CN115894617A

CN115894617A - 一种多肽化合物及其应用

Info

Publication number: CN115894617A
Application number: CN202211380369.0A
Authority: CN
Inventors: 关雨晴; 孟广鹏; 袁瑜; 李元波; 黄波
Original assignee: Chengdu Nuohe Shengtai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Nuohe Shengtai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-04
Filing date: 2022-11-04
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了一种多肽化合物及其应用，属于药物技术领域。本发明提供的多肽化合物，其结构如式I所示。本发明提供了一种组合物，包括该多肽化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供了该多肽化合物或其药学上可接受的盐，或组合物在制备治疗或预防CaSR受体相关疾病的药物中的应用。本发明的多肽化合物化合物用于治疗或预防CaSR受体相关疾病，具有更好的药效和安全性。

Description

一种多肽化合物及其应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种多肽化合物及其应用。

背景技术

人的CaSR(钙敏感受体)属于GPCR(G蛋白偶联受体)超家族C家族，是一个由1078个氨基酸组成的二聚体细胞表面蛋白。其蛋白结构共有3个结构域，每个单体都包含胞外结构域(ECD)(由捕蝇草结构域(VFT)和半胱氨酸结构域(CRD)组成)、七次跨膜结构域(7TM)以及胞内C-tail三部分。CaSR能够监控包括阳离子、氨基酸、某些抗生素等在内的多种信号分子。Ca²⁺结合在两叶间的裂缝，进而通过与跨膜结构域和膜内结构域相互作用激活多种细胞内信号通路。CaSR在体内广泛分布，如甲状腺、甲状旁腺、肾脏、骨骼、胃肠道、脑、心脏、血管等组织中都有广泛地表达，对于机体钙稳态的维持、细胞的增殖分化、多种内分泌激素的释放、癌症的发生发展等生理病理过程具有重要的调节作用。

甲状旁腺(PTGs)分泌的PTH是矿物质稳态的重要调节因子。维生素D缺乏、佝偻病和慢性肾病(CKD)均可引起血清PTH水平升高。在CKD中，继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)是进行性肾功能不全早期发生的一种常见疾病，作为一种有助于维持体内矿物质平衡的适应性机制。SHPT可导致磷酸潴留、高磷血症、PTH水平升高、成纤维细胞生长因子23(FGF23)升高以及随后的1,25-二羟基维生素(1,25(OH)2D)缺乏、低钙血症、肠道钙吸收不良以及钙敏感受体(CaSR)和维生素D受体(VDR)在PTGs中的表达降低。CaSR和VDR被认为是CKD中甲状旁腺功能的主要决定因素。CaSR可直接调节PTH的分泌，而CaSR和VDR信号通路均可影响PTH前基因转录、PTH mRNA表达和甲状旁腺增生。

通过模拟钙变构结合并激活甲状旁腺表达的CaSR，进而抑制PTH的合成和分泌，从而有效降低PTH水平，降低血清钙和磷水平。专利CN102711789B、WO2021115272A1报道了具有CaSR激动活性的多肽类药物，其中已上市的Etelcalcetide(维拉卡肽)，其结构式如下所示：

Etelcalcetide以及类肽等化合物可以与CaSR结合，产生激动活性，引起信号转导，从而调节PTH的分泌，但在临床开发上具有一定的局限性，比如剂量大、会引起低钙血症、恶心和呕吐等副作用。因此，开发具有活性高、剂量小以及低毒副作用低的结构是CaSR受体激动剂的研究目标。

在保留或提高多肽的生理活性的同时，改善多肽的稳定性，是行之有效的药物开发策略之一。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种多肽化合物，作为CaSR受体激动剂具有良好的活性。

本发明的目的之二在于，提供该多肽化合物的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的式I所示的多肽化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：

其中，R¹独立地选自氢，氘，非环状取代的或未经取代的脂族基团，取代的或未经取代的脂环基或OH；

R^a、R^b各独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基，环烷基烷基、杂环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基、对硝基苯磺酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙基氧羰基、C1～C8烷氧羰基、C1～C8酰基、三氟乙酰基、芳基甲酰基、三苯甲基、苄基、2,4-二甲氧基苄基或对甲氧基苄基；

R^c、R^d、R^e、R^f、R^g、R^h、Rⁱ、R^l、R^o、R^p各独立地选自氢原子或C1～C10烷基；

R^q为CONR’R”；其中R’，R”各独立地选自氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基；

J独立地选自S，Se或S＝O；

Q独立地选自氢，氘，非环状取代的或未经取代的脂族基团，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸，谷胱甘肽，N-乙酰化半胱氨酸、高半胱氨酸，PEG化半胱氨酸或L-硒代半胱氨酸；

F，K和U各自独立地选自

其中m₀为0，1或2；R²各自独立地选自以下任一结构：

其中，m₁，m₂，m₃，m₄独立地选自0，1或2；

X选自以下任一结构：

其中R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹独立地选自氢、氘、C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、芳基或杂芳基；

X¹选自取代的或未经取代的胍基；

Y选自氢、氘、C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、芳基或杂芳基；

Z，Z¹和Z²独立地选自CR¹⁰，N；其中R¹⁰选自氢、氘、C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、芳基或杂芳基；

G和W各自独立地选自

其中n₀为0，1或2；R¹¹各自独立地选自以下任一结构：

或R¹¹选自氢，氘，C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、取代的或未经取代的芳基、取代的或未经取代的杂芳基；R¹¹中的m₁、m₂、m₄、X、Y、Z、Z¹和Z²的定义同R²中的m₁、m₂、m₄、X、Y、Z、Z¹和Z²的定义；

E、K、U、G、W至多有3个为精氨酸，至少有一个为非天然的氨基酸。

本发明的部分实施方案中，所述R¹选自氢，氘，OH；

所述J选自S，Se；

Q选自L-半胱氨酸。

本发明的部分实施方案中，所述E，K和U独立地选自

其中R2各自独立地选自以下任一结构：

其中，R¹²-R²³各自独立地选自氢，氘，C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、取代的或未经取代的芳基、取代的或未经取代的杂芳基。

本发明部分实施方案中，所述G和W各自独立地选自

其中R¹¹各自独立地选自以下任一

结构：

其中，R²⁴-R⁴⁰各自独立地选自氢，氘，C_1-6烷基、卤素、氨基、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧羰基、取代的或未经取代的芳基、取代的或未经取代的杂芳基。

本发明部分实施方案中，选自以下任一化合物：

本发明提供的一种组合物，包括上述的多肽化合物、其异构体或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。

本发明中所述的“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

本发明上述组合物中，多肽化合物可以单独存在，或两种及两种以上混合存在，或通过复合、结晶或离子键合或共价键合更紧密地缔合。

本发明提供的多肽化合物C端的氨基酸残基中刚性结构或柔性结构的大小对于维持序列中肽键的构型至关重要，进而，本发明通过在序列C端进行不同结构类型官能团的引入，使多肽化合物可以有效地与CaSR结合，并适合治疗由CaSR介导的紊乱所致相关疾病。

本发明提供的上述多肽化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，或上述组合物在制备治疗或预防CaSR受体相关疾病的药物中的应用。

本发明的部分实施方案中，所述CaSR受体相关疾病包括继发性甲状旁腺功能亢进。

本发明所述的多肽化合物或其药学上可接受的盐的制备方法可参照现有技术进行，比如用固相肽合成方法[Stewart J.M.y Young J.D.,“Solid Phase PeptideSynthesis,2nd edition”,(1984),Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois；Bodanzsky M.y Bodanzsky A.,“The practice of Peptide Synthesis”,(1994),Springer Verlag,Berlin；Lloyd Williams P.et al.,“Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins”,(1997),CRC,Boca Raton,FL,USA],溶液中的合成。

仅作为示例，获得本发明的多肽化合物或其药学上可接受的盐可以包括下述阶段：

-将N-末端保护的和C-末端游离的氨基酸与N-末端游离的和C-末端保护或结合至固体载体的氨基酸偶联；

-消除保护N-末端的基团；

-重复偶联程序并且消除保护N-末端的基团直至获得所希望的肽序列；

-消除保护C-末端的基团或裂解固体载体；

优选地，C-末端结合至固体载体并且该过程在固相中进行，因此包括将N-末端保护的和C-末端游离的氨基酸与N-末端游离的和C-末端结合至聚合物载体的氨基酸偶联；消除保护N-末端的基团；和按必要次数重复该程序以获得所希望长度的化合物，最终随后从最初的聚合物载体的裂解合成的化合物。

在整个合成当中，氨基酸侧链的官能团保持用暂时或永久保护性基团方便地保护，并且能够与从聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。

另选地，固相合成能够用会聚策略进行：将肽与聚合物载体偶联或者与预先结合至聚合物载体的肽或氨基酸偶联。会聚合成策略是本领域技术人员广泛已知的并且描述于Lloyd-Williams P.et al.,“Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis”,(1993),Tetrahedron,49(48),11065-11133。

在采用现有技术已知的标准程序和条件的情况下，本发明过程能够以无差别顺序包括额外的C-末端脱保护和/或从聚合物载体裂解肽的阶段；在此之后这些末段官能团能够加以修饰。在式(I)所示多肽化合物固定至聚合物载体时或一旦多肽化合物已从聚合物载体分开，则能够进行C-末端的任选修饰。

任选地和/或额外地，R₁残基能够这样引入：在适当溶剂和碱比如N,N-二异丙基乙胺(DIEA)或三乙胺或添加剂比如1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-羟基氮杂苯并三唑(HOAt)和脱水剂比如碳二亚胺、脲鎓盐、鏻盐或脒鎓盐等存在下，将化合物HR₁，其中R₁是-OR₂、-NR₂R₃或-SR₂，与互补片段相应于式I化合物发生反应，其中R₁是-NH₂；或者通过先将互补片段相应于式I化合物与例如亚硫酰氯预先形成酰卤，再与HR₁发生反应，由此获得化学式I的根据本发明的肽，其中片段具有并不牵涉于N-C键形成中官能团用暂时或永久保护性基团加以适宜保护；或者另选地其它R₁残基可以通过同时掺入肽从聚合物载体裂解的过程来引入。

本领域技术人员会容易地理解C-末端和N-末端的脱保护/裂解步骤和它们随后的衍生化能够根据现有技术已知的过程以不同顺序进行。

本发明中，所述术语“保护性基团”涉及阻塞有机官能团的和能够在受控条件下除去的基团。保护性基团、它们的相对反应性和它们保持惰性的条件是本领域技术人员已知的。

氨基基团的代表性保护性基团的实例尤其是酰胺乙酸酯，酰胺苯甲酸，酰胺特戊酸脂；氨基甲酸酯类比如苄氧基羰基(Cbz或Z)，2-氯苄基(CIZ)，对-硝基苄氧基羰基(pNZ)，叔丁氧基羰基(Boc)，2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)，2-(三甲基甲硅烷基)乙基氧基羰基(Teoc)，9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)或烯丙基氧基羰基(Alloc)，三苯甲基(Trt)，甲氧基三苯甲基(Mtt)，2,4-二硝基苯基(Dnp)，N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亚环己基)-3-甲基丁基(ivDde)，1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙氧基羰基(Adpoc)，优选Alloc或Fmoc。

羧基基团代表性保护性基团的实例是酯，比如叔丁基酯(^tBu)，烯丙基酯(All)，三苯基甲基酯(Trt)，环己基酯(cHx)，苄基酯(Bzl)，邻硝基苄基酯，对硝基苄基酯，对甲氧基苄基酯，三甲基甲硅烷基乙基酯，2-苯基异丙基酯，芴基甲基酯(Fm)，4-(N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亚环己基)-3-甲基丁基]氨基)苄基酯(Dmab)，优选All，^tBu或Trt酯。

胍基基团代表性保护性基团的实例是(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基(Pbf)，Boc。

巯基基团代表性保护性基团的实例是Trt，甲氧基三苯甲基(Mmt)，甲基三苯甲基(Mtt)。

在优选实施方式中，所用的保护性基团策略是如下的策略：氨基基团通过Boc保护，羧基基团通过Bzl、cHx或All保护，精氨酸侧链通过Pbf保护，4-氨基-4-哌啶甲酸侧链的哌啶基团通过Fmoc保护，半胱氨酸侧链通过Trt或Mmt保护。

在又一优选的实施方式中，所用的保护性基团策略是如下的策略：氨基基团通过Fmoc保护，羧基基团通过tBu、All或Trt酯保护，精氨酸侧链通过Pmc或Pbf保护，4-氨基-4-哌啶甲酸侧链的哌啶基团通过Boc保护，色氨酸侧链通过Boc保护或未加保护地使用，并且胍基侧链通过Boc或Pbf保护。

这些和其它保护性基团的实例，它们的引入和除去，能够参考文献[AthertonB.and Sheppard R.C.,“Solid Phase Peptide Synthesis:A practical approach”,(1989),IRL Oxford University Press]。术语“保护性基团”也包括固相合成中的聚合物载体。

在合成完全或部分发生在固相中的情况下，用于本发明过程中的可能固体载体涉及聚苯乙烯载体，接枝至聚苯乙烯的聚乙二醇等，比如且不限于对甲基二苯甲基桉树酯(MBHA)[Matsueda G.R.et al.,“A p-methyl benzhydrylamine resin for improvedsolid-phase synthesis of peptide amides”,(1981),Peptides,2,4550],2-氯三苯甲基树脂[Barlos K.et al.,“Darstellung geschützter PeptidFragmente unter Einsatzsubstituierter Triphenylmethyl Harze”,(1989),Tetrahedron Lett.,30,3943-3946；Barlos K.et al.,“Veresterung von partiell geschützten PeptidFragmenten mitHarzen Einsatz von 2-Chlorotritylchlorid zur Synthese von LeulGastrin I”,(1989),Tetrahedron Lett.,30,39473951]，

树脂(Rapp Polymere GmbH)，

树脂(Matrix Innovation,Inc)等，其可以包括或可以不包括不稳定连接体，比如5-(4-氨甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL)[Albericio F.et al.,“Preparationand application of the5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5-dimethoxy-phenoxy)valeric acid(PAL)handle for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides under mild conditions”,(1990),J.Org.Chem.,55,3730-3743]，2-[4-氨甲基-(2,4-二甲氧基苯基)]苯氧基乙酸(AM)[Rink H.,“Solid-phasesynthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin”,(1987),Tetrahedron Lett.,28,3787-3790],Wang[Wang S.S.,“p-Alkoxybenzyl Alcohol Resin and p-Alkoxybenzyl oxycarbonylhydrazide Resin forSolid Phase Synthesis of Protected Peptide Fragments”,(1973),J.Am.Chem.Soc.,95,1328-1333]等，其使得可以同时脱保护和从聚合物载体裂解肽。

定义

在本发明中使用的缩写具有下面的含义：

Ala(Alanine，A)丙氨酸

Abu(2-aminobutyric acid)2-氨基丁酸

Arg(Arginine,R)精氨酸

Boc(butyloxycarboryl)叔丁氧羰基

Cys(Cysteine)半胱氨酸

DCM(Dichloromethane)二氯甲烷

DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)N,N-二异丙基乙胺

DMF(N,N-Dimethylformamide)N,N-二甲基甲酰胺

Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)芴甲氧羰基

Gly(Glycine，G)甘氨酸

HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetraMethyl-uroniuM-hexafluorophosphate)O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯

HOBt(N-Hydroxybenzotrizole)1-羟基苯并三唑

HPLC(High performance liquid chromatography)高效液相色谱

Lys(Lysine,K)赖氨酸

MTBE 甲基叔丁基醚

PG 保护基

TFA(Trifluoroacetic acid)三氟乙酸

如本文所定义的，术语“多肽”，“肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且可以被非氨基酸的化学部分打断。该术语还包括已被天然或人工修饰(例如二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合)的氨基酸聚合物。术语“肽”包括通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个天然存在的或合成的氨基酸。

在本公开内容的上下文中，术语“氨基酸”被定义为具有至少一个伯、仲、叔或季氨基和至少一个酸基，其中酸基可以是羧酸、磺酸或磷酸或其混合物。氨基相对于酸基可以是“α”、“β”、“γ”至“ω”。合适的氨基酸包括但不限于在肽中发现的20种常见天然存在的氨基酸(例如丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，缬氨酸)的D-和L-异构体以及通过有机合成或其他代谢途径制备的天然存在的和非天然存在的氨基酸。

“氨基酸的主链”可以被选自卤素、羟基、胍基、杂环基团的一个或多个基团取代。因此术语“氨基酸”在其范围内还包括甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，组氨酸，牛磺酸，甜菜碱，N-甲基丙氨酸等。(L)和(D)形式的氨基酸被包括在内。

术语“氨基酸侧链”是指连接至氨基酸的α-碳的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯基甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫代甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。还包括其他非天然存在的氨基酸侧链，例如天然存在的(例如氨基酸代谢物)或合成制备的(例如α-取代的氨基酸)。

如本文所用，术语“非环状脂族基团”涵盖线性或支化的烷基，烯基和炔基基团。

术语“烷基”是指线性或支化的饱和基团，其具有1至24，优选1至16，更优选1至14，甚至更优选1至12，还更优选1、2、3、4、5或6个碳原子和通过简单键结合至分子其余部分，包括例如且不限于，甲基，乙基，异丙基，异丁基，叔丁基，庚基，辛基，癸基，十二烷基，月桂基，十六烷基，十八烷基，戊基，2-乙基己基，2-甲基丁基，5-甲基己基等。

术语“脂环基基团”在本发明中用于涵盖例如且不限于环烷基或环烯基或环炔基基团。

术语“环烷基”是指饱和的单环或多环脂族基团，其具有3至24，优选3至16，更优选3至14，甚至更优选3至12，还更优选3、4、5或6个碳原子并且通过简单键结合至分子其余部分，包括例如且不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，甲基环己基，二甲基环己基，八氢茚，十氢萘，十二氢非那烯等。

术语“芳基基团”是指芳族基团，其具有6至30，优选6至18，更优选6至10，还更优选6或10个碳原子，其包含1、2、3或4个芳族环，通过碳-碳键结合或稠合，包括例如且不限于苯基，萘基，二苯基，茚基，菲基或蒽基等；或者芳烷基基团。

术语“芳烷基”是指被芳族基团取代的烷基，具有7至24个碳原子和包括例如且不限于-(CH₂)_1-6-苯基、-(CH₂)_1-6-(1-萘基)、-(CH₂)_1-6-(2-萘基)、-(CH₂)_1-6-CH(苯基)₂以及类似物。

术语“杂环基基团”是指3-10元的烃化的环，其中环中原子的一个或多个，优选环中原子的1、2或3个是不同于碳的元素比如氮、氧或硫，并且可以是饱和或不饱和的。出于本发明意图，杂环能够是单环、双环或三环系统，其可以包括稠环系统；和残基杂环中的氮、碳或硫原子可以被任选地氧化；氮原子可以被任选地季铵化；和残基杂环基可以是部分或完全饱和的或是芳族的。术语杂环基最优选是指5或6元环。饱和的杂环基基团的实例是二噁烷，哌啶，哌嗪，吡咯烷，吗啉和硫吗啉。芳族杂环基基团，也称为杂芳族基团的实例是吡啶，吡咯，呋喃，噻吩，苯并呋喃，咪唑啉，对苯二酚，喹啉和萘啶。

术语“杂芳基烷基基团”是指被取代的或未经取代的芳族杂环基基团取代的烷基，烷基具有1至6个碳原子和芳族杂环基基团具有2至24个碳原子和1至3个非碳的原子，并且包括例如且不限于-(CH₂)_1-6-咪唑基、-(CH₂)_1-6-三唑基、-(CH₂)_1-6-噻吩基、-(CH₂)_1-6-呋喃基、-(CH₂)_1-6-吡咯烷基等。

本文使用的术语“卤素”或变体如“卤化物”或“卤代”是指氟，氯，溴和碘。

如本文所用的术语“杂原子”或变体如“杂-”是指O、N、NH、S和Se。

如本文所用的术语“烷氧基”是指直链或支链烷氧基。实例包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，叔丁氧基等。

如本文所用的术语“氨基”是指-NR_aR_b形式的基团，其中R_a和R_b独立地选自包括但不限于氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基的组。

应理解，如本文所述的本发明的化合物均可被任何数目的取代基或官能团部分取代。通常，术语“(经)取代(的)”(无论其是否在术语“任选地”之后)和含于本发明的式中的取代基都是指用指定取代基的基团对给定结构中的氢基的替代。当任何给定结构中的超过一个位置可被超过一个选自指定基团的取代基取代时，所述取代基在每个位置可相同或不同。如本文所用的术语“经取代的”预期包括用有机化合物的所有可允许取代基、本文所述的任何取代基进行的取代。

例如，取代基包括但不限于导致形成稳定部分的以下基团：脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫羰基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇基和卤代以及它们的任何组合，包括但不限于以下基团：脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等。本发明涵盖任何和所有的此类组合以得到稳定的取代基/部分。出于本发明的目的，例如氮的杂原子可具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价并且导致形成稳定部分的如本文所述的任何合适的取代基。

化合物可含有一个或多个不对称中心，因此以外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、个体非对映异构体和非对映异构体混合物存在。本文明确包括这些化合物的所有这些异构形式。化合物也可以以多种互变异构形式表示，在这种情况下，本文明确地包括本文所述的化合物的所用互变异构形式(例如，环体系的烷基化可导致多个位点的烷基化，本文明确地包括所有这样的反应产物)。本文明确地包括了这种化合物的所有这些异构形式。本文明确包括在此描述的化合物的所有晶体形式。

本发明化合物能够作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，构成它们的氨基酸能够相互独立地具有构型L-、D-或外消旋。因此，可能的是，获得异构混合物以及外消旋混合物或非对映体的混合物，或纯的非对映体或对映体，取决于不对称碳的数目和异构体或异构混合物所存在的不对称碳。本发明化合物的优选结构纯异构体，也即对映体或非对映体。

本发明的肽的药学上可接受的盐也属于本发明的领域之内。术语“药学上可接受的盐”意指其在动物中和更特别地在人类中的用途得到承认的盐，并且包括用以形成碱加成盐的盐，无论它们是无机盐还是有机盐，无机盐比如且不限于锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等，或有机盐比如且不限于乙胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪等；或者酸加成盐，无论它们是有机盐还是无机盐，有机盐比如且不限于乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，丙二酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，苯甲酸，天冬氨酸盐，谷氨酸盐，琥珀酸盐，油酸酯，三氟乙酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐或葡糖酸盐等，或无机盐比如且不限于盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，硼酸盐或碳酸盐等。盐的性质不是关键，条件是它是化妆上或药学上可接受的。本发明肽的药学上可接受的盐能够通过现有技术中熟知的常规方法获得(BergeS.M.等人，“Pharmaceutical Salts”,(1977),J.Pharm.Sci.,66,119，其通过引用整体并入本文)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的多肽化合物及其异构体对CaSR表现出优异的激动活性，且具有良好的安全性。试验表明，本发明的多肽化合物对CaSR的激动活性优于Etelcalcetide。

本发明的多肽化合物化合物用于治疗或预防CaSR受体相关疾病，具有更好的药效和安全性。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的多肽化合物及其应用进行详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的多肽合成采用标准的Fmoc固相方法。选用Rink Amide树脂，肽链由C端向N端延长。缩合剂为HBTU/HOBt/DIEA或HOBt/DIC。脱保护试剂为哌啶/DMF溶液。粗肽水溶解后冻干保存。用中压液相色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分离纯化，纯肽含量大于90％。基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确定肽序列分子量。

肽序列的合成：

合成条件一如下：

保护氨基酸(天然或非天然)：0.2M的DMF溶液，

缩合剂：0.45M HBTU/HOBt的DMF溶液，

活化碱：2M DIEA的DMF溶液，

脱保护试剂：20％v/v哌啶的DMF溶液。

合成条件二如下：

保护氨基酸(天然或非天然)：0.2M的DMF溶液，

缩合剂：0.45M HOBt/DIC的DMF溶液，

脱保护试剂：20％v/v哌啶的DMF溶液。

非天然氨基酸的合成条件三如下：

化合物A(1mmol)在氢气氛围(1atm)下，利用钯碳(50mg，含量10％)氢化，反应4-8h，过滤浓缩得到化合物B，直接用于下一步反应。化合物B(1mmol)与N,N'-二-Boc-1H-1-胍基吡唑(1.2mmol)在甲醇(10mL)中反应过夜，浓缩，经柱层析纯化得到化合物C(0.8mmol)。

非天然氨基酸的合成条件四如下：

化合物D(1mmol)经锌粉活化得到有机锌试剂E，经标准的Negishi偶联反应操作，在氮气氛围下，冰浴，加入无水DMF(1mL)，加入催化剂Pd₂dba₃(22mg，0.025mmol)和SPhos(21mg，0.05mmol)，随后加入溴代物(1.3mmol)，缓慢恢复室温，加热至50℃，反应4-8h，经柱层析纯化得到化合物F(0.85mmol)。化合物F(0.85mmol)在氢氧化锂(0.85mmol)作用下水解，反应2-4h，经DCM萃取，浓缩得到的粗品直接与N,N'-二-Boc-1H-1-胍基吡唑(1.1mmol)反应，经柱层析纯化得到化合物G(0.65mmol)。

实施例1

本实施例公开了化合物003-007，013-033，035，109-139的制备方法，其合成路线如下：

具体的合成步骤为：

1.树脂溶胀：向100mL合成管中加入Rink-Amide Resin树脂(0.46g，0.3mmol，1.0equiv.)，再加入DMF(10mL)氮气充搅30min，使树脂充分溶胀，抽干溶剂，活化待用。

2.脱保护：向充分溶胀的树脂中加入脱Fmoc试剂(20％的哌啶/DMF溶液，v/v)，8mL/次，氮气充搅反应10min～15min/次，反应2次。取样树脂，用茚三酮显色剂(5g茚三酮/100mL乙醇)于110℃显色3min～5min，反应完全，抽干溶剂，用DMF(10mL)洗涤树脂6次，直接投下一步反应。

3.缩合反应：在冰浴条件下分别将氨基酸，缩合剂加入DMF活化，再加入活化碱反应获得活化液，最后将活化液加入树脂中，室温条件下反应后，用5％的茚三酮显色试剂使树脂显色，树脂变色，抽干溶剂并用DMF洗涤，检测合格后抽干溶剂，此时缩合反应完全。

4.重复上述脱保护和缩合反应直到肽链合成结束，得到包含完整多肽序列结构的肽树脂。

5.肽树脂的封端：取乙酸酐(61.3mg，0.6mmol，2equiv.)，DMF(2mL)，DIEA(77.5mg，0.6mmol，2equiv.)，混合均匀后倒入多肽合成管中，氮气充搅反应30min，抽干溶剂，用DMF洗涤树脂6次。用茚三酮显色剂显色，反应完全。

6.肽树脂的裂解：称取合成好的肽树脂0.80g，放入250ml茄形瓶中，冰浴，电磁搅拌。按1g肽树脂加入10mL的量配制裂解液(裂解液(体积百分比)：【三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯甲硫醚：水＝90：2.5：2.5：5】)。TFA需预先冰浴降温30min或者预先存放于冰箱中使用；将配好的裂解液加入到冰浴条件下的肽树脂中，电磁搅拌，冰浴条件下反应30min，然后缓慢恢复室温，室温下继续搅拌反应180min，反应完成。将上述反应液加入到60mL的冷异丙醚中沉降，离心洗涤得淡黄色固体0.24g。

7.粗肽的纯化：粗肽用中压或高效液相色谱进行纯化。色谱柱为C18柱，洗脱剂为乙腈，水和少量盐酸。具体操作步骤：称取粗肽0.20g，加水4mL，乙腈1mL使固体溶解，离心10min(5000转/分钟)，取上清液上样。色谱柱预先用15％乙腈/水/0.1％冰盐酸溶液50mL平衡。上样后继续用15％乙腈/水/0.1％冰盐酸溶液40mL冲洗，高效液相检测洗脱液成分。根据液相检测结果逐渐升高乙腈含量，直至所纯化的多肽主峰被洗脱出来。合并洗脱液，旋转蒸发取出大部分溶剂，冻干纯的多肽，HPLC检测含量大于90％，MALDI-TOF-MS确证分子量。

实施例2

本实施例公开了化合物002、034、036、037-074、079-108、140-141的制备方法：

本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，肽树脂封端后的裂解活化条件为：取封端后的树脂1.0g，冰浴下加入裂解液TFA/TIS/水(95％/2.5％/2.5％)15mL，加入DPDS(0.082g，0.36mmol，1.2equiv.)，缓慢恢复室温继续搅拌2.5h。过滤，滤液由3倍裂解液体积的MTBE沉降，离心，MTBE洗涤3次，真空干燥，得粗肽0.39g。将所得粗肽(0.30g)加入单口瓶中，再加入0.2％ TFA水溶液10mL，溶清后加入H-L-Cys-OH(0.12g)，室温搅拌反应3h，浓缩干。

实施例3

本实施例公开了化合物008的制备方法：

本实施例化合物的合成步骤本实施例基于实施例1和实施例2，与实施例1和2的区别在于，脱除Trt条件：TFA/TIS/DCM＝10/5/85。订合条件：向树脂中加入DMF 5mL，DIEA(0.1mL，0.6mmol)，1,3-二(溴甲基)苯(79.2mg，0.3mmol)，避光反应1h。脱除Acm条件：向树脂中加入DMF 5mL，碘单质0.61g，反应2h。

实施例4

本实施例公开了化合物009的制备方法：

本实施例化合物具体的合成步骤基于实施例1和实施例2，区别在于烯烃复分解反应：向树脂中加入Grubbs 1^st(49.5mg，0.06mmol，20mol％)，反应2h。

实施例5

本实施例公开了化合物010的制备方法，其合成路线为：

本实施例基于实施例1和实施例2，区别在于裂解条件：TFE/DCM＝1/4，得粗肽。环化条件：粗肽溶于DCM(8mL)，加入HBTU(170mg，0.45mmol)，DIEA(1.5mL，0.9mmol)，DMAP(7.3mg，0.06mmol)，室温下反应3h。

实施例6

本实施例公开了化合物011的制备方法：

本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，脱除Alloc条件：向树脂加入DCM(9mL)，Pd(PPh₃)₄(57.8mg，0.05mmol)，苯基硅烷(324.6mg，3.0mmol)，室温下反应1.5h，重复一次。裂解条件：TFE/DCM＝1/4，得粗肽。成环条件：粗肽溶于DCM(8mL)，加入HBTU(170mg，0.45mmol)，DIEA(1.5mL，0.9mmol)，DMAP(7.3mg，0.06mmol)，室温下反应3h。全脱保护条件：【三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯甲硫醚：水＝90：2.5：2.5：5】。

实施例7

本实施例例公开了化合物012的制备方法：

本实施例基于实施例1，与实施例1区别在于，环化条件：粗肽溶于水(50mL)，加入谷胱甘肽(92.2mg，0.3mmol)，加入硫酸铵调节pH＝9，在空气氛围中、室温下反应4h。

实施例8

本实施例公开了化合物075-078的制备方法：

本实施例基于实施例1和实施例2，区别在于环化条件：粗肽溶于DCM(8mL)，加入HBTU(170mg，0.45mmol)，DIEA(1.5mL，0.9mmol)，DMAP(7.3mg，0.06mmol)，室温下反应3h。

由本文所公开的实施方案的合成方法制备的多肽化合物如下表1所示。

表1合成多肽化合物列表

试验例1

本试验例公开了本发明的多肽化合物对CaSR的激动活性评价实验(EC₅₀)。

CaSR活性化合物的筛选是通过重组表达受体来完成的。利用重组表达CaSR提供了几种优点，例如能够在确定的细胞系统中表达受体从而能够更容易区分化合物对CaSR的反应与对其它受体的反应。例如，可利用通常不用表达载体表达CaSR的诸如HEK293、CHO等细胞系中表达CaSR，而利用没有表达载体的相同细胞系作为对照。

1.试验过程

1.1细胞培养及试剂配制

a)细胞株：Flp-In-HEK293-CASR stable pool(来源于康龙化成)；

b)完全培养基：DMEM,High Glucose+10％ FBS+2mM GlutaMAX+1X Penicillin-Streptomycin+200μg/ml Hygromycin B；

c)细胞播种培养基：DMEM,High Glucose+10％ FBS+2mM GlutaMAX；

d)实验缓冲液：5X Stimulation Buffer without CaCl₂。

1.2化合物管理

a)化合物库存溶液：按照标准协议，将来自内部合成的粉末制成10mM DMSO溶液库存。

b)化合物存储：DMSO中的所有化合物均存放在-20℃下进行短期存储(最多2个月)。剩余的化合物在-20℃下长期保存。

1.3激动剂活性试验

a)Flp-In-HEK293-CASR细胞株培养于完全培养基，于37℃,5％ CO₂至70％～90％融合度。

b)TrypLE消化处理后将细胞重悬于接种培养基中，接种于384孔细胞培养板(Corning,3826)，每孔接种10,000个细胞，于37℃,5％ CO₂培养过夜。

c)用ddH₂O将实验缓冲液稀释至1X(Hepes 10mM,MgCl₂ 0.5mM,KCl 4.2mM,NaCl146mM,glucose 5.5mM,LiCl 50mM pH 7.4)，同时配制1X Stimulation Buffer with2.4mM CaCl₂。

d)配置2X化合物工作液，于37℃孵育60分钟，按照Cisbio IP-One Tb试剂盒说明测定细胞中IP-One的产生。

e)利用Envision HTRF Detector收集数据。

2.数据分析

1)Z’factor＝1-3*(SD_Max+SD_Min)/(Mean_Max-Mean_Min)；

2)CV_Max＝(SD_Max/Mean_Max)*100％；

3)CV_Min＝(SD_Min/Mean_Min)*100％；

4)S/B＝Singal/Background；

5)EC₅₀值的计算公式:

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))

X：log value of compound concentration；Y：Activation％

根据上述方法，活性测试结果如表2所示，其中001(Etelcalcetide)作为对照。

表2多肽化合物对CaSR的活性(EC₅₀)

由表2的结果可知，本发明提供的多肽化合物显示了对CaSR的激动活性。

试验例2

本试验例公开了本发明的多肽化合物对细胞色素P450氧化酶的抑制试验。

将含有细胞色素P450的人肝微粒体(0.253mg/mL蛋白)与测试化合物(0.05-50μM)、CYPs底物(10μM对乙酰氨基酚、5μM双氯芬酸、30μM美芬妥因、5μM氢溴酸右美沙芬、2μM米达唑仑)、1.0mM NADP在37℃温育10分钟。将Etelcalcetide作为对照。结果如表3所示。

表3化合物的细胞色素P450 CYP同工酶抑制活性(IC₅₀)

由表3的结果可知，本发明提供的多肽化合物对细胞色素P450氧化酶的抑制IC₅₀值均大于50μM。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种式I所示的多肽化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：

J独立地选自S，Se或S＝O；

Q独立地选自氢，氘，非环状取代的或未经取代的脂族基团，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸，高半胱氨酸或L-硒代半胱氨酸；

E，K和U各自独立地选自