CN115894595B

CN115894595B - 一种10,19-开环环阿屯烷三萜i及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115894595B
Application number: CN202210979656.7A
Authority: CN
Inventors: 秦国飞; 朱峰; 姚庆强
Original assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2022-08-16
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2042-08-16
Also published as: CN115894595A

Abstract

本发明提供了一种环阿屯烷三萜化合物、其制备方法及其应用。具体地涉及该化合物，其制备方法，作为对照品检测相关样品以及预防、改善或治疗慢性阻塞性肺疾病和炎性疾病中的用途。

Description

一种10,19-开环环阿屯烷三萜I及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种10,19-开环环阿屯烷三萜I及其制备方法和应用。

技术背景

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9％～10％。

一般的药物治疗方案采用支气管扩张剂、糖皮质激素、祛痰剂等，但有效改善机体性能的药物依然缺乏。

发明内容

本发明提供了式I所示的化合物，对慢性阻塞性肺疾病具有预防、改善、治疗作用，其结构如下：

本发明还提供了一种式I化合物的制备方法，包括如下操作步骤：

步骤(1)：黄芪甲苷与氧化剂室温避光反应6-24h，反应结束后纯化得氧化产物；

所述氧化剂选自高氯酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾、高碘酸钠；

所述黄芪甲苷与氧化剂的所用量之比为0.5-2:1-2；

所述反应在溶剂中进行；所述溶剂为甲醇或乙醇；

所述醇浓度为20-50％；

所述黄芪甲苷与溶剂的质量体积比为1-10：1，即黄芪甲苷(g)：溶剂(L)为1-10：1；

所述反应的反应温度为40-70℃。

步骤(2)：将步骤(1)所得氧化产物加入溶剂搅拌溶解，加入还原剂避光反应6-24h后加入酸调节pH至6-8，得还原液；

所述溶剂为醇溶液，醇浓度为60％以上；

所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化锌、氢化铝锂、二异丁基氢化铝；

所述黄芪甲苷与硼氢化钠的物质的量之比为1:4-10。

步骤(3)：将步骤(2)还原液加入酸，加热酸解2-8h，加入碱调节pH至8-9，纯化干燥得得式I化合物。

所述酸为无机酸或有机酸，其中所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸；所述有机酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸；

所述加热温度为55-65℃；

所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、钠或钾或钙的碳酸盐或碳酸氢盐。

本申请中，没有特别说明，所述醇溶液均为醇的水溶液。

优选地，所述步骤(1)中所用醇浓度为30-40％，黄芪甲苷与醇溶液的料液比为1-10：1(g/L)；所述氧化剂为高碘酸钠，黄芪甲苷与高碘酸钠的质量比为1:1-2。

进一步的，所述步骤(1)中所用醇浓度为30-35％；黄芪甲苷与醇溶液的料液比为1-5：1(g/L)；黄芪甲苷与高碘酸钠的质量比为1:1-2。

优选地，所述步骤(2)中黄芪甲苷与还原剂的物质的量之比为1:5-6。

优选地，所述步骤(3)中所述酸为盐酸，酸解温度为55-60℃，酸解时长为2-5h；所用碱为氢氧化钠。

最优选地，式I化合物的制备工艺为：

步骤(1)：黄芪甲苷加入35-40％的乙醇溶液混悬加入与黄芪甲苷质量比为1:1.5-1.6的高碘酸钠室温避光反应10-12h。反应结束后减压浓缩并离心取沉淀得氧化产物。

步骤(2)：氧化产物加入90-95％乙醇溶液搅拌溶解，加入与黄芪甲苷摩尔比为1:8-9的硼氢化钠避光反应10-12h，加入冰醋酸调节pH至7.0-7.5，得还原液。

步骤(3)：还原液加入6-12％的盐酸溶液55-60℃下酸解4h，加入氢氧化钠溶液调节pH至8.0-8.5，减压浓缩，离心取沉淀干燥得式I化合物。

所得式I化合物通过NMR、UV-Vis、IR、HRESIMS等进行结构表征，结果如下：

核磁共振波谱

式I化合物的¹H NMR(C₅D₅N)δ：5.59(1H,brs)，5.59(1H,brs),5.07(1H,dd,13.7,7.0),3.88(1H,dd,9.1,4.5),3.80(1H,dd,9.6,6.0),3.07(1H,dd,21.2,10.5),2.66(1H,m),2.48(1H,m),2.42(1H,m),2.40(1H,m),2.09(1H,m),2.29(1H,m),2.06(1H,m),2.06(1H,m),2.04(1H,m),2.03(1H,m),1.82(1H,m),1.69(1H,m),1.65(1H,m),1.59(1H,m),1.53(3H,s),1.46(1H,m),1.41(3H,s),1.41(3H,s),1.34(3H,s),1.29(3H,s),1.13(3H,s),1.05(3H,s),0.92(3H,s)。

式I化合物的¹³C NMR(C₅D₅N)δ：142.3,139.7,119.6,115.2,87.2,81.6,73.3,72.6,71.4,56.8,47.8,46.9,45.4,42.2,40.1,37.2,34.8,33.4,32.2,31.3,31.0,28.6,28.1,27.0,26.5,25.2,23.8,20.0,19.2,18.1。

紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)

样品前处理：将式I化合物溶于甲醇中，配制成浓度为0.1mg/mL的溶液。式I的紫外-可见吸收光谱分析数据表1所示。

表1式I化合物紫外-可见吸收光谱数据表

红外吸收光谱(IR)

式I化合物IR光谱部分光谱数据如下：IR(KBr)ν_max 3393,3330,2966,2931,2869,1732,1655,1466,1450,1380,1262,1182,1149,1099,1044,1033cm^-1。

高分辨质谱(HRMS)

式I化合物的MS-ESI质谱图分别见附图1。式I化合物HRESIMS:m/z：473.3621[M+H]⁺(calcd.for C₃₀H₄₉O₄,473.3625)。

HPLC检测

由附图2可知，式I化合物纯度均大于99.5％，可以作为对照品使用。

本发明提供一种式I化合物作为对照品在检测相关样品中的用途。所述的样品为药物样品。进一步的，所述的样品为原料药、中间体、制剂中的一种。

本发明还提供一种式I化合物在预防、改善或治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的用途。

本发明还提供一种式I化合物在预防、改善或治疗炎性疾病药物中的用途。

研究表明，式I化合物对香烟烟雾诱导的细胞损伤具有明显的保护作用；对LPS诱导的脾脏淋巴细胞的增殖具有明显的抑制作用。式I化合物对于慢性阻塞性肺病有显著的治疗效果。式I化合物对于炎性疾病治疗效果显著。所述炎性疾病选自哮喘、支气管炎、肝炎、强直性脊柱炎、肾炎、肺炎、脂毒症或关节炎。

附图说明

图1为式I化合物的HRESIMS图谱

图2为式I化合物的HPLC图谱

具体实施方式

下面将结合具体实施案例进一步说明本发明，本发明要求保护的范围并不局限于以下实施方式。

实施案例1

称取黄芪甲苷200.0g，加入35％乙醇溶液40L搅拌得混悬液，加入高碘酸钠320.0g避光搅拌反应12h。反应结束减压浓缩，离心取沉淀即为氧化反应产物。

氧化反应固体加入95％乙醇搅拌溶解，加入硼氢化钠87.0g避光搅拌反应12h，缓慢滴加冰醋酸调节pH至7即得还原液。

向还原反应液中加入6％的盐酸，60℃水解反应4h。加入氢氧化钠溶液调节至8.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施案例2

氧化反应固体加入无水乙醇搅拌溶解，加入硼氢化钠68.0g避光搅拌反应12h，缓慢滴加冰醋酸调节pH至6即得还原液。

向还原反应液中加入6％的盐酸，60℃水解反应6h。加入氢氧化钙溶液调节至8.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施案例3

称取黄芪甲苷200.0g，加入35％乙醇溶液200L搅拌得混悬液，加入高碘酸钠320.0g避光搅拌反应6h。反应结束减压浓缩，离心取沉淀即为氧化反应产物。

氧化反应固体加入甲醇搅拌溶解，加入硼氢化钠87.0g避光搅拌反应12h，缓慢滴加硫酸调节pH至8.0即得还原液。

向还原反应液中加入10％的乙酸，80℃水解反应6h。加入氢氧化钾溶液调节至9.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施案例4

称取黄芪甲苷200.0g，加入45％乙醇溶液40L搅拌得混悬液，加入高碘酸钠200.0g避光搅拌反应24h。反应结束减压浓缩，离心取沉淀即为氧化反应产物。

氧化反应固体加入60％乙醇搅拌溶解，加入硼氢化钠87.0g避光搅拌反应6h，缓慢滴加硫酸调节pH至7即得还原液。

向还原反应液中加入5％的硝酸，60℃水解反应2h。加入氢氧化钠溶液调节至8.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施案例5

氧化反应固体加入无水乙醇搅拌溶解，加入硼氢化钠87.0g避光搅拌反应12h，缓慢滴加冰醋酸调节pH至6即得还原液。

向还原反应液中加入10％的盐酸，20℃水解反应4h。加入氢氧化钠溶液调节至9.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施案例6

称取黄芪甲苷200.0g，加入20％甲醇溶液20L搅拌得混悬液，加入高碘酸钠600.0g避光搅拌反应24h。反应结束减压浓缩，离心取沉淀即为氧化反应产物。

氧化反应固体加入95％乙醇搅拌溶解，加入硼氢化钠97.0g避光搅拌反应12h，缓慢滴加盐酸调节pH至7即得还原液。

向还原反应液中加入10％的硫酸，60℃水解反应6h。加入氢氧化钠溶液调节至8.0，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化即得式I化合物。

实施例7待测化合物对体外COPD模型的影响

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种慢性衰弱性肺病，以进行性气道炎症和肺结构细胞死亡为特征。吸烟被认为是COPD发病最常见的危险因素。香烟烟雾(CES)会诱导持续性炎症和上皮细胞凋亡，本研究以肺泡上皮II型细胞为研究对象，采用CES建立体外COPD模型，筛选对于改善COPD的治疗极为有益的化合物。

1.CSE的制备

使用自制注射器泵燃烧四支商用香烟，并将香烟的烟雾溶解至装有25毫升RPMI-1640培养基的烧瓶中，并通过0.22μm过滤器过滤，以去除大颗粒。对溶液进行灭菌并测定光密度(OD)。当ΔOD(A320-A540)介于0.9和1.2之间时，CSE合格，最终溶液被认为是100％CSE。100％的CSE用PBS稀释为工作浓度为10％。

2.待测样品配置方法：

待测样品使用DMSO混合溶液配置成20μM的储备液，使用时用PBS稀释至所需的20倍浓度200nM、2μM、20μM，其终浓度分别为10nM、100nM、1μM。

3.活性检测：

小鼠肺泡II型上皮细胞(MLE-12)使用MLE特殊培养基培养，培养条件为：温度为37℃，5％二氧化碳的培养箱。使用第四或第五代生长至80％融合的细胞。细胞接种于96孔板，接种数量为3.5×10⁴个/mL，培养箱稳定培养4h后，加入上述相应浓度的待测药物并设置对照组和模型组，过夜培养后，加入工作浓度的CES，继续培养24h，加CCK-8培养2h，检测OD450值，并计算细胞活力(％)。

细胞活力％＝待测药物OD÷对照组OD×100％。

4.实验结果见表1。

表1待测药物的细胞活力

实验结果显示，式Ⅰ化合物在100nM、1μM时对香烟烟雾诱导的细胞损伤具有明显的保护作用。

实施例8待测化合物对LPS活化的淋巴细胞CD69表达的影响

实验分为正常对照组、LPS组、待测化合物组浓度分为低、中、高组。分离小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种于96孔板，每孔190μL，各给药组同时加入相应剂量的药物，继续培养过夜。除正常组外，其余各组分别加入7.5μg/ml的LPS，继续培养6h，收集细胞，流式细胞术检测淋巴细胞表面CD69的表达。

实验结果见表2。

表2待测药物CD69+细胞比率

实验结果显示，式Ⅰ化合物在30μM时对LPS诱导的脾脏淋巴细胞的增殖具有明显的抑制作用。

Claims

1.一种化合物，其结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述式I化合物作为对照品在检测相关样品中的用途。

3.如权利要求2所述用途，其特征在于，所述相关样品为药物相关样品。

4.如权利要求3所述用途，其特征在于，所述药物相关样品为原料药、中间体、制剂中的至少一种。

5.一种如权利要求1所述式I化合物在制备预防、改善或治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的用途。

6.一种如权利要求1所述式I化合物在制备预防、改善或治疗炎性疾病药物中的用途；所述炎性疾病选自哮喘、支气管炎、肝炎、强直性脊柱炎、肾炎、肺炎、脂毒症或关节炎。

7.如权利要求1所述式I化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：黄芪甲苷与氧化剂加热避光反应6-24h，反应结束后纯化得氧化产物；

所述氧化剂选自高氯酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾、高碘酸钠；所述黄芪甲苷与氧化剂的质量之比为0.5-2:1-2；所述反应在甲醇或乙醇中进行；

步骤(2)：将步骤(1)所得氧化产物加入溶剂搅拌溶解，加入还原剂避光反应6-24h后调节pH至6-8，得还原液；所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化锌、氢化铝锂、二异丁基氢化铝；所述溶剂为醇溶液；

步骤(3)：将步骤(2)还原液加入酸，加热酸解2-8h，加入碱调节pH至8-9，纯化干燥得式I化合物；所述酸为无机酸或有机酸；所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸；所述有机酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸；所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、钠或钾或钙的碳酸盐或碳酸氢盐。

8.如权利要求7所述化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶剂浓度为20-50％；和/或所述黄芪甲苷与溶剂的质量体积比为1-10:1；和/或所述加热温度为40-70℃。

9.如权利要求7所述化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述醇溶液浓度为60％以上；所述黄芪甲苷与还原剂的物质的量之比为1:4-10。

10.如权利要求7所述化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述加热温度为55-65℃。