CN115895878A - 测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片、制作方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片、制作方法及应用,微电极阵列芯片包括:基板;微电极阵列,设置在基板,具有阵列间隔分布的多个微电极,每个所述微电极分别包括由下至上依次形成的粘附层、导电层和微柱;绝缘层,形成于基板和微电极阵列上,且露出所述微柱的上端;包被层,形成于所述绝缘层和微电极阵列上;琼脂糖薄膜,具有与微电极阵列相匹配的腔室阵列,贴附在包被层上,且每个微电极的针体的上端分别位于腔室内。本申请通过在微电极阵列芯片设置琼脂糖薄膜,使得所述微电极阵列芯片能在液相下对单个心肌细胞电信号进行长期、稳定的测量;并在基板上形成微柱,使得所述微电极阵列芯片具有高细胞耦合和信噪比。
Description
技术领域
本申请涉及在基片内或其上制造或处理的装置或系统,具体涉及测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片、制作方法及应用。
背景技术
心肌细胞是一种可兴奋细胞,在心脏中,自律细胞发出的电信号使心肌细胞产生动作电位,细胞膜电位的改变使心肌细胞发生收缩,随后心肌细胞发生复极化并进入舒张状态。动作电位可通过缝隙连接在不同心肌细胞之间进行传导,使多个心肌细胞具有一致的收缩节律,从而将血液从心脏输送到身体各部位。
心脏系统疾病发生率逐年上升,许多心脏系统疾病的潜在机制是未知的,这种知识的缺乏可能源于对单个心肌细胞的有限了解,因此,检测单个细胞之间的差异性有助于我们更好的了解心脏系统疾病的潜在机制。
现有的细胞电位检测技术主要有膜片钳、场效应晶体管、微电极阵列等。膜片钳技术是检测细胞电信号最有效的方法,可准确的检测胞内信号,被称为心肌细胞电信号检测的“金标准”,但是膜片钳技术操作复杂,对操作人员要求很高而且无法长时间测量细胞。场效应晶体管技术可以监测单细胞动作电位幅值和频率变化情况,并能反映药物刺激和电刺激对细胞是否有兴奋效应或抑制效应,但这种技术制备工艺复杂,成品率低,器件使用寿命短。平面微电极阵列芯片提供了一个无创的细胞-电极界面,允许在数天或数周内对细胞进行长期记录和刺激。但平面微电极阵列具有较低的细胞耦合和信噪比,在测量细胞膜电位特别是单个细胞的膜电位具有局限性。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种具有高细胞耦合和信噪比的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,采用的技术方案为:
一种测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,包括:
基板,
微电极阵列,设置在基板,具有阵列间隔分布的多个微电极,每个所述微电极分别包括由下至上依次形成的粘附层、导电层和微柱;
绝缘层,形成于基板和微电极阵列上,且露出所述微柱的上端;
包被层,形成于所述绝缘层和微电极阵列上;
琼脂糖薄膜,具有与微电极阵列相匹配的腔室阵列,贴附在包被层上,且每个微电极的针体的上端分别位于腔室内。
本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是:所述粘附层的材质为钛或铬,所述导电层和微柱的材质为金、铂、氮化钛或铟锡氧化物中的一种,所述绝缘层的材质为二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺或聚对二甲苯中的一种。
本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是:所述粘附层的厚度为5-14纳米,导电层的厚度为100-150纳米,绝缘层的厚度为500-1000纳米。
本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是:所述基板上设有12-64个圆形微电极,微电极的直径为10-30微米,间距为100-500微米;
微电极上存在1-9个微柱,微柱的直径为0.3-3微米,高度为0.3-3微米,相邻两个微柱之间的间距为3-7微米。
本申请还提出如上述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,其特征在于,包括:
步骤1、制作微电极阵列:清洗基板并用氮气吹干后,在基板上采用Lift-Off工艺制作粘附层和导电层;在基板上沉积绝缘层后涂布光刻胶,对光刻胶进行图形化曝光并用去离子水清洗并用氮气吹干后,对绝缘层进行蚀刻形成微孔,再在基板的表面覆盖电极材料,对光刻胶进行剥离后,导电层上在微孔内电极材料形成微柱,基板上形成微电极阵列;
步骤2、制作琼脂糖薄膜:制作母模,母模包括基底以及设置在基底上且与微电极阵列匹配的成型槽阵列,将PDMS和固化剂的混合液浇在母模上进行固化得到PDMS板,将固化后的PDMS板从母模上剥下,在PDMS板上覆盖载玻片,用移液管将液体琼脂糖移到载玻片边缘,液体琼脂糖通过毛细管力进入PDMS板和载玻片之间,使液体琼脂糖固化后得到具有腔室阵列的琼脂糖薄膜,取下载玻片,剥下琼脂糖薄膜;
步骤3、对微电极阵列和琼脂糖薄膜进行无菌化处理后,用蒸馏水冲洗琼脂糖薄膜,用聚赖氨酸包被微电极阵列,形成包被层,在基板上滴一滴蒸馏水,将琼脂糖薄膜的腔室阵列与微电极阵列对齐后贴在包被层上,形成具有单个细胞培养腔室的微电极阵列芯片。
本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是:所述步骤1中的微孔的直径为0.3-3微米。
本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是:所述腔室的长边大小为120-150微米,短边大小为15-30微米。
本申请还提出一种如上述测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的应用,导电层包括金属导线和接触点,将培养环粘接在所述微电极阵列结构的上方形成培养皿,微电极阵列和琼脂糖微孔都位于培养环内,所述接触点位于所述培养环外;
向培养皿内滴加心肌细胞培养液持续培养7-14天,将培养了心肌细胞的芯片与接口电路相连并接入电生理信号检测仪器中,记录心肌细胞的放电状况。
本发明的有益效果:
本申请通过在基板上形成微柱,使得所述微电极阵列芯片具有高细胞耦合和信噪比;
本申请通过在微电极阵列芯片设置琼脂糖薄膜,使得所述微电极阵列芯片能在液相下对单个心肌细胞电信号进行长期、稳定的测量。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本申请实施例1中微电极阵列芯片的剖视图;
图2为本申请实施例1中微电极阵列芯片的俯视图;
图3为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之一;
图4为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之二;
图5为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之三;
图6为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之四;
图7为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之五;
图8为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之六;
图9为本申请实施例2所述微电极阵列的制作流程示意图之七;
图10为本申请实施例2所述琼脂糖薄膜的制作流程示意图之一;
图11为本申请实施例2所述琼脂糖薄膜的制作流程示意图之二;
图12为本申请实施例2所述琼脂糖薄膜的制作流程示意图之三;
图13为本申请实施例3所述微电极阵列芯片步骤3的制作流程示意图之一;
图14为本申请实施例3所述微电极阵列芯片步骤3的制作流程示意图之二;
图15为本申请实施例3所述微电极阵列芯片步骤3的制作流程示意图之三。
具体实施方式
本部分将详细描述本发明的具体实施例,本发明之较佳实施例在附图中示出,附图的作用在于用图形补充说明书文字部分的描述,使人能够直观地、形象地理解本发明的每个技术特征和整体技术方案,但其不能理解为对本发明保护范围的限制。
在本发明的描述中,多个的含义是两个以上,大于、小于、超过等理解为不包括本数,以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
在本发明的描述中,需要理解的是,涉及到方位描述,例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
本发明中,除非另有明确的限定,“设置”、“安装”、“连接”等词语应做广义理解,例如,可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连;可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,还可以是一体成型;可以是机械连接;可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
实施例1
参照图1-2所示,提出本申请的实施例1,本实施例所述测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片包括:
基板1,
微电极阵列2,设置在基板1,具有阵列间隔分布的多个微电极,每个所述微电极分别包括由下至上依次形成的粘附层3、导电层4和微柱8;
绝缘层6,形成于基板1和微电极阵列2上,且露出所述微柱8的上端;
包被层7,形成于所述绝缘层6和微电极阵列2上;
琼脂糖薄膜8,具有与微电极阵列2相匹配的腔室阵列,贴附在包被层7上,且每个微电极的针体的上端分别位于腔室内;
接触点9,设置在基板1上并与微电极连接,所述接触点9用于连接外部放大器。
所述基板1上的微电极阵列设有12-64个圆形微电极,圆形微电极的直径为10-30微米,间距为100-500微米。每个所述圆形微电极上设有1-9个微柱,微柱直径为0.3-3微米,高度为0.3-3微米,当微电极上设有两个或以上的微柱时,相邻两个微柱之间的间距为3-7微米。
所述粘附层3的材质为钛或铬,厚度为5-14纳米;
所述导电层4的材质为金、铂、氮化钛或铟锡氧化物中的一种,厚度为100-150纳米;
所述绝缘层6的材质为二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺或聚对二甲苯中的一种,厚度为500-1000纳米;
所述微柱8的材质为金、铂、氮化钛或铟锡氧化物中的一种,高度为0.3-3微米。
实施例2
基于实施例1,本实施例提出上述测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,包括:
步骤1、制作微电极阵列2:清洗基板1并用氮气吹干后,在基板1上采用Lift-Off工艺制作粘附层3和导电层4;在基板1上沉积绝缘层6后涂布光刻胶,对光刻胶进行图形化曝光并用去离子水清洗并用氮气吹干后,对绝缘层6进行蚀刻形成微孔,再在基板1上沉积电极材料,对光刻胶进行剥离后在导电层上形成微柱,并在基板1上形成微电极阵列2,具体包括:
步骤a、将基板1用去离子水清洗,并用氮气吹干;
步骤b、参照图3a所示,在基板1上旋涂第一光刻胶层10,第一光刻胶层10的厚度为1μm,将基板1静置5min后加热至第一光刻胶层10固化,使用光刻机对第一光刻胶层10进行图形化曝光,曝光后放入显影液中显影60秒后如图3b所示,用去离子水清洗并用氮气吹干;
步骤c、采用溅射沉积的方式在基板1上溅射沉积粘附层3如图4a所示,再在粘附层3上溅射导电层4如图4b所示,用丙酮、异丙醇剥离第一光刻胶层10形成金属导线18和接触点19如图4c所示;
步骤d、使用等离子增强化学气相沉积PECVD在基板1上沉积绝缘层6如图5所示;
步骤e、在绝缘层上旋涂第二光刻胶层11如图6所示,第二光刻胶层11的厚度为9-12μm,将基板1静置5min后加热至第二光刻胶层11固化;
步骤f、使用光刻机对第二光刻胶层11进行图形化曝光,曝光后放入显影液中显影60秒后,用去离子水清洗并用氮气吹干,通过反应离子刻蚀法使用CHF3/CF4/O2混合气体选择性地去除绝缘层6并形成微孔如图7所示,微孔的直径为0.3-3微米,再用去离子水清洗并用氮气吹干;
步骤g、使用镀膜机在基板1上沉积电极材料,用丙酮、异丙醇剥离第二光刻胶层11,以使导电层4上在微孔内沉积的电极材料形成微柱5,并在基板1上形成微电极阵列2如图9所示。
步骤2、制作琼脂糖薄膜8:制作母模15,母模15包括基底以及设置在基底上且与微电极阵列2匹配的成型槽阵列,将PDMS和固化剂的混合液浇在母模15上进行固化得到PDMS板,将固化后的PDMS板从母模15上剥下,在PDMS板上覆盖载玻片,用移液管将液体琼脂糖移到载玻片边缘,液体琼脂糖通过毛细管力进入PDMS板和载玻片之间,将液体琼脂糖固化后得到具有腔室阵列的琼脂糖薄膜8,取下载玻片,剥下琼脂糖薄膜8,包括:
步骤h、在基底13上旋涂第三光刻胶14如图10a所示,用去离子水清洗并用氮气吹干,使用光刻机对第二光刻胶层11进行图形化曝光,曝光后放入显影液中显影60秒后,用去离子水清洗并用氮气吹干后在基底13上形成与微电极阵列2匹配的成型槽阵列,得到母模15如图10b所示;
将PDMS与固化剂以10∶1的比例混合,脱气后浇在母模15上如图11所示,在烘箱中在65℃的温度下烘烤1-3h固化形成PDMS板16;
将PDMS板16从母模15中剥下,在PDMS板16上覆盖载玻片17并与之形成空腔如图12a所示,用移液管将液体琼脂糖移到载玻片17边缘,液体琼脂糖通过毛细管力进入PDMS板16和载玻片17之间的空腔内,使液体琼脂糖固化后得到具有腔室阵列的琼脂糖薄膜8如图12b所示,轻轻取下玻璃盖载玻片17,小心剥下琼脂糖薄膜8,琼脂糖薄膜8的俯视图如图13所示。
步骤3、对微电极阵列2和琼脂糖薄膜8进行无菌化处理后,用蒸馏水冲洗琼脂糖薄膜8,用聚赖氨酸包被微电极阵列2,形成包被层7,在基板1上滴一滴蒸馏水,将琼脂糖薄膜8的腔室阵列与微电极阵列2对齐后贴在包被层7上,形成具有单个细胞培养腔室的微电极阵列芯片,具体为:
步骤i、用乙醇和去离子水的混合物对微电极阵列进行消毒,然后用聚赖氨酸浓缩蛋白质溶液进行包被并放置30-60min后形成包被层7如图14所示;
步骤j、将琼脂糖薄膜8在乙醇中灭菌,随后在蒸馏水中冲洗两次,在微电极阵列表面滴一滴蒸馏水,通过显微镜将琼脂糖薄膜12与涂有聚赖氨酸11的微电极阵列对齐,形成具有单个细胞培养腔室的微电极阵列芯片如图15所示。
实施例3
实施例3也提出了一种测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,与实施例2不同的在于,实施例3的步骤1中:
步骤e、在绝缘层上旋涂第二光刻胶层11如图6所示,第二光刻胶层11的厚度为0.3-3μm,将基板1静置5min后加热至第二光刻胶层11固化;
步骤f、使用光刻机对第二光刻胶层11进行图形化曝光,曝光后放入显影液中显影60秒后,用去离子水清洗并用氮气吹干,通过反应离子刻蚀法使用CHF3/CF4/O2混合气体选择性地去除绝缘层6并形成微孔如图7所示,微孔的直径为0.3-3微米,再用去离子水清洗并用氮气吹干;
步骤g、使用镀膜机在基板1上使用电化学工作站在基板1上电镀电极材料,用丙酮、异丙醇去除第二光刻胶层11,以使导电层4上在微孔内电镀的电极材料形成微柱5,并在基板1上形成微电极阵列2如图9所示。
实施例4
基于实施例1和实施例2所述的内容,本实施例提出一种如权利要求1所述测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的应用,包括:
导电层4包括金属导线18和接触点19,将培养环20粘接在所述微电极阵列结构的上方形成培养皿,微电极阵列和琼脂糖微孔都位于培养环内,所述接触点19位于所述培养环20外。
当然,本发明并不局限于上述实施方式,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出等同变形或替换,这些等同的变形和替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,其特征在于,包括:
基板(1),
微电极阵列(2),设置在基板(1),具有阵列间隔分布的多个微电极,每个所述微电极分别包括由下至上依次形成的粘附层(3)、导电层(4)和微柱(5);
绝缘层(6),形成于基板(1)和微电极阵列(2)上,且露出所述微柱(5)的上端;
包被层(7),形成于所述绝缘层(6)和微电极阵列(2)上;
琼脂糖薄膜(8),具有与微电极阵列(2)相匹配的腔室阵列,贴附在包被层(7)上,且每个微电极的针体的上端分别位于腔室内。
2.根据权利要求1所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,其特征在于,所述粘附层(3)的材质为钛或铬,所述导电层(4)和微柱(8)的材质为金、铂、氮化钛或铟锡氧化物中的一种,所述绝缘层(6)的材质为二氧化硅、氮化硅、氮氧硅、SU8、聚酰亚胺或聚对二甲苯中的一种。
3.根据权利要求1所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,其特征在于,所述粘附层(3)的厚度为5-14纳米,导电层(4)的厚度为100-150纳米,绝缘层(6)的厚度为500-1000纳米。
4.根据权利要求1所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片,其特征在于,所述基板(1)上设有12-64个圆形微电极,微电极的直径为10-30微米,间距为100-500微米;
微电极上存在1-9个微柱,微柱的直径为0.3-3微米,高度为0.3-3微米,相邻两个微柱之间的间距为3-7微米。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,其特征在于,包括:
步骤1、制作微电极阵列(2):清洗基板(1)并用氮气吹干后,在基板(1)上采用Lift-Off工艺制作粘附层(3)和导电层(4);在基板(1)上沉积绝缘层(6)后涂布光刻胶,对光刻胶进行图形化曝光并用去离子水清洗并用氮气吹干后,对绝缘层(6)进行蚀刻形成微孔,再在基板(1)的表面覆盖电极材料,对光刻胶进行剥离后,导电层(4)上在微孔内的电极材料形成微柱(5),基板(1)上形成微电极阵列(2);
步骤2、制作琼脂糖薄膜(8):制作母模(15),母模(15)包括基底以及设置在基底上且与微电极阵列(2)匹配的成型槽阵列,将PDMS和固化剂的混合液浇在母模(15)上进行固化得到PDMS板,将固化后的PDMS板(16)从母模(15)上剥下,在PDMS板上覆盖载玻片(17),用移液管将液体琼脂糖移到载玻片(17)边缘,液体琼脂糖通过毛细管力进入PDMS板(16)和载玻片(17)之间,使液体琼脂糖固化后得到具有腔室阵列的琼脂糖薄膜(8),取下载玻片,剥下琼脂糖薄膜(8);
步骤3、对微电极阵列(2)和琼脂糖薄膜(8)进行无菌化处理后,用蒸馏水冲洗琼脂糖薄膜(8),用聚赖氨酸包被微电极阵列(2),形成包被层(7),在基板(1)上滴一滴蒸馏水,将琼脂糖薄膜(8)的腔室阵列与微电极阵列(2)对齐后贴在包被层(7)上,形成具有单个细胞培养腔室的微电极阵列芯片。
6.根据权利要求5所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,其特征在于,所述步骤1中的微孔的直径为0.3-3微米。
7.根据权利要求5所述的测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的制作方法,所述腔室的长边大小为120-150微米,短边大小为15-30微米。
8.一种如权利要求1所述测量单个细胞电信号的微电极阵列芯片的应用,其特征在于:
导电层(4)包括金属导线(18)和接触点(19),将培养环(20)粘接在所述微电极阵列结构的上方形成培养皿,微电极阵列和琼脂糖微孔都位于培养环内,所述接触点(19)位于所述培养环(20)外;
向培养皿内滴加心肌细胞培养液持续培养7-14天,将培养了心肌细胞的芯片与接口电路相连并接入电生理信号检测仪器中,记录心肌细胞的放电状况。
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