胞培养箱中培养16～24小时；
3)收集细胞上清，经4℃，600～4000g离心20分钟；弃去细胞沉淀，保留细胞上清，经4℃，14000～15000g离心2分钟，进一步去掉细胞碎片；
4)将上清经4℃，15000～17000g离心60-70分钟，保留底部载药的细胞外囊泡沉淀，经PBS重悬后洗涤，放置4℃储存备用；
5)将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡；
5)通过透射电镜观察胞外囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析计算胞外囊泡的平均直径；
6)将皮肤成纤维细胞接种在6孔板中，与不同浓度的胞外囊泡孵育24小时，去除培养液，按照试剂盒说明书将荧光试剂DCFH2-DA(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，去除试剂，然后用无血清的DMEM清洗3遍，消化下细胞进行流式分析，计算平均荧光强度，未消化的细胞在荧光显微镜下观察；
7)进行皮肤多功能成像仪检测大体皱纹情况，通过偏振光模式反应皮肤的厚度，3D粗糙度评估皮肤粗糙程度，并综合进行评分。
2.根据权利要求1所述的一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)中的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与1％-10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、10vt％-100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和10vt％-100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质于室温下密闭孵育1-4h。
3.根据权利要求1所述的一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，所述步骤1)中紫外线强度为100～500J/m2。
4.根据权利要求1所述的一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，所述6孔板的接种密度为1×105个细胞/孔。
5.根据权利要求1所述的一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，所述不同浓度的胞外囊泡包括浓度为100ug/mL的胞外囊泡和浓度为200ug/mL的胞外囊泡。
6.根据权利要求1所述的一种囊泡治疗与修复细胞的方法，其特征在于，所述检测细胞外囊泡的试剂盒包括封闭液、洗涤液或qPCR试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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