CN115887783A - 一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球及其制备方法和应用，将诱导组织再生药物、含钙无机颗粒、明胶、可降解人工合成聚酯和矿化钙磷层结合使用，使复合微球具有良好的诱导组织再生药物释放效果，诱导组织再生药物释放周期可达42天以上，并具备良好的生物相容性和生物活性，可作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，能有效促进骨组织的修复和重建。此外制备方法简单，对设备的要求不高，原料均已产业化、来源易得，成本低廉，易于实现产业化。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球及其制备方法和应用。
背景技术：
骨组织疾病的药物治疗，例如肿瘤化疗、抗感染和消炎，全身性的给药会造成骨组织“病灶”部位的有效药物含量不足，而药物在其它组织的分布则易于引发毒副作用。而口服给药的过肝效应以及药物在运输过程中的衰减和流失，造成药物可利用度很低，血药浓度低。所以需要大量的服用药物，这样又增加过肝效应。因此，将药物缓释引入到骨组织支架中，希望能将两者结合，研制出包载并缓释药物的骨组织支架材料。缓控释药物释放系统(DDS)是近年来国内外研究的热点。以各种骨修复材料为载体的药物缓控释体系是一种新型的给药方式，将DDS植入生物体内骨骼后，载体所承载的药物能够持续、稳定、高效地缓慢释放，达到修复骨缺损和药物治疗的双重目的。在治疗骨髓炎、骨肿瘤、骨结核、骨折、骨不连和人工关节置换等领域，DDS发挥着不可低估的作用。
高分子微球具有微存储器的功能，能存储和保护某些物质，以便在需要的时候、需要的地点、以需要的速度释放出这些物质(多维控释)。目前应用于该类微球的材料主要有无机材料、天然高分子及合成高分子，按照降解性能又分为降解类材料及非降解类材料。聚酯类是目前研究最多、应用最广泛的可生物降解的合成高分子材料为可降解人工合成聚酯，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚ε-己内酯、聚β-羟基丁酸、聚β-羟基戊酸以及它们的共聚物。但是，可降解人工合成聚酯缺少生物活性，难以诱导组织再生。在无机材料中，磷酸钙陶瓷及碳酸钙、硫酸钙等在骨再生的有利作用已得到公认。同时，单凭可降解人工合成聚酯难以有效控制DDS的药物释放速率。
发明内容：
本发明的目的是提供一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球，由内到外依次为装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球、包覆所述明胶微球的可降解人工合成聚酯以及聚酯表面的钙磷层。
所述诱导组织再生药物包括但不限于阿仑膦酸钠、白藜芦醇、鲑鱼降钙素、唑来磷酸钠、伊班膦酸钠、雷尼酸锶、柚皮苷、地塞米松、维生素D、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、生长激素、白介素。
所述装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球的平均粒径为1～50um。
所述可降解人工合成聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的任一种。
优选地，所述可降解聚酯的分子量为1.0～10.0万道尔顿。
所述含钙无机颗粒包括但不限于羟基磷灰石、生物玻璃、磷酸八钙、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸氢钙、无定型磷酸钙、双相磷酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、硫酸钙；所述含钙无机颗粒的尺寸为0.1～10um。
所述表面含钙磷层的聚酯基复合微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球；
(2)装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球分散到可降解人工合成聚酯，然后加入到含表面活性剂的水溶液中，通过乳化溶剂挥发法固化形成复合微球；
(3)将复合微球分散到5～10倍浓度的模拟体液，静置、离心、清洗获得表面含钙磷层的聚酯基复合微球。
所述模拟体液是含有钙离子及磷酸根离子的磷灰石过饱和溶液，其离子组成浓度如下：
优选地，步骤(1)包括以下步骤：将含钙无机颗粒分散于含0.01～0.1mg/ml诱导组织再生药物及0.05～1.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒；然后分散至0.1～0.5g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含1～6wt％Span80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，400～1000rpm、50～70℃下搅拌5～60min，随后将温度迅速降至3-5℃后，继续搅拌10～45min，加入23-28wt％戊二醛溶液，静置24h，离心，加入异丙醇脱水1～10h，依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球；所述含钙无机颗粒与含诱导组织再生药物及聚乙二醇溶液的质量体积比为1：40～100g/ml；所述装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒与明胶的质量比为1:5～50；所述水相与油相的体积比为1:5～15；所述明胶与戊二醛溶液的质量体积比为15～60:1mg/ml。
优选地，步骤(2)包括以下步骤，将装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球分散于可降解人工合成聚酯溶液中，得到装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球/可降解人工合成聚酯溶液共混液；所述装载诱导组织再生药物的明胶微球与可降解人工合成聚酯的质量比为0.05～0.45：1；随后，用去离子水配制300～800ml 1.5～40mg/ml的表面活性剂水溶液，所述表面活性剂包括但不限于聚乙烯醇、明胶、甲基纤维素；然后将上述共混液缓慢滴加到表面活性剂水溶液中，250～800rpm下持续搅拌12～24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。
优选地，步骤(3)静置时间为12～48h，复合微球与模拟体液的质量体积比为1：20～200g/ml。
本发明还保护表面含钙磷层的聚酯基复合微球的应用，作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，促进细菌感染下的骨组织修复与重建。
本发明的有益效果如下：
1)本发明首先采用含钙无机颗粒预装载诱导组织再生药物，再使用水溶性高分子明胶装载诱导组织再生药物并形成装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒的明胶微球，然后分散在可降解人工合成聚酯网络中，再通过乳化溶剂挥发法使之固化成微球，并在微球表面形成钙磷层，本发明采用的含钙无机颗粒、明胶、可降解人工合成聚酯和钙磷层生物相容性良好。
2)本发明得到的表面含钙磷层的聚酯基复合微球应用过程中，明胶可起到显著降低诱导组织再生药物的释放速率，可降解人工合成聚酯、含钙无机颗粒和钙磷层可进一步协同调控诱导组织再生药物的释放速率，诱导组织再生药物释放周期可达42天以上；此外微球表面的钙磷层1)可促进细胞在微球表面的粘附与增殖；2)释放的钙(部分来自于含钙无机颗粒)、磷离子可协同诱导组织再生药物起到促组织再生修复的效果。
总之，本发明将诱导组织再生药物、含钙无机颗粒、明胶、可降解人工合成聚酯和矿化钙磷层结合使用，使复合微球具有良好的诱导组织再生药物释放效果，诱导组织再生药物释放周期可达42天以上，并具备良好的生物相容性和生物活性，可作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，能有效促进骨组织的修复和重建。此外制备方法简单，对设备的要求不高，原料均已产业化、来源易得，成本低廉，易于实现产业化。
附图说明：
图1是实施例1-5及对比例2-6制得复合微球作为支架材料的体外诱导组织再生药物释放性能检测；
图2是实施例1-5及对比例1-6制得复合微球作为支架材料的体外诱导前成骨细胞成骨分化性能。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
将100mg磷酸三钙分散于8ml含0.01mg/ml骨形态发生蛋白2及1g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载骨形态发生蛋白2的磷酸三钙；将180mg装载骨形态发生蛋白2的磷酸三钙分散至30ml含0.3g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含400ml含3wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，1000rpm、55℃下搅拌30min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌10min，加入150ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水8h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载骨形态发生蛋白2的磷酸三钙/明胶微球。将50mg装载骨形态发生蛋白2的磷酸三钙/明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸(分子量：1万道尔顿)溶液中，得到装载骨形态发生蛋白2的磷酸三钙/明胶微球/聚乳酸溶液共混液；随后，用去离子水配制600ml 40mg/ml的甲基纤维素水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到甲基纤维素水溶液中，350rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于100ml 6倍浓度模拟体液中，静置36h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
实施例2：
将100mg羟基磷灰石分散于5ml含0.1mg/ml地塞米松及0.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载地塞米松的羟基磷灰石；将1g装载地塞米松的羟基磷灰石分散至30ml含0.2g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含200ml含2wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌15min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球。将300mg装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于50ml 5倍浓度模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
实施例3
将100mg生物玻璃分散于4ml含0.05mg/ml阿仑膦酸钠及0.05g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载阿仑膦酸钠的生物玻璃；将2g装载阿仑膦酸钠的生物玻璃分散至30ml含0.4g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含150ml含6wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，500rpm、50℃下搅拌60min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌15min，加入250ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水6h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载阿仑膦酸钠的生物玻璃/明胶微球。将150mg装载阿仑膦酸钠的生物玻璃/明胶微球分散于10ml含1g聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(分子量：6万道尔顿)溶液中，得到装载阿仑膦酸钠的生物玻璃/明胶微球/聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯溶液共混液；随后，用去离子水配制400ml 1.5mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，250rpm下持续搅拌24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于200ml 5倍浓度模拟体液中，静置48h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
实施例4
将100mg磷酸八钙分散于6ml含0.02mg/ml白藜芦醇及1.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载白藜芦醇的磷酸八钙；将0.6g装载白藜芦醇的磷酸八钙分散至30ml含0.1g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含300ml含1wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，800rpm、60℃下搅拌25min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌30min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水10h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载白藜芦醇的磷酸八钙/明胶微球。将250mg装载白藜芦醇的磷酸八钙/明胶微球分散于10ml含1g聚己内酯(分子量：6万道尔顿)溶液中，得到装载白藜芦醇的磷酸八钙/明胶微球/聚己内酯溶液共混液；随后，用去离子水配制800ml15mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，800rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于20ml 10倍浓度模拟体液中，静置12h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
实施例5
将100mg碳酸钙分散于10ml含0.03mg/ml成纤维细胞生长因子及1g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载成纤维细胞生长因子的碳酸钙；将1.5g装载成纤维细胞生长因子的碳酸钙分散至30ml含0.5g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含450ml含5wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，400rpm、70℃下搅拌5min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌45min，加入300ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水1h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载成纤维细胞生长因子的碳酸钙/明胶微球。将450mg装载成纤维细胞生长因子的碳酸钙/明胶微球分散于10ml含1g聚三亚甲基碳酸酯(分子量：10万道尔顿)溶液中，得到装载成纤维细胞生长因子的碳酸钙/明胶微球/聚三亚甲基碳酸酯溶液共混液；随后，用去离子水配制500ml 20mg/ml的聚乙烯醇1788水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1788水溶液中，400rpm下持续搅拌18h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于80ml 8倍浓度模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
对比例1
本对比例提供一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含诱导组织再生药物，其包括以下步骤：
将100mg羟基磷灰石分散于5ml含0.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得预处理的羟基磷灰石；将1g预处理的羟基磷灰石分散至30ml含0.2g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含200ml含2wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌15min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得羟基磷灰石/明胶微球。将300mg羟基磷灰石/明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到羟基磷灰石/明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于50ml 5倍浓度模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
对比例2
本对比例提供一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含含钙无机颗粒，其包括以下步骤：
将4.98mg地塞米松溶解至30ml含0.2g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含200ml含2wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌15min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载地塞米松的明胶微球。将300mg装载地塞米松的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载地塞米松的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于50ml 5倍浓度模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
对比例3：
本对比例提供一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含明胶，其包括以下步骤：
将42.86mg装载地塞米松的羟基磷灰石分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载地塞米松的羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g复合微球分散于50ml 5倍浓度模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
对比例4：
本对比例提供一种聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含钙磷层，其包括以下步骤：
将100mg羟基磷灰石分散于5ml含0.1mg/ml地塞米松及0.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载地塞米松的羟基磷灰石；将1g装载地塞米松的羟基磷灰石分散至30ml含0.2g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含200ml含2wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌15min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载地塞米松的明胶微球。将300mg装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。
对比例5：
本对比例提供一种聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含聚酯层。
将100mg羟基磷灰石分散于5ml含0.1mg/ml地塞米松及0.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载地塞米松的羟基磷灰石；将1g装载地塞米松的羟基磷灰石分散至30ml含0.2g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含200ml含2wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌15min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球。将1g复合微球分散于50ml 5倍模拟体液中，静置24h，离心、清洗获得具有钙磷层的微球。
对比例6：
本对比例提供一种聚酯基复合微球的制备方法，与实施例2大致相同，不同之处在于：不包含含钙无机颗粒、明胶、钙磷层，其包括以下步骤：
将15mg地塞米松分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载地塞米松的羟基磷灰石/明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液共混液；随后，用去离子水配制300ml 10mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。
试验例1：
将实施例1-5和对比例1-6中制备得到的支架材料进行如下性能评价，结果见表1。
1.体外细胞毒性评价
取制得的支架，按GB/T 16886.5的要求进行评价和计分。实验结果如下表：
表1实施例及对比例所制得复合微球的体外细胞毒性计分
2.体外诱导组织再生药物释放性能检测
本试验例测试了实施例和对比例制备的复合微球的性能。具体方法和结果为：
将实施例1～5和对比例1～6中制备得到的复合微球进行体外溶质释放评价，结果见图1。
环境：温度为37℃，搅拌速度为60rpm，温控装置为恒温摇床；
液体缓释介质：PBS(pH＝7.4磷酸缓冲液)；
比例：50mg复合微球：20mLPBS；
小分子水溶性性药物的释放速率测定：定期收集PBS测试液，并补充等量的PBS，将收集的测试液用高效液相色谱法(HPLC)测定诱导组织再生药物的含量；
将某时间点溶质的吸光度代入到其标准曲线中，得到这一时间点诱导组织再生药物的实际量；将实际量除以复合微球中负载诱导组织再生药物的总量即得到这一时间点诱导组织再生药物的累积释放量。
3.体外诱导前成骨细胞成骨分化性能检测
复合微球辐照灭菌后按照10mg/mL的浓度浸泡在DMEM基础培养基内，放入37℃摇床内120rpm浸提24h。浸提完成后将微球及培养基1000rpm离心后收集上清。将收集的浸提液分别用相应的DMEM培养基稀释2倍，最后添加10％胎牛血清得到完全培养基。
将MC3T3-E1细胞按照每孔1×105个的密度接种于24孔板，贴壁培养24h后分别更换完全培养基，在温度为37℃且5％二氧化碳气氛下的培养箱中培养。培养基每2-3d更换一次，培养7天后，MC3T3-E1细胞的成骨分化性能通过其分泌的碱性磷酸酶检测，利用pNPP法进行测定，具体步骤如下：细胞用PBS溶液洗涤后，浸没于含有0.1M甘氨酸、1mM氯化镁以及0.05％曲拉通X-100的PBS溶液。待细胞溶解后，将溶解液与对硝基苯磷酸二钠盐均匀混合，将混合液置于37℃下30min。随后，将混合液滴加到96孔板，用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸光值。根据公式计算出每个支架上细胞中实际的碱性磷酸酶含量。
由实施例及对比例的体外细胞毒性评价结果(表1)可知，本发明方法所制备的复合微球均无细胞毒性。由体外诱导组织再生药物释放性能检测结果可知(图1)，实施例1～5都有长效的诱导组织再生药物释放性能，实施例2与对比例2～6都是基于装载诱导组织再生药物的复合微球。其中，实施例2在制备复合微球的过程中，首先采用含钙无机颗粒预装载诱导组织再生药物，再使用水溶性高分子明胶装载诱导组织再生药物并形成微球，然后将装载诱导组织再生药物的明胶微球分散在可降解人工合成聚酯网络中，再通过乳化溶剂挥发法使之固化成微球，并在微球表面形成钙磷层；对比例2不包含含钙无机颗粒，对诱导组织再生药物的释放影响较小；对比例3则不使用明胶包裹诱导组织再生药物，在没有用明胶包裹诱导组织再生药物的情况下，微球中的诱导组织再生药物在28d内便释放出去，达不到长效的缓控释的效果；对比例4没有在微球表面形成钙磷层，其诱导组织再生药物释放速度稍快；对比例5则不使用可降解聚酯包裹载药的羟基磷灰石/明胶微球，在这种情况下，微球中的诱导组织再生药物也是在28d内便释放出去，达不到长效的缓控释的效果；对比例6则不使用含钙无机颗粒、明胶、钙磷层，此时微球中的诱导组织再生药物在35d内便释放出去，也达不到长效的缓控释的效果。使用实施例2的微球，第21天的累计释放率为41.36％，即药物残留率为58.64％。而使用对比例5和6的第21天的累计释放率分别为100％和81.95％，即药物残留率分别为0％和18.05％。对比例5和6的药物残留率之和远低于实施例2，说明明胶、可降解人工合成聚酯、含钙无机颗粒、钙磷层四者具有协同增效作用，这四种成分组合能达到良好的缓释效果。由体外诱导前成骨细胞成骨分化性能可知(图2)，实施例1～5都有较好的诱导细胞分泌碱性磷酸酶的效果。与实施例2相比，对比例1没有装载诱导组织再生药物，其诱导前成骨细胞成骨分化性能显著降低，因此细胞分泌的碱性磷酸酶浓度最低；对比例2没有使用含钙无机颗粒，其诱导前成骨细胞成骨分化性能较弱，因此细胞分泌的碱性磷酸酶浓度较低；对比例3没有使用明胶，对诱导前成骨细胞成骨分化性能的影响较小；对比例4没有包含钙磷层，其诱导前成骨细胞成骨分化性能较弱，因此细胞分泌的碱性磷酸酶浓度也较低；对比例5不使用可降解聚酯包裹载药的羟基磷灰石/明胶微球，对诱导前成骨细胞成骨分化性能的影响较小。
表2实施例和对比例样品的药物累计释放率
Claims (10)
1.一种表面含钙磷层的聚酯基复合微球，其特征在于，由内到外依次为装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球、包覆所述明胶微球的可降解人工合成聚酯以及聚酯表面的钙磷层。
2.根据权利要求1所述的聚酯基复合微球，其特征在于，诱导组织再生药物选自阿仑膦酸钠、白藜芦醇、鲑鱼降钙素、唑来磷酸钠、伊班膦酸钠、雷尼酸锶、柚皮苷、地塞米松、维生素D、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、生长激素、白介素中的任一种。
3.根据权利要求1所述的聚酯基复合微球，其特征在于，所述装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球的平均粒径为1～50um。
4.根据权利要求1所述的聚酯基复合微球，其特征在于，所述可降解人工合成聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的任一种；所述可降解聚酯的分子量为1.0～10.0万道尔顿。
5.根据权利要求1所述的聚酯基复合微球，其特征在于，所述含钙无机颗粒选自羟基磷灰石、生物玻璃、磷酸八钙、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸氢钙、无定型磷酸钙、双相磷酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、硫酸钙中的任一种；所述含钙无机颗粒的尺寸为0.1～10um。
6.权利要求1所述表面含钙磷层的聚酯基复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球；(2)装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球分散到可降解人工合成聚酯，然后加入到含表面活性剂的水溶液中，通过乳化溶剂挥发法固化形成复合微球；(3)将复合微球分散到5～10倍浓度模拟体液，静置、离心、清洗获得表面含钙磷层的聚酯基复合微球。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将含钙无机颗粒分散于含0.01～0.1mg/ml诱导组织再生药物及0.05～1.5g/ml聚乙二醇的溶液中，离心、冻干获得装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒，然后分散至0.1～0.5g/ml的明胶水溶液，获得水相；配制含1～6wt％Span80的液体石蜡，获得油相；将水相加入到油相中，400～1000rpm、50～70℃下搅拌5～60min，随后将温度迅速降至3-5℃后，继续搅拌10～45min，加入23-28wt％戊二醛溶液，静置24h，离心，加入异丙醇脱水1～10h，依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤，抽滤，干燥，获得装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球；所述含钙无机颗粒与含诱导组织再生药物及聚乙二醇溶液的质量体积比为1：40～100g/ml；所述装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒与明胶的质量比为1:5～50；所述水相与油相的体积比为1:5～15；所述明胶与戊二醛溶液的质量体积比为15～60:1mg/ml。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤，将装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球分散于可降解人工合成聚酯溶液中，得到装载诱导组织再生药物的含钙无机颗粒/明胶微球/可降解人工合成聚酯溶液共混液；所述装载诱导组织再生药物的明胶微球与可降解人工合成聚酯的质量比为0.05～0.45：1；随后，用去离子水配制300～800ml1.5～40mg/ml的表面活性剂水溶液，所述表面活性剂选自聚乙烯醇、明胶、甲基纤维素中的任一种；然后将上述共混液缓慢滴加到表面活性剂水溶液中，250～800rpm下持续搅拌12～24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)静置时间为12～48h，复合微球与模拟体液的质量体积比为1：20～200g/ml。
10.权利要求1所述表面含钙磷层的聚酯基复合微球的应用，其特征在于，作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，促进细菌感染下的骨组织修复与重建。
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| WO2011123110A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-06 | Daniel Sunho Oh | Method of preparing ceramic/polymer composite scaffolds with bioactive molecules for hard tissue regeneration |
| CN112587731A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-04-02 | 广东省医疗器械研究所 | 一种复合支架及其制备方法和应用 |
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2022
- 2022-12-08 CN CN202211573212.XA patent/CN115887783A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| WO2011123110A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-06 | Daniel Sunho Oh | Method of preparing ceramic/polymer composite scaffolds with bioactive molecules for hard tissue regeneration |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PENGFEI WEI ET AL: "strengthening the potential of biomineralized microspheres in enhancing osteogenesis via incorporationg alendronate", 《CHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》, 27 February 2019 (2019-02-27), pages 2 - 2 * |
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