CN115887647A - 一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶及其制备方法。该温敏性黑磷水凝胶具有良好的载药能力和生物相容性,同时还具有促进伤口愈合的能力。本发明所制备的温敏性黑磷水凝胶在低温时为溶胶状态,到达生理温度37℃以上,形成凝胶。当滴到皮肤创伤处,在近红外光的808nm照射下,皮肤表面温度迅速升高,由溶胶向水凝胶转变,达到封闭伤口的目的。本发明的凝胶体系中,黑磷纳米片还负载了药物磺胺嘧啶银,结合黑磷纳米片的光热效应,协同抗菌,促进创口的快速愈合。
Description
技术领域
本发明涉及创口愈合材料技术领域,尤其涉及一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是一种高含水量的具有三维网络结构的软物质,其形态介于固态和液态之间。通常由亲水性高分子或聚合物通过共价键、氢键、范德华作用等交联而成。良好的生物相容性、可预测的降解率、可调节的机械性能和良好的弹性使水凝胶成为生物医学应用的优良材料,也成为了近年来生物医用材料的研究热点。水凝胶具有广泛的生物医学用途。水凝胶作为伤口敷料可以为开放性伤口提供良好的愈合环境。
在伤口修复中,可以作为替代或补充传统闭合技术的水凝胶引起了研究者的广泛兴趣。聚合物水凝胶是三维交联网络,其聚合物骨架中存在亲水性基团(如羟基、醚、胺基或羧基)可以保留大量的水。水凝胶材料具有很多优点,如生物相容性、生物降解性、易于应用、可调节的机械性能、高含水量。水凝胶可以具有可控的组织粘附性,提供伤口愈合的潮湿环境,能够作为细菌渗透的屏障和药物传递的基质。选择本身具有抗菌性能的高分子物质来合成抗菌水凝胶,或者以水凝胶为药物载体,将抗菌药物负载在水凝胶的三维网络中从而制备出具有抗菌性能的伤口辅料也成为了研究热点。水凝胶材料在临床上的应用日益广泛,它的发展为伤口的处理和修复提供了新的选择。
黑磷作为一种新型的二维材料,具有独特的抗菌优势。利用光热效应产生的抗菌活性被认为是治疗细菌感染的另一类安全、有效的方法,近红外光能够穿透哺乳动物细胞深处,对正常细胞的伤害很小。近红外光产生的热量可以抑制细菌的生长,通过过热环境改变细菌细胞膜通透性和信号传输通路进而杀灭细菌。由于在近红外区有光吸收,BP在近红外光源照射下具有较高的光热转换效率,黑磷纳米片在近红外808nm照射下,一方面可以使局部温度升高,产生光热效应,杀死细菌。另一方面,黑磷可以产生ROS(活性氧),已有大量研究表明ROS造成的氧化应激是细菌死亡的主要机制,这些ROS通过破坏细胞膜、细菌的胞内分子如DNA、RNA和蛋白质相互作用等原理杀灭细菌病原体。剥离的BPNs可作为产生单线态氧(1O2)的有效光敏剂,其量子产率约为0.91,因而其在催化和光动力治疗方面具有诱人的应用前景。而目前少有将黑磷与水凝胶结合应用于治疗材料或药物,特别是对促进创口愈合的材料的制备的应用。
发明内容
因此,基于以上背景,本发明一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶及其制备方法,本发明所制备的温敏性黑磷水凝胶具有良好的载药能力和生物相容性,同时还具有显著的促进伤口愈合的能力。为达到此发明目的,本发明技术方案如下:。
一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶,其包括水凝胶体、负载在所述水凝胶体中的黑磷纳米片;
所述黑磷纳米片负载有磺胺嘧啶银。
优选地,所述黑磷纳米片经聚乙二醇表面修饰。
优选地,所述水凝胶体由质量浓度为6%的壳聚糖溶液、质量浓度为56%的β-甘油磷酸钠溶液、浓度为0.1g/ml的羟丙纤维素溶液制成;
所述壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素溶液的体积比为6:2:2。
优选地,所述黑磷纳米片粒径为200~300nm,分散性指数为0.35。
优选地,其包括如下步骤:
S1:聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液的制备;
S2:取聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液,往分散液中加入磺胺嘧啶银,得到负载药物的黑磷纳米片溶液;
S3:将壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素混合,然后倒入黑磷纳米片溶液,涡旋,混合均匀,即得到温敏性黑磷水凝胶。
优选的,所述羟丙纤维素采用高取代中粘度(150-400mpas)的羟丙纤维素。
优选地,步骤S1的乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液的制备步骤如下:
1)取黑磷粉末在研钵中充分研磨,将研磨后的黑磷粉末溶解于N-甲基吡咯烷酮中,离心,超纯水洗涤,即可制得黑磷纳米片分散液;
2)取黑磷纳米分散液,加入PEG-NH2溶液;涡旋后,超声使其重新分散后,振摇后,离心除去游离的PEG-NH2,去上清,加超纯水清洗,重复至上清液无明显颜色,所制备得到即为聚乙二醇修饰后的黑磷纳米片分散液。
优选地,所述聚乙二醇修饰后的黑磷纳米片分散液的浓度为1mg/ml;
优选地,所述黑磷纳米片溶液与水凝胶的体积比为1:10。
本发明还提供了上述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶在制备用于创口愈合药物中的应用。
本发明采用壳聚糖和β-甘油磷酸钠形成水凝胶的三维网络结构,加入羟丙纤维素,起到增加粘附性的作用。
壳聚糖含有氨基和羟基,可形成氢键,不溶于水和有机溶剂,壳聚糖溶于酸性溶液中,在酸性溶液中壳聚糖上的碱性氨基能够质子化形成NH3+。β-甘油磷酸钠结构中存在羟基和磷酸根离子,可与壳聚糖的质子化氨基NH3+通过静电引力作用交联,使壳聚糖溶液胶凝化,形成三维凝胶网络。
本发明所制备的温敏性黑磷水凝胶低温时为溶胶状态,到达生理温度37℃以上,形成水凝胶。当滴到皮肤创伤处,在近红外808nm照射下,皮肤表面温度迅速升高,由溶胶向水凝胶转变,封闭伤口。
采取上述技术方案,具有的有益效果如下:
(1)本发明中的黑磷纳米片利用光热效应和光动力效应,产生光热对细菌的破坏,利用光动力效应,可以产生ROS,ROS造成的氧化应激是细菌死亡的主要机制,这些ROS通过破坏细胞膜、细菌的胞内分子如DNA、RNA和蛋白质相互作用等原理杀灭细菌病原体。除此之外,黑磷纳米片与抗菌药物磺胺嘧啶银可以产生协同抗菌的作用。在凝胶体系中,加入负载抗菌药物的磺胺嘧啶银,在波长808nm的照射下,黑磷纳米片的光热效应与抗菌药物的协同的抗菌作用,具有更好的促进伤口愈合的作用。
且在使用过程中,在生理温度下转换成的凝胶,随着其缓慢的降解,负载的药物缓慢释放,可减少用药次数,无刺激性和毒性。且体外实验结果表明,本发明的温敏性黑磷水凝胶可促进伤口创口快速愈合,在创伤治疗方面,有很大的应用前景。
(2)与现有的其他促进伤口的水凝胶相比,除了黑磷的光热和光动力效应外,其负载的磺胺嘧啶银,壳聚糖均具有一定的抗菌性能,且生物相容性好,易于降解,不会对机体各器官产生损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中的BP、BP-PEG-AgSD的TEM图;
图2为本发明实施例中的BP、BP-PEG-NH2、BP-PEG-AgSD的DLS图;
图3为本发明实施例中的Gel的SEM图;
图4为本发明实施例中的CS、β-GP、HPC、Gel四种样品的FITR光谱图;
图5为本发明实施例中的Gel和BP@Gel的生物相容性图;;
图6为本发明实施例中的不同组的伤口愈合情况图;
图7为本发明实施例中的不同组的抗菌性能图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对发明做进一步说明。
实施例1:一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶的制备方法,其包括如下步骤:
S1:聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液的制备;
1)黑磷纳米片的制备
首先称取4mg黑磷粉末在研钵中充分研磨,将研磨后的黑磷粉末溶解于2mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)中,置于超声波清洗仪中超声6h(超声5min,涡旋2min),接着离心30min(2000rpm,4℃)以去除未剥离的大尺寸黑磷并收集上清,取上清置于空离心管中,再离心10min(13000rpm,4℃),加入1mL的超纯水,将制备出来的黑磷纳米片溶液(BP溶液)用锡箔纸包封,溶液储存在4℃以下。
2)黑磷纳米片的聚乙二醇修饰
取BP溶液1.0mL,13000rpm离心20min,去上清,加入1mL纯水,13000rpm离心10min(重复至上清液无明显颜色)后,加入10倍黑磷纳米片浓度的PEG-NH2溶液,涡旋5min,超声30min使其重新分散后,放入摇床,振摇(转速300rpm,温度10℃)48h,振摇结束后,以10000rpm的转速离心10min除去游离的PEG-NH2,去上清,加超纯水清洗,重复至上清液无明显颜色,所得BP-PEG-NSs(聚乙二醇修饰的黑磷纳米)悬浮于PBS中,即为聚乙二醇修饰后的黑磷纳米片分散液。
S2:取聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液,往分散液中加入磺胺嘧啶银,得到负载药物的黑磷纳米片溶液;
取聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液,以10000rpm的转速离心10min,去上清,然后加入10倍黑磷纳米片浓度的磺胺嘧啶银溶液,在控温摇床上避光振摇(转速300rpm,温度10℃)12h后,以10000rpm的转速离心除去游离的磺胺嘧啶银,保留上清液,沉淀为BP-PEG-AgSD,在PBS中悬浮,即为负载药物的黑磷纳米片溶液,在4℃下保存。
S3:将壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素混合,然后倒入黑磷纳米片溶液,涡旋,混合均匀,即得到温敏性黑磷水凝胶。
1)乙酸溶液的配制:
移液枪量取857μl、冰乙酸溶液至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容,得到0.15mol·L-1的乙酸溶液。
2)壳聚糖溶液的配制:
取600mg CS溶于9mL冰乙酸(0.15M)中配成6%(W/V)的CS溶液,缓慢滴加,磁力搅拌5~6h(随着浓度升高,所需搅拌时间延长),溶解完全后高温高压灭菌30min。
3)β-甘油磷酸钠溶液的配制:
将560mgβ-GP溶于1mL超纯水中,配成56%(W/V)的β-GP溶液,用0.22μm滤器过滤除菌,4℃冰箱保存。
4)羟丙纤维素溶液:
将2.5g羟丙纤维素加入到25mL 60℃的超纯水中,磁力搅拌直至完全溶解,以制备浓度为0.1g/mL的羟丙纤维素溶液(LHPC),储存在4℃下。
5)温敏性水凝胶制备:
将壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素溶液按照体积比6:2:2配制,黑磷纳米片与水凝胶体积比为1:10混合,在冰浴条件下制备,溶液混合和搅拌一段时间,直到完全混合,即得到温敏性黑磷水凝胶,然后,混合的溶液存储在4℃以下。
实施例2:黑磷纳米片(BP)、负载药物(磺胺嘧啶银)的黑磷纳米片(BP-PEG-AgSD)、温敏性黑磷水凝胶(Gel、CS/β-GP/HPC)的表征及其生物相容性。
1)黑磷纳米片、负载药物的黑磷纳米片的TEM表征
观察样品的微观形貌采用场发射透射电子显微镜进行观察,加速电压为200kV。
样品的制备:将样品超声分散于乙醇中,稀释至一定浓度后,取一滴滴入负载碳膜的铜网上,室温下干燥,场发射透射电镜观察。
结果见图1,A图为黑磷纳米片透射电镜图,粒径约为220nm;B图为黑磷纳米片载药透射电镜图,可以清晰看见黑磷纳米片上有黑色的小圆点颗粒。
2)黑磷纳米片、负载药物的黑磷纳米片的DLS表征
采用Zeta电位分析仪测定纳米粒Zeta电位,设定测量温度为25℃。取适量纳米粒于电位池中,根据上述测定条件测定样品的Zeta电位。
如图2所示,A图和B图分别为BP(黑磷纳米片)、BP-PEG-NH2(聚乙二醇修饰的黑磷纳米片)、BP-PEG-AgSD(负载药物的黑磷纳米片)的粒径和电位图,说明黑磷纳米片已成功负载药物磺胺嘧啶银。
3)温敏性黑磷水凝胶的SEM表征
将CS/β-GP/HPC(温敏性黑磷水凝胶)样品放入液氮中冷冻固定,然后进行冷冻干燥,将水分除去后,进行导电性喷涂。
如图3所示,A图为温敏性水凝胶扫描电镜图,B图为放大倍数后的扫描电镜图。由图可知,水凝胶有很多大小不一的孔洞。
4)温敏性黑磷水凝胶的FI-TR图谱
将纯化CS(壳聚糖),β-GP(β-甘油磷酸钠)、HPC(羟丙纤维素)粉末和冻干后的CS/β-GP/HPC样品与KBr干粉压片,用傅里叶变换红外光谱仪测定样品的红外光谱,扫描波数范围为4000-400cm-1,分辨率4cm-1。
如图4所示,CS/β-GP/HPC形成水凝胶后,峰值发生相应的改变。β-GP溶液加入到CS溶液中,可中和CS的酸性溶液,进而形成复合物。
5)生物相容性
水凝胶浸提液的制备:将灭菌后的试验样品按照样品质量/溶液体积比为0.1g/mL的比例分别浸泡于完全培养基的15mL离心管中,于37±0.5℃无菌培养箱中培养24h。
CCK-8法:打开水浴锅,调整温度为37℃。取出-80℃冻存的NIH3T3细胞,将细胞快速置于水浴锅中,并且快速晃动,待细胞完全融化后,将冻存管从水浴锅中取出。取1支15ml无菌离心管,加入7ml培养基,然后加入冻存管中的细胞;室温下1000rpm,离心5min;取一个新的25T细胞培养瓶,加入5ml含10%FBS的DMEM培养基;将离心管中的上清弃去,留下沉淀,全部加入到培养瓶中;7.5%CO2,37℃条件下,静置8h,然后吸走全部培养基,加入5ml新鲜的含10%FBS的培养基,继续培养。等到细胞长满培养瓶即可进行实验。
如图5所示,A图、B图和C图为不加黑磷载药的水凝胶(Gel)24h、48h和72h的细胞活性,D图、E图和F图为加黑磷载药的水凝胶(BP@Gel)24h、48h和72h的细胞活性。采用NIH3T3细胞,样品与细胞共培养不同的时间点,检测细胞活性,选取了5%、10%、25%、40%、55%、70%、85%和100%水凝胶浸提液,测得结果均大于85%,说明温敏性黑磷水凝胶的生物相容性好。
实施例3:伤口愈合的评估
(1)实验动物的分组及处理
①动物饲养环境:
屏障等级:SPF级;
温度:23±2℃;相对湿度:50±10%;
环境噪声:≤60dB;
提供充足的饲养饲料和饮用水。
②实验动物分组:48只6周年龄SD雄性大鼠,平均分为4个组,包括模型组(control,n=12),光照组(NIR,n=12),黑磷水凝胶组(BP@Gel,n=12)和黑磷水凝胶光照组(BP@Gel+NIR,n=12)。
由于空白对照组(不造模的健康鼠)一般用于判断造模是否成功,而本次实验为大鼠皮肤全皮层创伤模型,成功率较高,故不需设定空白对照组。模型组给予生理盐水,饲养期间每日观察大鼠的健康状况并记录体重变化。
③全皮层切除模型的建立:待动物实验新环境7天后,随后进行动物模型的建立。禁食12~16h,腹腔注射10%的水合氯醛溶液麻醉大鼠,注射量按照0.3ml/g进行。用家用宠物电动剃毛器去除大鼠背部的毛发,生理盐水擦拭皮肤,碘伏溶液消毒。用一次性医用打孔活检器(1cm)制作全皮层圆形切除伤口,造模当天视为第0天,同时拍摄创面进行记录。打孔后,第一时间给所有不同组的大鼠进行处理,,然后置于干净的鼠笼中任其自行恢复,单笼饲养,防止大鼠之间互相撕咬皮肤。造模后的第一天起,每日于上午10﹕00对大鼠进行涂凝胶,涂凝胶时和局部照射伤口时尽量不要拉扯伤口部位,造成二次伤害。分批次于造模后第3、7、14天进行创面拍摄和取样。
(2)大鼠伤口愈合率
创面愈合率:
治疗后3天、7天和14天,采用数码照相机对创面进行拍照,直角尺对照记录。用Photoshop2020和Image-Pro Plus6.0软件计算大鼠创面面积来计算愈合率,统计大鼠创面愈合时间,即创面形成至结痂完全愈合的时间。计算公式为
式中:A0,原始伤口面积,cm2;A,现存伤口面积,cm2。
如图6所示,分为四个组,control组,NIR组,BP@Gel组和BP@Gel+NIR组,由图可知,相比较其它组,BP@Gel+NIR组可更快地促进伤口愈合。
(3)温敏性黑磷水凝胶的抗菌性能
采用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌,并在Luria–Bertani(LB)培养基中以180rpm的转速在37℃下培养24h。当细菌浓度达到108CFU/mL(OD600=0.1),以3000g的转速离心细菌悬浮液,用液体培养基稀释,并重新悬浮在含有BP@GEL水凝胶。孵育2h后,梯度稀释为103CFU/mL用功率为1w/cm2的808nm激光照射混合物持续0、3、5和10min。连续稀释细菌悬浮液,并将每个样品的100μL添加到LB琼脂平板中,并在37℃下培养24小时,用数码照相机拍摄不同组平板菌落生长情况。
如图7所示,BP@Gel+NIR组在照射10min时,相比较其它组,抑菌效果最好,说明该水凝胶具有抗菌性能。
以上对本发明及其实施方式进行了描述,这种描述没有限制性,附图中所示的也只是本发明的实施方式之一,实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示,在不脱离本发明创造宗旨的情况下,不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例,均应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶,其特征在于,其包括水凝胶体、负载在所述水凝胶体中的黑磷纳米片;
所述黑磷纳米片负载有磺胺嘧啶银。
2.根据权利要求1所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶,其特征在于,所述黑磷纳米片经聚乙二醇表面修饰。
3.根据权利要求1所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶,其特征在于,所述水凝胶体由质量浓度为6%的壳聚糖溶液、质量浓度为56%的β-甘油磷酸钠溶液、浓度为0.1g/ml的羟丙纤维素溶液制成;
所述壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素溶液的体积比6:2:2。
4.根据权利要求3所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶,其特征在于,所述黑磷纳米片粒径为200~300nm,分散性指数为0.35。
5.权利要求1至4任一项所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶的制备方法,其特征在于,
其包括如下步骤:
S1:聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液的制备;
S2:取聚乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液,往分散液中加入磺胺嘧啶银,得到负载药物的黑磷纳米片溶液;
S3:将壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、羟丙纤维素混合,然后倒入黑磷纳米片溶液,涡旋,混合均匀,即得到温敏性黑磷水凝胶。
6.根据权利要求5所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤S1的乙二醇修饰的黑磷纳米片分散液的制备步骤如下:
1)取黑磷粉末在研钵中充分研磨,将研磨后的黑磷粉末溶解于N-甲基吡咯烷酮中,离心,超纯水洗涤,即可制得黑磷纳米片分散液;
2)取黑磷纳米分散液,加入PEG-NH2溶液;涡旋后,超声使其重新分散后,振摇后,离心除去游离的PEG-NH2,去上清,加超纯水清洗,重复至上清液无明显颜色,所制备得到即为聚乙二醇修饰后的黑磷纳米片分散液。
7.根据权利要求6所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶的制备方法,其特征在于,所述聚乙二醇修饰后的黑磷纳米片分散液的浓度为1mg/ml。
8.权利要求1至7任一项所述的一种用于促进创口愈合的温敏性黑磷水凝胶在制备用于创口愈合药物中的应用。
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