CN115887774B - 生物膜、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种生物膜、制备方法及其应用，所述生物膜依次包含疏水层、复合层和胶原蛋白层，所述生物膜疏水层孔径致密，隔离效果良好。复合层和胶原蛋白层中的胶原蛋白可逐渐释放，使其作用时间更加长，促进缺损处生长效果更好。本申请所述的多层生物膜韧性良好，应用范围广泛，可应用于神经外科、五官科或整形外科等领域。
Description
技术领域
本申请涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种生物膜、制备方法及其应用。
背景技术
旧材料不断改良使得新技术不断应用于生物膜类的制备中，所得到的生物膜安全性更好，生物相容性更好，这有助于提高手术恢复效果，更好的服务于许多疾病患者。膜材料的种类是影响生物膜修复效果最关键的因素，多种材料复合共混是膜类产品发展的大趋势。研究发现，将羊膜应用于引导组织再生，羊膜具有提高伤口愈合的功能，同时还能够减少术后产生的瘢痕，适用于疤痕体质患者。还有其他类型的无机、有机材料如硫酸钙、磷酸三钙、碳化二亚胺等。单一类型材料组成的膜不能完全达到膜修复引导的效果，因此多种材料的复合共混来达到更优的治疗效果是近几年研究的热点。考虑到植入部位环境的变化对生物膜的要求，能随机体环境变化的生物功能性膜也成为研究的热点。例如血小板衍生生长因子与膜材料的复合，能促进成骨细胞DNA复制及其趋化性上有着积极的影响，有利于骨组织的再生。人牙周膜成纤维细胞可在口腔修复膜材料表面粘附、增殖，能分泌出大量的细胞外基质，进一步形成纤维组织结构，其形成的膜样组织细胞具有较好的生物活性。此外静电纺丝技术在膜类产品的应用中也越来越广泛，细胞在具有纳米级结构表面的黏附与增殖，明显优于传统微米级膜。尤其是纳米纤维状高分子材料，与天然胶原纤维结构相似，能够更好促进细胞的黏附和增殖。
随着生活水平的不断提高，人们对医疗目的的要求不再局限于疾病治疗，可吸收生物膜在医疗方面的应用也愈加广泛，目前此类产品主要应用于口腔医疗行业和硬脑膜缺损。硬脑膜缺损在神经外科临床工作中非常常见，开放性颅脑损伤、肿瘤的侵蚀等均可能引发硬脑膜缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外漏，防止脑的膨出和大气压的压迫，否则将危及人体生命。目前已经有多种材料制成的人工硬脑膜在临床上使用，主要分为两大类，生物衍生类材料和人工合成高分子材料。生物衍生类材料主要有同种异体的人体硬脑膜及异种的猪、牛心包膜、真皮基质以及利用牛肌腱I型胶原制备的生物膜等。人工合成高分子材料主要包括聚酯类可降解高分子材料，例如聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸、聚氨酯等。此外还包括聚四氟乙烯等不可降解的高分子材料。目前临床上使用的硬脑膜替代材料有各自的优缺点。自体筋膜的有点是免疫排斥反应少其组织相容性良好，缺点是不易取材，增加自体损伤。同种异体组织具有正常人体硬脑膜的解剖结构，能够起到一定的支撑作用和保护脑组织的作用，但是来源有限，受伦理道德的限制，且存在潜在病毒感染的风险。异种生物材料是目前临床使用最多的人工硬脑膜材料，优点是材料来源充足，无伦理限制，有良好的致密性。缺点是在去除异种蛋白抗原时可能存在有机溶剂等有毒物质的残留，并具有潜在的异物反应可能。人工合成材料的优点是制作方便，价格低廉，缺点是有发生排斥反应的可能，易导致无菌性炎症的发生形成肉芽肿等。
目前脑膜损伤修复效果比较理想的是多层人工硬脑膜。这种多层人工硬脑膜可通过分层来达到模拟脑膜生理功能的目的。胶原蛋白是细胞生长的良好基质，有传递细胞化学信号的功能，可促进组织再生。故利用胶原蛋白和高分子材料制备多层生物膜可汲取各自优点，具有广泛的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本申请提供了一种多层生物膜，所述生物膜包括疏水层、复合层和胶原层，所述生物膜具有机械性能强，隔离效果显著，应用范围广，有韧性、免疫原性低，降解可控，生物相容性更好，可与缺损处良好贴合，形成屏障，同时蛋白逐渐释放与组织缺损部位，使其效果更持久，促进组织生长效果更佳，广泛应用于五官科、神经外科整形外科。
本申请具体技术方案如下：
1.一种生物膜，其依次包含疏水层、复合层和胶原蛋白层。
2.根据项1所述的生物膜，其中，所述疏水层的孔径为5-18μm，优选为6-10μm，进一步优选为5-8μm。
3.根据项1或2所述的生物膜，其中，形成所述疏水层的材料为可降解疏水性高分子材料，优选选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚对二氧环己酮、DL-乳酸、二氧环己酮和聚原酸酯中的一种或两种以上，优选为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯。
4.根据项1-3中任一项所述的生物膜，其中，形成所述复合层的材料包括亲水性高分子材料和第一胶原蛋白；
优选地，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上，优选为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠；
优选地，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白。
优选地，所述亲水性高分子材料与第一胶原蛋白的质量比为25:1-15，优选25:5-15，进一步优选为25:5-12。
5.根据项1-4中任一项所述的生物膜，其中，所述复合层的孔径为40-400μm，优选为50-250μm，进一步优选为50-150μm。
6.根据项1-5中任一项所述的生物膜，其中，形成所述胶原蛋白层的材料为第二胶原蛋白，优选地，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白或明胶。
7.根据项1-6中任一项所述的生物膜，其中，所述疏水层、复合层和胶原蛋白层通过热压连接，优选地，热压的温度为50-300℃，优选为100-250℃，进一步优选为150-250℃。
8.一种制备生物膜的方法，其包括：
将可降解疏水性高分子材料进行静电纺丝得到疏水层；
将亲水性高分子材料和第一胶原蛋白进行静电纺丝得到复合层；
将第二胶原蛋白进行交联得到胶原蛋白层；
将疏水层、复合层和胶原蛋白层依次进行热压得到生物膜。
9.根据项8所述的方法，其中，所述可降解疏水性高分子材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚对二氧环己酮、DL-乳酸、二氧环己酮和聚原酸酯中的一种或两种以上，优选为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯。
10.根据项8或9所述的方法，其中，所述亲水性高分子材料和所述第一胶原蛋白的质量比为25:1-15，优选25:5-15，进一步优选为25:5-12；
优选地，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上，优选为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠；
优选地，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白。
11.根据项8-10中任一项所述的方法，其中，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白或明胶。
12.根据项8-11中任一项所述的方法，其中，所述交联为物理方式交联和/或加入交联剂进行交联，优选地，所述物理方式交联为高温交联、紫外照射交联、光交联或γ射线辐照交联，优选为高温交联或γ射线辐照交联；
优选地，所述交联剂为戊二醛、碳二亚胺、京尼平或N-羟基硫代琥珀酰亚胺，优选为碳二亚胺或戊二醛。
13.根据项8-12中任一项所述的方法，其中，热压的温度为50-300℃，优选为100-250℃，进一步优选为150-250℃。
14.根据项8-13中任一项所述的方法，其中，所述疏水层的孔径为5-18μm，优选为6-10μm，进一步优选为5-8μm；
优选地，所述复合层的孔径为40-400μm，优选为50-250μm，进一步优选为50-150μm。
15.项1-7中任一项所述的生物膜或者项8-14中任一项所述的方法制备得到的生物膜在神经外科、五官科或整形外科领域中的应用，优选在五官科领域中的应用。
发明的效果
本申请所述的多层生物膜疏水层孔径致密，隔离效果良好。复合层和胶原蛋白层中的胶原蛋白可逐渐释放，使其作用时间更加长，促进缺损处生长效果更好。本申请所述的多层生物膜韧性良好，应用范围广泛，可应用于五官科医学领域、神经外科或整形外科等。
附图说明
图1是在实施例1所述的生物膜上的小鼠胚胎成纤维细胞生长情况示意图。
图2是在实施例2所述的生物膜上的小鼠胚胎成纤维细胞生长情况示意图。
图3是在实施例17所述的生物膜上的小鼠胚胎成纤维细胞生长情况示意图。
具体实施方式
下面结合所描述的实施方式对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种生物膜，所述生物膜依次包含疏水层、复合层和胶原蛋白层。
本申请所述的生物膜由于含有疏水层、复合层和胶原蛋白层，所述疏水层具有良好的隔离能力和抗降解能力，所述胶原蛋白层生物相容性好，可快速降解并在植入初期发挥促进毛细血管增生、组织再生、加速缺损处生长及主动诱导分化的作用，且具有良好的贴附性，所述复合层可有效控制胶原蛋白的释放，延长胶原蛋白对组织的良好效果，释放蛋白后形成的三维网状结构为具有良好的生物相容性，有利于细胞攀附，为其生产提供支架，更有利于组织缺损处的愈合。
在一些实施方式中，所述生物膜依次由疏水层、复合层和胶原蛋白层构成。
在一些实施方式中，所述疏水层的孔径为5-18μm，优选为6-10μm，进一步优选为5-8μm。
在本申请中，对于疏水层的孔径的测定方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行测定，例如可以采用扫描电镜进行检测得到。
例如，所述疏水层的孔径可以为5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm等。
本申请通过将疏水层的孔径控制在上述范围内，可以保证血液和组织液通过，使得缺损部位的营养和血液与外界发生交换，而周围组织例如结缔细胞、上皮细胞则不能通过，可以起到良好的隔离作用。
在一些实施方式中，形成所述疏水层的材料为可降解疏水性高分子材料，优选选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚对二氧环己酮、DL-乳酸、二氧环己酮和聚原酸酯中的一种或两种以上，优选为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯。
本申请所述的疏水层由可降解疏水性高分子材料制备得到，具有良好的隔离效果和抗降解能力。
在一些实施方式中，所述疏水层的长为8-14cm，宽为6-10cm，厚为0.01-0.1cm。
在本申请中，对于疏水层的长宽和厚，可以采用本领域常规的方法进行测定，例如采用游标卡尺进行测量。
例如，所述疏水层的长可以为8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm等；
所述疏水层的宽可以为6cm、7cm、8cm、9cm、10cm等；
所述疏水层的厚可以为0.01cm、0.03cm、0.03cm、0.04cm、0.05cm、0.06cm、0.07cm、0.08cm、0.09cm、0.1cm等。
在一些实施方式中，形成所述复合层的材料包括亲水性高分子材料和第一胶原蛋白，优选地，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上，优选为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠；优选地，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白；优选地，所述重组人源化胶原蛋白为范氏重组人源化胶原蛋白。
优选地，所述亲水性高分子材料与所述第一胶原蛋白的质量比为25:1-15，优选为25:5-15，进一步优选为25:5-12。
所述范氏重组人源化胶原蛋白是中国西北大学的范代娣教授发明的，其是中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1所述的重组胶原蛋白，具有三链、三螺旋结构，可以采用例如该中国专利申请公开CN1371919A中公开的基因工程表达方法来制备。
所述的复合层通过亲水性高分子材料和第一胶原蛋白制备得到，可有效控制胶原蛋白的释放，延长胶原蛋白对组织的良好效果，释放蛋白后形成的三维网状结构为具有良好的生物相容性，有利于细胞攀附，为其生产提供支架，更有利于组织缺损处的愈合。
例如，所述亲水性高分子材料与所述第一胶原蛋白的质量比(m亲水性高分子材料:m范氏重组人源化胶原蛋白)可以为25:1、25:2、25:3、25:4、25:5、25:6、25:7、25:8、25:9、25:10、25:11、25:12、25:13、25:14、25:15等。
在一些实施方式中，所述复合层的孔径为40-400μm，优选为50-250μm，进一步优选为50-150μm。
在本申请中，对于复合层的孔径的测定方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行测定，例如可以采用扫描电镜进行测定。
例如，所述复合层的孔径可以为40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、300μm、350μm、400μm等。
本申请将所述复合层的孔径设置在上述范围内，可以有效诱导，并且为成纤维细胞的迁入、粘附以及增殖提供了良好的支架。
在一些实施方式中，所述复合层的长为8-14cm，宽为6-10cm，厚为0.01-0.5cm。
例如，所述复合层的长可以为8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm等；
所述复合层的宽可以为6cm、7cm、8cm、9cm、10cm等；
所述复合层的厚可以为0.01cm、0.03cm、0.03cm、0.04cm、0.05cm、0.06cm、0.07cm、0.08cm、0.09cm、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm等。
在本申请中，对于所述复合层的长宽厚的测定方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行测定，例如可以采用游标卡尺测定复合层的长宽高。
在一些实施方式中，形成所述胶原蛋白层的材料为第二胶原蛋白，优选地，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白或明胶。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白层的长为8-14cm，宽为6-10cm，厚为0.01-0.5cm。
例如，所述胶原蛋白层的长可以为8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm等；
所述胶原蛋白层的宽可以为6cm、7cm、8cm、9cm、10cm等；
所述胶原蛋白层的厚可以为0.01cm、0.03cm、0.03cm、0.04cm、0.05cm、0.06cm、0.07cm、0.08cm、0.09cm、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm等。
在本申请中，对于胶原蛋白层的长宽厚的测定方法，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行测定，例如采用游标卡尺对胶原蛋白层的长宽厚进行测定。
在一些实施方式中，所述疏水层、复合层和胶原蛋白层通过热压连接，优选地，热压的温度为50-300℃，优选为100-250℃，进一步优选为150-250℃。
例如，热压的温度可以为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃、220℃、230℃、240℃、250℃、300℃等。
在本申请中，对于热压的方法，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行热压，例如，可以采用热压机进行热压。
本申请所述的生物膜的长为8-14cm，宽为6-10cm，厚为0.05-0.5cm。
例如，本申请所述的生物膜的长可以为8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm等；
所述生物膜的宽可以为6cm、7cm、8cm、9cm、10cm等；
所述生物膜的厚可以为0.01cm、0.03cm、0.03cm、0.04cm、0.05cm、0.06cm、0.07cm、0.08cm、0.09cm、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm等。
在本申请中，对于生物膜的长宽厚的测定方法，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行测定，例如采用游标卡尺对生物膜的长宽厚进行测定。
在一些实施方式中，所述生物膜依次包含疏水层、复合层和胶原蛋白层。在一些实施方式中，所述疏水层的孔径为5-18μm，优选为6-10μm，进一步优选为5-8μm。在一些实施方式中，形成所述疏水层的材料为可降解疏水性高分子材料，优选选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚对二氧环己酮、DL-乳酸、二氧环己酮和聚原酸酯中的一种或两种以上，优选为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯。在一些实施方式中，形成所述复合层的材料包括亲水性高分子材料和第一胶原蛋白，优选地，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上，优选为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠；所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白；优选地，所述亲水性高分子材料与所述第一胶原蛋白的质量比为25:1-15，优选25:5-15，进一步优选为25:5-12。在一些实施方式中，所述复合层的孔径为40-400μm，优选为50-250μm，进一步优选为50-150μm。在一些实施方式中，形成所述胶原蛋白层的材料为第二胶原蛋白，优选地，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白或明胶。在一些实施方式中，所述疏水层、复合层和胶原蛋白层通过热压连接，优选地，热压的温度为50-300℃，优选为100-250℃，进一步优选为150-250℃。
本申请所述的生物膜具有较好的拉伸强度和较好的断裂伸长率，说明本申请所述的生物膜具有较强的韧性，可以应用于不同的组织部分，发挥其隔离/促进组织增长的作用。
本申请提供了一种制备生物膜的方法，其包括：
将可降解疏水性高分子材料进行静电纺丝得到疏水层；
将亲水性高分子材料和第一胶原蛋白进行静电纺丝得到复合层；
将第二胶原蛋白进行交联得到胶原蛋白层；
将疏水层、复合层和胶原蛋白层依次进行热压得到生物膜。
在本申请中，对于静电纺丝的方法，其是采用本领域常规的方法进行。
在一些实施方式中，将可降解疏水性高分子材料溶解得到第一纺丝液，接着进行静电纺丝得到疏水层，优选地，所述第一纺丝液的浓度为5-20％，优选为10-20％。
例如，所述第一纺丝液的浓度可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％等。
在本申请中，所述第一纺丝液的浓度指的是第一纺丝液的固含量。
在一些实施方式中，将亲水性高分子材料和第一胶原蛋白进行溶解得到第二纺丝液，接着进行静电纺丝得到复合层，优选地，所述第二纺丝液的浓度为5-15％，优选为5-10％。
例如，所述第二纺丝液的浓度可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％。
在一些实施方式中，将第二胶原蛋白进行溶解得到浓度为5-100mg/ml溶液，接着使用物理方式或者加入交联剂进行交联得到胶原蛋白层。
在本申请中，对于物理方式的交联，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行交联，例如可以采用高温交联、紫外照射交联、光交联或γ射线辐照交联，优选为高温交联或γ射线辐照交联。
在本申请中，对于交联剂，本申请不作任何限制，其可以使用本领域常用的交联剂，例如可以采用戊二醛、碳二亚胺、京尼平或N-羟基硫代琥珀酰亚胺，优选为碳二亚胺或戊二醛。
在一些实施方式中，所述可降解疏水性高分子材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚对二氧环己酮、DL-乳酸、二氧环己酮和聚原酸酯中的一种或两种以上，优选为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯。在一些实施方式中，所述亲水性高分子材料和第一胶原蛋白的质量比为25:1-15，优选25:5-15，进一步优选为25:5-12；优选地，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上，优选为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠，优选地，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白。在一些实施方式中，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白，优选为重组人源化胶原蛋白或明胶。在一些实施方式中，所述疏水层的孔径为5-18μm，优选为6-10μm，进一步优选为5-8μm；优选地，所述复合层的孔径为40-400μm，优选为50-250μm，进一步优选为50-150μm。在一些实施方式中，热压的温度为50-300℃，优选为100-250℃，进一步优选为150-250℃。
本申请提供了上述所述的生物膜或者上述所述的方法制备得到的生物膜在在神经外科、五官科或整形外科领域中的应用，优选在五官科领域中的应用。
本申请所述的生物具有较好的机械性能，并且具有良好的生物相容性，能够促进细胞和增殖。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1多层生物膜的制备
疏水层的制备：称取聚乙醇酸加入苯酚中，并进行加热配制成浓度为15％的第一纺丝液，搅拌均匀，电纺丝参数为流速为1ml/h，电压15kV，接受距离20cm，静电纺丝4h得到疏水层。
复合层的制备：按照海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵＝25:6的比例加入水中配制成浓度为10％的第二纺丝液，电纺丝参数与制备疏水层的静电纺丝参数相同，静电纺丝3h得到复合层。
胶原蛋白层制备：将范氏重组胶原蛋白加入水中配制浓度为4％的范氏重组胶原蛋白溶液，冷冻干燥成固体后利用加热方式完成交联得到胶原蛋白层。
按照从上到下的顺序将疏水层、复合层、胶原蛋白层依次进行叠加，利用热压机在150℃下热压1min组装成膜。
实施例2多层生物膜的制备
疏水层的制备：分别称取聚乙醇酸与聚乳酸配以1:1的质量比例加入苯酚中，并进行加热制成总浓度为12％的第一纺丝液，搅拌均匀，电纺丝参数为流速为0.8ml/h，电压13kV，接受距离15cm，静电纺丝4h，得到疏水层。
复合层的制备：按照羧甲基纤维素钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵＝25:6的比例加入水中配制成浓度为15％的第二纺丝液，搅拌均匀，电纺丝参数为流速为1.1ml/h，电压15kV，接受距离20cm，静电纺丝4h得到复合层。
胶原蛋白层制备：将明胶加入水中配制浓度为2％的明胶溶液，冷冻干燥成固体后利用加热方式完成交联得到胶原蛋白层。
按照从上到下的顺序将疏水层、复合层、胶原蛋白层依次进行叠加，利用热压机在180℃下热压1min组装成膜。
实施例3多层生物膜的制备
实施例3和实施例1的区别在于，实施例3所述的疏水层材料采用聚原酸酯制备得到的多层生物膜。
实施例4多层生物膜的制备
实施例4和实施例1的区别在于，实施例4所述的疏水层材料采用聚乳酸制备得到的多层生物膜。
实施例5多层生物膜的制备
实施例5和实施例1的区别在于，实施例5所述的疏水层材料采用聚己内酯制备得到的多层生物膜。
实施例6多层生物膜的制备
实施例6和实施例1的区别在于，实施例6形成复合层的材料中海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵的质量比＝25:15，制备得到的多层生物膜。
实施例7多层生物膜的制备
实施例7和实施例1的区别在于，实施例7形成复合层的材料中海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵的质量比＝25:12，制备得到的多层生物膜。
实施例8多层生物膜的制备
实施例8和实施例1的区别在于，实施例8形成复合层的材料中海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵的质量比＝25:1，制备得到的多层生物膜。
实施例9多层生物膜的制备
实施例9和实施例1的区别在于，实施例9所述的复合层材料采用聚乙烯醇和范氏重组人源化胶原蛋白海绵制备得到的多层生物膜。
实施例10多层生物膜的制备
实施例10和实施例1的区别在于，实施例10所述的复合层材料采用羧甲基纤维素钠和范氏重组人源化胶原蛋白海绵制备得到的多层生物膜。
实施例11多层生物膜的制备
实施例11和实施例1的区别在于，实施例11所述的复合层材料采用聚乙烯吡咯烷酮和范氏重组人源化胶原蛋白海绵制备得到的多层生物膜。
实施例12多层生物膜的制备
实施例12和实施例1的区别在于，实施例12所述的疏水层材料中第一纺丝液的浓度为20％，制备得到的多层生物膜。
实施例13多层生物膜的制备
实施例13和实施例1的区别在于，实施例13所述的疏水层材料中第一纺丝液的浓度为10％，制备得到的多层生物膜。
实施例14多层生物膜的制备
实施例14和实施例1的区别在于，实施例14所述的疏水层材料中第一纺丝液的浓度为5％，制备得到的多层生物膜。
实施例15多层生物膜的制备
实施例15和实施例1的区别在于，实施例15所述的复合层材料中第二纺丝液的浓度为15％，制备得到的多层生物膜。
实施例16多层生物膜的制备
实施例16和实施例1的区别在于，实施例15所述的复合层材料中第二纺丝液的浓度为5％，制备得到的多层生物膜。
实施例17多层生物膜的制备
疏水层的制备：称取聚乙醇酸配制成总浓度为2％的第一纺丝液，搅拌均匀，电纺丝参数为流速为1ml/h，电压15kV，接受距离20cm，静电纺丝4h得到疏水层。
复合层的制备：按照海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵＝25:20的比例配制成浓度为4％的第二纺丝液，搅拌均匀，静电纺丝参数与制备疏水层的静电纺丝参数相同，得到复合层。
胶原层制备：配制浓度为4％的范氏重组胶原蛋白溶液，冷冻干燥成固体后利用加热方式完成交联。
按照从上到下的顺序将疏水层、复合层、胶原蛋白层依次进行叠加，利用热压机在270℃下热压1min组装成膜。
实施例18多层生物膜的制备
实施例18和实施例1的区别在于，实施例18所述的疏水层材料中第一纺丝液的浓度为25％，制备得到的多层生物膜。
实施例19多层生物膜的制备
实施例19和实施例1的区别在于，实施例19所述的复合层层材料中第二纺丝液的浓度为20％，制备得到的多层生物膜。
实施例20多层生物膜的制备
实施例20和实施例1的区别在于，实施例20所述的复合层层材料海藻酸钠：范氏重组人源化胶原蛋白海绵的质量比为25:0.5，制备得到的多层生物膜。
表1实施例和对比例的用量表
实验例1多层膜产品孔径和厚度的测定
将实施例1-20所制备得到的多层生物膜，利用扫描电镜、游标卡尺对各层厚度及孔径进行检测，其结果如表2所示。
表2多层生物膜产品孔径及厚度测定结果
由表1可以看出疏水层的孔径均较小，这保证了血液和组织液可以通过，使得缺损部位的营养和血液与外界发生交换，周围组织如结缔细胞、上皮细胞因其直径较大而不能通过，可以起到良好的隔离作用。控制复合层的孔径在40-400μm之间可有效诱导并为成纤维细胞的迁入、粘附、增殖提供了良好的支架。
实验例2拉伸强度和断裂伸长率的测定
将实施例1-20制备得到的多层生物膜膜裁成20mm×5mm，具有一定厚度的样品，用数显卡尺测量样品的宽度、厚度和标距。使用电子拉力机测试，设置拉伸速率为10mm/min，得到样品的拉伸强度和断裂伸长率。平行测试五次，结果取平均值，其结果如表3所示。
表3多层生物膜产品力学性能测定结果
| 拉伸强度(MPa) | 断裂伸长率(％) | |
| 实施例1 | 10.02±0.04 | 88.64±0.37 |
| 实施例2 | 8.79±0.06 | 76.75±0.29 |
| 实施例3 | 9.45±0.03 | 73.33±0.34 |
| 实施例4 | 10.19±0.07 | 81.92±0.31 |
| 实施例5 | 7.24±0.63 | 70.35±0.72 |
| 实施例6 | 8.22±0.41 | 50.31±0.34 |
| 实施例7 | 8.24±0.23 | 80.37±0.25 |
| 实施例8 | 5.30±0.72 | 53.25±0.14 |
| 实施例9 | 11.26±0.61 | 77.37±0.94 |
| 实施例10 | 7.29±0.44 | 61.23±0.42 |
| 实施例11 | 6.27±0.25 | 70.26±0.86 |
| 实施例12 | 9.48±0.35 | 80.19±0.48 |
| 实施例13 | 11.26±0.73 | 90.32±0.36 |
| 实施例14 | 7.53±0.31 | 49.31±0.72 |
| 实施例15 | 6.26±0.63 | 53.92±0.14 |
| 实施例16 | 7.62±0.88 | 82.81±0.12 |
| 实施例17 | 3.24±0.03 | 10.52±0.18 |
| 实施例18 | 5.22±0.21 | 5.13±0.82 |
| 实施例19 | 4.41±0.36 | 6.23±0.34 |
| 实施例20 | 6.31±0.22 | 2.84±0.61 |
由表3可知，本发明制备的多层生物膜具有较强的韧性，可广泛应用于不同组织部位，发挥其隔离/促进组织增长的作用。
实验例3细胞毒性评价
使用从瑞士小鼠胚胎中分离得到的成纤维细胞，采用CCK-8法评估多层生物膜的细胞毒性。通过计算细胞相对增值率(RGR)对该材料的细胞毒性进行评价，其结果如表4所示。
表4 CCK-8法检测多层生物膜细胞毒性
根据ISO10993细胞毒性反应等级，从上表可以看出，实施例所示的生物膜对小鼠胚胎成纤维细胞没有毒性，均评级为0级或1级，即合格、无细胞毒性。这说明本申请得到的多层生物膜具有良好的生物相容性。
实验例4生物膜对细胞的生长的影响
在实施例1-2以及实施例17制备得到的生物膜上培养瑞士小鼠胚胎成纤维细胞，使用染色剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色，通过荧光显微镜观察，评价细胞在材料上的生长情况，其中，实施例1-2和实施例17的生长情况分别如图1至3所示。
DAPI荧光染料可穿透细胞膜与DNA结合，发出蓝色荧光，其荧光强度与DNA含量成正比，可以反映细胞生长情况(在图1至3中是以白色或灰白色显示)。由图1至3可以看出，纤维细胞在本申请制备的生物膜上生长良好，所述生物膜具备细胞生长、增殖的作用。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (40)
1.一种生物膜，其依次包含疏水层、复合层和胶原蛋白层；
所述疏水层的孔径为6-10μm；
所述复合层的孔径为40-400μm；
形成所述疏水层的材料为可降解疏水性高分子材料，所述可降解疏水性高分子材料为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯；
形成所述复合层的材料包括亲水性高分子材料和第一胶原蛋白；
所述亲水性高分子材料与第一胶原蛋白的质量比为25:1-15。
2.根据权利要求1所述的生物膜，其中，所述疏水层的孔径为6-8μm。
3.根据权利要求1所述的生物膜，其中，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述亲水性高分子材料为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠。
5.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白。
6.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白。
7.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述亲水性高分子材料与第一胶原蛋白的质量比为25:5-15。
8.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述亲水性高分子材料与第一胶原蛋白的质量比为25:5-12。
9.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述复合层的孔径为50-250μm。
10.根据权利要求1所述的生物膜，其中所述复合层的孔径为50-150μm。
11.根据权利要求1所述的生物膜，其中，形成所述胶原蛋白层的材料为第二胶原蛋白。
12.根据权利要求11所述的生物膜，其中所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白。
13.根据权利要求11所述的生物膜，其中所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白或明胶。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的生物膜，其中，所述疏水层、复合层和胶原蛋白层通过热压连接。
15.根据权利要求14所述的生物膜，其中热压的温度为50-300℃。
16.根据权利要求14所述的生物膜，其中热压的温度为100-250℃。
17.根据权利要求14所述的生物膜，其中热压的温度为150-250℃。
18.一种制备生物膜的方法，其包括：
将可降解疏水性高分子材料进行静电纺丝得到疏水层；
将亲水性高分子材料和第一胶原蛋白进行静电纺丝得到复合层；
将第二胶原蛋白进行交联得到胶原蛋白层；
将疏水层、复合层和胶原蛋白层依次进行热压得到生物膜；
其中所述可降解疏水性高分子材料为聚乳酸、聚乙醇酸和/或聚原酸酯；
所述亲水性高分子材料和所述第一胶原蛋白的质量比为25:1-15；
所述疏水层的孔径为6-10μm；
所述复合层的孔径为40-400μm。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述亲水性高分子材料和所述第一胶原蛋白的质量比为25:5-15。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述亲水性高分子材料和所述第一胶原蛋白的质量比为25:5-12。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述亲水性高分子材料选自羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚季胺盐和聚乙二醇中的一种或两种以上。
22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述亲水性高分子材料为聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠。
23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白。
25.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白、明胶或动物源胶原蛋白。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二胶原蛋白为重组人源化胶原蛋白或明胶。
27.根据权利要求18所述的方法，其中，所述交联为物理方式交联和/或加入交联剂进行交联。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述物理方式交联为高温交联或光交联。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述光交联为紫外照射交联或γ射线辐照交联。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述物理方式交联为高温交联或γ射线辐照交联。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述交联剂为戊二醛、碳二亚胺、京尼平或N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述交联剂为碳二亚胺或戊二醛。
33.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，热压的温度为50-300℃。
34.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，热压的温度为100-250℃。
35.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，热压的温度为150-250℃。
36.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，所述疏水层的孔径为6-8μm。
37.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，所述复合层的孔径为50-250μm。
38.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中，所述复合层的孔径为50-150μm。
39.权利要求1-17中任一项所述的生物膜或者权利要求18-38中任一项所述的方法制备得到的生物膜在制备神经外科、五官科或整形外科产品领域中的应用。
40.根据权利要求39所述的应用，其中所述应用为在制备五官科产品领域中的应用。
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